Функционирование фотосинтетического аппарата микроводоросли Haematococcus pluvialis (Chlorophyceae) при переходе в состояние гематоцисты. Чеканов Константин Александрович

Содержание к диссертации

Введение

2. Обзор литературы 11

2.1. Микроводоросль Haematococcus pluvialis – продуцент природного астаксантина 11

2.1.1. Систематическое положение 11

2.1.2. Пигментный состав и запасные вещества 12

2.1.3. Морфология, ультраструктура и жизненный цикл. Жгутиковые стадии 12

2.1.4. Покровы. Клеточная стенка 13

2.1.5. Экология и распространение 14

2.2. Структура и свойства молекулы астаксантина 15

2.3. Распространение астаксантина в природе 20

2.3.1. Астаксантин в организме животных 20

2.3.2. Астаксантин у растений 24

2.3.3. Астаксантин у микроорганизмов 24

2.4. Применение астаксантина 27

2.4.1. Значение астаксантина для деятельности человека — использование в лекарственных и косметических средствах 27

2.4.2. Аквакультура, корм для животных

2.4. Получение астаксантина 29

2.5. Перспективы использования микроводорослей для получения астаксантина

2.5.1. Мировой рынок астаксантина 31

2.5.2. Этапы получения астаксантина из микроводоролей 32

2.5.3. Двухфазное культивирование 36

2.5.4. Основные затраты, связанные с получением природного пигмента 37

2.6. Основные процессы, происходящие в клетках Haematococcus pluvialis при формировании гематоцист 38

2.6.1. Изменение морфологии и ультраструктуры 38

2.6.2. Физиолого-биохимические изменения 39

2.6.3. Синтез астаксантина

2.6.3.1. Изопентенилпирофосфат – универсальный предшественник изопреноидных соединений 41

2.6.3.2. Сборка углеродного скелета: синтез фитоина 51

2.6.3.3. Образование -сопряженной системы: синтез ликопина 54

2.6.3.4. Циклизация 56

2.6.3.5. Транспорт в цитозоль 58

2.6.3.6. Присоединение атомов кислорода: образование ксантофиллов 60

2.6.3.7. Эстерификация и депонирование в липидных глобулах 2.6.4. Синтез жирных кислот 62

2.6.5. Регуляция синтеза астаксантина и его возможная физиологическая роль 64

2.7. Подходы к изучению функционирования фотосинтетического аппарата зеленых водорослей

и механизмов его защиты (на примере кинетики индукции флуоресценции хлорофилла a) 69

3. Материалы и методы 81

3.1. Сбор природных образцов и получение изолята микроводорослей 81

3.2. Штаммы микроводорослей и их культивирование 81

3.3. Определение влияния солености на рост микроводорослей 82

3.4. Индукция синтеза астаксантина 82

3.5. Экстракция пигментов 82

3.6. Определение основных параметров роста культуры 83

3.7. Хроматография

3.7.1. Тонкослойная хроматография 84

3.7.2. Высокоэффективная жидкостная хроматография 84

3.7.3. Газовая хромато-масс-спектрометрия 85

3.8. Микроскопия 85

3.8.1. Светлопольная и флуоресцентная микроскопия 85

3.8.2. Трансмиссионная электронная микроскопия 85

3.8.3. Сканирующая электронная микроскопия 86

3.9. Молекулярная идентификация 86

3.9.1. Выделение ДНК 86

3.9.2. Амплификация фрагмента гена 18S рРНК и сиквенирование 87

3.9.3. Анализ данных 88

3.10. Анализ флуоресценции хлорофилла а 88

3.10.1. Анализ быстрой фазы индукционной кривой флуоресценции хлорофилла а 88

3.10.2. Анализ стационарной фазы индукционной кривой флуоресценции хлорофилла а 89

3.10.3. Анализ спектров флуоресценции хлорофилла а при 77 К

3.11. Элементный анализ 90

3.12. Статистическая обработка результатов 90

4. Результаты и обсуждение 92

4.1. Новый штамм каротиногенной микроводоросли Haematococcus pluvialis BM1 и его

основные биотехнологические характеристики 92

4.1.1. Получение культуры микроводоросли Haematococcus pluvialis BM1 и особенности ее естественной среды обитания 92

4.1.2. Молекулярная идентификация полученного изолята 94

4.1.3. Морфология и ультраструктура клеток Haematococcus pluvialis BM1 на вегетативной стадии культивирования 94

4.1.4. Накопление биомассы культурами Haematococcus pluvialis BM1 на вегетативной стадии культивирования 98

4.1.5. Индукция формирования гематоцист в культуре Haematococcus pluvialis BM1 101

4.1.6. Изменения в пигментном и жирнокислотном составе Haematococcus pluvialis BM1 при формировании гематоцист 103

4.2. Особенности ФСА Haematococcus pluvialis при переходе в состояние гематоцисты 107

4.2.1. Изменение пигментного состава в клетках H. pluvialis в экспериментах по изучению функционирования ФСА 107

4.2.2. Анализ быстрой фазы индукционной кривой флуоресценции хлорофилла a адаптированных к темноте клеток H. pluvialis 109

4.2.3. Анализ стационарной фазы индукционной кривой флуоресценции хлорофилла a в клетках H. pluvialis при адаптации к актиничному свету 113

4.3. Возможные фотозащитные механизмы в вегетативных клетках и гематоцистах H. pluvialis (сравнительная характеристика) 115

4.3.1. Нефотохимическое тушение возбужденных состояний хлорофилла 115

4.3.2. Индукция синтеза астаксантина. Оптическое экранирование 121

4.3.3. Редукция фотосинтетического аппарата и снижение содержания хлорофилла 124

4.3.4. Способность гематоцист к восстановлению фотосинтетической активности 125

4.4. Влияние концентрации CO2 в ГВС на процесс перехода

в состояние гематоцисты клеток H. pluvialis BM1 127

4.4.1. Основные параметры роста культуры H. pluvialis BM1 в зависимости от концентрации СО2 в ГВС 127

4.4.2. Влияние концентрации СО2 в ГВС на фотосинтетический аппарат вегетативных клеток и гематоцист H. pluvialis BM1 132

4.5. Изменение элементного состава клеток H. pluvialis BM1 при переходе в состояние гематоцисты 134

5. Заключение 137

6. Выводы 141

7. Список сокращений и условных обозначений 142

8. Словарь терминов 146

9. Список литературы 150

• Значение астаксантина для деятельности человека — использование в лекарственных и косметических средствах
• Основные процессы, происходящие в клетках Haematococcus pluvialis при формировании гематоцист
• Определение влияния солености на рост микроводорослей
• Изменение пигментного состава в клетках H. pluvialis в экспериментах по изучению функционирования ФСА

Введение к работе

Актуальность. Микроводоросль Haematococcus pluvialis (Chlorophyceae) является основным источником ценного природного пигмента астаксантина [Lorenz, Cysewski, 2000]. Накопление астаксантина в клетках H. pluvialis происходит при действии неблагоприятных условий (свет высокой интенсивности, дефицит минерального питания, экстремальные температуры и уровни солености). При этом ее клетки переходят в состояние гематоцисты, характеризующееся чрезвычайно высокой толерантностью к широкому спектру стрессоров. Гематоцисты резко отличаются от вегетативных клеток H. pluvialis, преобладающих в благоприятных для роста и деления условиях. Формирование гематоцист сопровождается редукцией фотосинтетического аппарата, утолщением клеточной стенки и появлением в цитоплазме липидных включений, содержащих пигмент астаксантин преимущественно в форме эфиров с жирными кислотами. Считается, что гематоцисты являются покоящейся формой H. pluvialis [Kobayashi et al., 1993; Boussiba, 2000]. Однако последние данные [Recht et al., 2014] указывают на то, что формирование гематоцист сопровождается высокой метаболической активностью, а редукция фотосинтетического аппарата не является полной.

Существенно, что H. pluvialis является объектом промышленного культивирования с целью получения астаксантина — красного пигмента из группы кислородсодержащих каротиноидов, ксантофиллов. Натуральный астаксантин применяют при производстве косметических средств, биологически активных добавок и лекарственных препаратов. Характерный красный цвет мяса лососевых рыб, панцирей ракообразных и перьев фламинго обусловлен присутствием астаксантина в их организме, поэтому данный пигмент является важным компонентом рациона животных [Lorenz, Cysewski, 2000].

Процесс биотехнологического получения астаксантина путем т.н. «двухфазного культивирования» включает две стадии [Boussiba, 2000; Aflalo et al., 2007]. На первой происходит культивирование в условиях, благоприятных для роста («вегетативная фаза»), а на второй клетки подвергают воздействию стрессоров для индукции синтеза астаксантина («индукционная фаза»). Культивирование существующих штаммов H. pluvialis в промышленных условиях сталкивается с рядом проблем, таких как низкая скорость роста, низкий выход пигмента (по сравнению с лабораторным культивированием) и уязвимость

перед контаминациями. Поэтому поиск новых штаммов H. pluvialis с лучшими биотехнологическими характеристиками также является важной задачей, а повышение выхода пигмента требует изучения особенностей функционирования клеток H. pluvialis (в частности, ассимиляционных процессов), а также накопления астаксантина.

Практическая значимость H. pluvialis обусловила неизменно высокий интерес к его
биологии с начала 90-х годов прошлого века. Тем не менее, несмотря на то, что
ультраструктура и биохимический состав вегетативных клеток и гематоцист H. pluvialis
изучены достаточно подробно [Boussiba, 2000], о самом процессе перехода между этими
состояниями известно значительно меньше. В частности, слабо изучена динамика
пигментного состава и функционирования фотосинтетического аппарата, особенно в первые
часы, а также при обратном переходе (превращении гематоцист в вегетативные клетки).
Недостаточно исследована и природа механизмов толерантности к действию

неблагоприятных факторов, таких как свет высокой интенсивности, у вегетативных клеток и гематоцист H. pluvialis. Изучению данных вопросов посвящена настоящая работа.

Цель работы: охарактеризовать особенности функционирования ФСА в клетках каротиногенной микроводоросли Haematococcus pluvialis BM1 при их переходе в состояние гематоцисты.

Задачи

1. Охарактеризовать новый штамм микроводоросли Haematococcus pluvialis, обозначенный как BM1, и подтвердить его таксономическую принадлежность.

2. Провести анализ индукционных кривых флуоресценции хлорофилла a на разных стадиях жизненного цикла H. pluvialis: в вегетативных клетках, в гематоцистах и при переходе между ними.

3. Охарактеризовать влияние добавления CO₂ на функционирование фотосинтетического аппарата H. pluvialis, накопление сухого веса и астаксантина этими типами клеток.

4. Исследовать содержание элементного азота и углерода в клетках H. pluvialis на этапе вегетативного культивирования и при индукции перехода в состояние гематоцисты

5. Оценить влияние различных фотозащитных механизмов при вегетативном росте и при индукции образования гематоцист.

Научная новизна

6. Охарактеризован первый штамм микроводоросли H. pluvialis из Белого моря. Показано, что он является эффективным продуцентом натурального астаксантина.

7. Впервые описаны особенности функционирования фотосинтетического аппарата клеток H. pluvialis на разных этапах их перехода в состояние гематоцисты и обратного превращения гематоцист в вегетативные клетки.

8. Впервые описана кинетика квантового выхода регулируемого и нерегулируемого нефотохимического тушения возбужденных состояний хлорофилла в клетках H. pluvialis.

9. Впервые описано влияние повышенных концентраций СО₂ в газовоздушной смеси, используемой для барботирования культуры H. pluvialis на этапе вегетативного культивирования и при индукции перехода в состояние гематоцисты (5%, 10% и 20%), на параметры роста культуры и функционирование фотосинтетического аппарата.

10. Впервые определено содержание элементного азота и углерода в вегетативных клетках H. pluvialis и в гематоцистах. Для гематоцист H. pluvialis BM1 получены самые высокие для водорослей по литературным данным значения соотношения С/N (49,9 моль/моль).

11. Впервые описана картина смены доминирующего типа фотозащитных механизмов при переходе вегетативных клеток в гематоцисты у H. pluvialis; выдвинуты предположения о роли этого процесса в формировании высокой стресс-толерантности этой каротиногенной микроводоросли.

Теоретическая и практическая значимость работы. Получен и охарактеризован новый штамм микроводоросли H. pluvialis BM1, депонированный в коллекцию Института физиологии растений имени К.А. Тимирязева РАН с присвоением идентификатора IPPAS H-2018. Исследована динамика функционирования ФСА и фотозащитных механизмов при переходе вегетативных клеток в метаболически неактивное состояние (состояние гематоцисты) и обратно. Выявлены особенности механизмов стресс-толерантности фотосинтетического аппарата вегетативных клеток, гематоцист и клеток в промежуточных

состояниях. Показано, что исследованная микроводоросль обладает высоким потенциалом для биотехнологического получения астаксантина. Подобраны оптимальные условия обогащения культуры СО₂ при культивировании H. pluvialis BM1, способствующие повышению продуктивности культуры по СВ и содержанию астаксантина.

Полученные данные расширяют представления о механизмах адаптации фототрофных организмов к действию абиотических стрессоров и закладывают основы повышения продуктивности биотехнологического производства астаксантина с использованием H. pluvialis. Результаты работы могут быть использованы в материалах курсов лекций, читаемых на биологическом факультете МГУ («биотехнология микроводорослей», «физиология фототрофных микроорганизмов»).

Методы исследования. Микроводоросли культивировали в 300 мл минеральной среды BG-11 [Stanier et al., 1971] в стеклянных колоннах объемом 400 мл при 25 С и светодиодном освещении (40–120 мкмоль квантов ФАР/м²/с) при продувании атмосферным воздухом либо газо-воздушной смесью с 5, 10 или 20%¹ CO₂ (300 мл/мин). Образование гематоцист индуцировали путем переноса клеток в безазотную среду BG-11₀ [Rippka et al., 1979] либо дистиллированную воду и 10-кратного повышения облученности. Ультраструктуру клеток изучали методами трансмиссионной (на микроскопе Hitachi HU-11F; Hitachi, Япония) и сканирующей (на микроскопе JSM-6380LA; Hitachi, Япония) электронной микроскопии.

Пигментный состав анализировали спектрофотометрически in situ в суспензиях клеток либо в экстрактах из клеток в органических растворителях на спектрофотометре Agilent Cary 300 UV-Vis (AgilentTechnologies, США) с интегрирующей сферой CA-30I того же производителя, а также методами тонкослойной хроматографии на пластинах Silufol (Kavalier, Чехословакия) и высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографе Waters Alliance 2995 c обращённо-фазной колонкой Lichrospher RP C-18 (Merck, Германия) и диодно-матричным детектором Waters e2695 (Waters, США). Жирнокислотный состав липидов клеток анализировали методом газовой хромато-масс-спектрометрии с использованием газового хроматографа Agilent 7890A (Agilent Technologies, Германия) с

¹ Здесь и далее приводится объемная доля CO₂ в газо-воздушной смеси.

масс-селективным детектором Quattro Micro GC (Waters, США) и капиллярной колонкой HP-5MS (30 м 0.25 мм 0.25 мкм) (Agilent, США).

Молекулярную идентификацию исследованного штамма микроводоросли

осуществляли путем анализа последовательности фрагмента гена 18S рРНК.

Функционирование фотосинтетического аппарата клеток H. pluvialis изучали путем анализа индукционных кривых флуоресценции хлорофилла а с использованием импульсно-модулированных флуориметров Fluorpen FP100S (PSI, Чешская Республика) и DUAL-PAM-100 (Heinz Walz, Германия). Содержание элементного углерода и азота в лиофилизированной биомассе определяли при помощи элементного анализатора CNS Vario EL Cube (Elementar, Германия).

Обработка данных проводилась в программе Origin Pro (OriginLab, США). Все измерения проводились в двух биологических и трех аналитических повторностях. Статистическая достоверность основных параметров культивирования (сухого веса, содержание хлорофиллов и каротиноидов, отношение Кар/Хл, число клеток), а также элементного состава оценивалась при помощи стандартных t-критерия и F-критерия (P-0,95). На рисунках и в таблицах приведены средние значения и их стандартные отклонения. Для оценки статистической достоверности параметров, рассчитываемых по интенсивности флуоресценции хлорофилла a, использовался непараметрческий U-тест Манна-Уитни [Baruffo et al., 2008], так как параметры флуоресцентного анализа в общем случае не подчиняются нормальному распределению [Lazr, 2004]. На рисунках представлены усредненные значения. Представляемые измерения признаны статистически достоверными.

Положения, выносимые на защиту

12. Новый штамм микроводоросли BM1 (IPPAS H-2018), принадлежащий к виду Haematococcus pluvialis Flotow (Chlorophyceae), является эффективным продуцентом для биотехнологического получения ценного кетокаротиноида астаксантина.

13. На кинетику вегетативного роста Haematococcus pluvialis влияет наличие источника неорганического углерода (CO₂). Для роста оптимально добавление в газовоздушную смесь 5% CO₂.

3. Переход H. pluvialis в состояние гематоцисты сопровождается резким повышением соотношения С/N, что свидетельствует о высоких адаптивных способностях микроорганизма.

4. Переход клеток H. pluvialis в покоящуюся стадию гематоцисты — сложный процесс, включающий периоды повышения и спада фотосинтетической активности, индукцию и деактивацию различных фотозащитных механизмов.

5. Среди фотозащитных механизмов вегетативных клеток доминируют «активные», такие как регулируемое нефотохимическое тушение возбужденных состояний хлорофилла, в зрелых гематоцистах, богатых астаксантином, — редукция фотосинтетического аппарата и «пассивные» (не требующие постоянных энергозатрат) механизмы, такие как оптическое экранирование. При переходе в состояние гематоцисты активны оба типа механизмов. Апробация работы. Результаты работы доложены на шести конференциях

«Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии

микроорганизмов. Всероссийский симпозиум с международным участием», « », «, изложены в семи статьях; получен патент РФ.

Значение астаксантина для деятельности человека — использование в лекарственных и косметических средствах

Спектральные и фотохимические свойства астаксантина, как и прочих каротиноидов, обусловлены расположением их наиболее низко лежащих энергетических уровней (рис. 1б). Молекула астаксантина поглощает энергию в видимой области (рис. 1б) за счет перехода из основного энергетического состояния в возбужденное путем перехода -электронов на вакантные антисвязывающие -орбитали. В протяженной системе сопряженных связей, характерной для пигмента, степень делокализации -электронов очень высока, что делает разницу между связывающими и антисвязывающими -орбиталями сравнительно низкой (соответствующей энергии света в видимой области); так как система сопряженных связей астаксантина длиннее, чем у большинства каротиноидов (за счет вовлечения в нее -связей кетогрупп), то его максимум поглощения находится сравнительно дальше [Britton, 1995; Young, Frank, 1996]. Главная полоса в спектре поглощения обусловлена переходом из основного состояния 11Аg (S0) на второе возбужденное 11Bu (S2) [Britton, 1995; Truscott, 1990; Young, Frank, 1996]. Его время жизни составляет примерно 0,03 пс [Truscott, 1990]. Переход из нулевого в первое возбужденное состояние (S1) затруднен, так как они оба имеют симметрию Ag. Однако в ряде случаев можно зарегистрировать первый возбужденный уровень путем регистрации спектра флуоресценции (ее квантовый выход составляет около 0,003%) [Truscott, 1990; Young, Frank, 1996]. Также в ультрафиолетовой области происходит поглощение энергии, соответствующее переходам на более высокие уровни. Их вероятность гораздо ниже. Но при образовании в молекуле цис-связей, когда ее симметрия нарушается, поглощение в УФ-диапазоне существенно увеличивается. В результате в спектре поглощения появляется т.н. цис-пик. Тем не менее, основной особенностью астаксантина является наличие максимума поглощения в видимой области (максимум в гексане 478 нм) (рис. 1д) [Britton, 1995]. Спектр поглощения астаксантина несет ценную информацию (в частности, о его содержании в образце и т.д.) однако одних лишь данных о поглощении пигмента в видимой и УФ-области недостаточно для его идентификации. Например, максимум поглощения в сходных по форме спектрах кантаксантина и родоксантина наблюдается при близких длинах волн, что затрудняет идентификацию кетокаротиноидов, особенно при их совместном присутствии. Кроме того, появление в системе различных геометрических изомеров приводит к смещению максимума [Britton, 1995].

Астаксантин, как и прочие каротиноиды, способны участвовать в широком спектре фотохимических реакций, таких как фотоизомеризация, тушение возбужденных состояний поглотивших свет молекул, перехват свободных радикалов [Truscott, 1990; Young, Frank, 1996]. Способность к тушению синглетного кислорода и возбужденных состояний хлорофилла и, по-видимому, к фотоизомеризации обусловлена наличием триплетных энергетических уровней; время жизни низшего из них составляет около 10±5 мкс [Truscott, 1990]. Известно, что тушение 1gO2 астаксантином, как и прочими каротиноидами, происходит преимущественно физическим путем (то есть не сопровождающееся химической деструкцией тушителя); по абсолютной величине константы скорости реакций химического тушения достаточно высоки и сопоставимы с таковыми для других липидов [Красновский, Парамонова, 1983]. Принято считать, что тушение 1gO2 происходит в результате следующих процессов [Красновский, Парамонова, 1983]: 1O2+Аст 3O2+ 3Аст, где Аст – астаксантин. Затем происходит релаксация триплетного состояния в результате тепловой диссипации: 3Аст 1Аст. Тушение синглетного кислорода астаксантином – реакция II порядка [Conn et al., 1991; Truschott, 1990]. Константа ее скорости при комнатной температуре в бензоле составляет 1,41010 1/М/с [Conn et al., 1991]. При этом самопроизвольная дезактивация триплетного пигмента с обратным переносом энергии на кислород несущественна. Тушение может осуществляться и путем образования комплекса с переносом заряда. При этом может происходить деструкция тушителя [Красновский, Парамонова, 1983; Goto et al., 2001].

Также для астаксантина, как для прочих каротиноидов, характерны реакции перехвата свободных радикалов, в частности, частично восстановленных форм кислорода или перекисей липидов в биологических мембранах. Взаимодействие с радикалами может осуществляться в результате следующих основных процессов: передача протона или электрона ROO+Аст ROO-+ Аст+ ; ROO+Аст ROOH+ Аст ; или формирования менее активных радикалов ROO+Аст (ROO–Аст). В этом проявляются свойства астаксантина как антиоксиданта, то есть вещества, способного в концентрациях, существенно меньших, чем концентрация окисляемого вещества, предотвращать его окисление или уменьшать его интенсивность [Halliwell, Gutteridge, 1990]. В целом, в гомогенном растворе скорость окисления липидов в присутствии астаксантина сходна с таковой для прочих каротиноидов, в частности, для -каротина или зеаксантина [Goto et al., 2001]. Однако известно, что в экспериментах in vivo антиоксидантная активность астаксантина существенно выше, чем у других пигментов каротиноидного ряда [Goto et al., 2001; Kurashige et al., 1990]. Также известно, что в липосомах антиоксидантный эффект астаксантина выражен более ярко, чем в случае -каротина [Goto et al., 2001]. Это связанно с тем, что механизмы формирования радикалов и их нейтрализации каротиноидами в живых системах существенно отличаются от таковых в гомогенной среде. Кинетика перекисного окисления мембранных липидов в них имеет двухфазный характер. Изначально следует лаг-фаза, связанная с формированием активных форм кислорода (АФК) в полярной среде, затем следует их диффузия в толщу липидного бислоя и непосредственно реакции окисления. Зеаксантин, имеющий в молекуле две полярные ОН-группы, нейтрализуют АФК в полярной среде на этапе лаг-фазы. В этом задействованы иононовые кольца. Молекула зеаксантина при этом закреплена в липидном бислое так, что в его толще находится полиеновая цепь, а полярные фрагменты закреплены по обе стороны мембраны в результате взаимодействия с полярными фрагментами мембранных липидов. Напротив, -каротин, не имеющий полярных фрагментов, целиком погружается в толщу мембраны и участвует в ней в нейтрализации свободных радикалов и синглетного кислорода; при этом может происходить изменение его полиеновой цепи [Goto et al., 2001; Halliwell, Gutteridge, 1990]. Важно, что -каротин способен в сравнительно больших количествах растворяться в гидрофобной среде липидного бислоя. При этом возрастает вероятность образования его производных-свободных радикалов, которые способствуют протеканию процессов перекисного окисления липидов. Таким образом, антиоксидантный эффект -каротина сменяется прооксидантным [Halliwell, Gutteridge, 1990]. Особенностью астаксантина является способность образовывать внутримолекулярные водородные связи (рис. 1г) с участием гидроксильных групп и кетогрупп -иононовых колец. В результате этого молекула способна полностью погружаться в неполярную среду (рис. 1в). Таким образом, пигмент может нейтрализовать синглетный кислород и свободные радикалы и в полярной, и в неполярной среде. Причем, экспозиция иононовых колец в полярную фазу дает возможность восстановления их структуры путем взаимодействия с аскорбатом (что невозможно для -каротина) [Goto et al., 2001; Halliwell, Gutteridge, 1990].

Известно, что каротиноиды могут влиять на вязкость мембран. Зеаксантин, в частности, способствует снижению вязкости. Это уменьшает диффузию липидов, индуцированную высокой температурой, и предотвращает дезорганизацию липидного бислоя. Функция -каротина в мембранах отличается от таковой для ксантофиллов. Он повышает вязкость. Его содержание увеличивается у растений при адаптации к холоду [Fasset et al., 2008; Havaux, 1998; Liang et al., 2009]. Так как астаксантин может быть локализован в мембране и как -каротин, и как зеаксантин, то он может влиять на вязкость по-разному, сочетая эффекты перечисленных выше каротиноидов [Liang et al., 2009].

Пластидные мембраны растений состоят преимущественно из галактолипидов (около 75%), содержащих большой процент остатков ненасыщенных ЖК. При этом они не содержат холестерола и других стероидов в детектируемых концентрациях. Это достаточно текучие мембраны (в сравнении с большинством биомембран). Поддержание определенных значений их вязкости существенно для функционирования ЭТЦ пластид [Gounaris, Barber, 1983]. Поэтому поддержание определенного соотношения между теми или иными каротиноидами в мембранах тилакоидов важно для функционирования фотосинтетического аппарата (ФСА) клетки [Gounaris, Barber, 1983; Havaux, 1998]. Однако, несмотря на наличие ряда данных о влиянии астаксантина на вязкость липидного бислоя in vitro [Liang et al., 2009], данных о его локализации в мембранах тилакоидов в настоящий момент нет.

На воздухе астаксантин окисляется до астацина (рис. 1А) [Davis, Weedon, 1960; Kuhn, Lederer, 1933; Kuhn, Srensen, 1938a], который в растворе существует преимущественно в енольной форме (рис. 1А) [Davis, Weedon, 1960], а в присутствие восстановителей, таких как боргидрид натрия, кетогруппы астаксантина восстанавливаются до гидроксильных групп. В результате образуется крустаксантин [Davis, 1976]. Благодаря наличию в молекуле двух гидроксильных групп, астаксантин способен образовывать сложные эфиры с карбоновыми кислотами.

Хранение астаксантина в виде экстрактов в растительных маслах (таких как рисовое, горчичное, арахисовое, имбирное, оливковое, подсолнечное) увеличивает его стабильность. В них он не теряет цвета в течение четырех месяцев при комнатной температуре. Добавление пальмового масла способствует повышению стабильности при повышении температуры до 90С в течение восьми часов. Это может быть связано с особенностями его ЖК состава. Увеличение стабильности может быть обусловлено присутствием флавоноидов (оливковое), токоферолов (горчичное и подсолнечное) и -оризанола (рисовое). Добавление астаксантина, в свою очередь, снижает вероятность образования АФК и перекисного окисления в маслах [Rao et al., 2007].

Основные процессы, происходящие в клетках Haematococcus pluvialis при формировании гематоцист

Переход клеток H. pluvialis в состояние гематоцисты сопровождается серьезными перестройками метаболизма и ультраструктуры клеток. Наиболее выраженными изменениями в строении клеток микроводоросли является 1) увеличение размера, 2) появление жесткой клеточной стенки, устойчивой к различным воздействиям, 3) заполнение существенной части объема цитоплазмы ЛГ, 4) уменьшение доли объема, занимаемой хлоропластом.

Формирование ЛГ в цитоплазме H. pluvialis является одним из наиболее ярко выраженных признаков перехода в состояние гематоцисты [Grnewald, Hagen, 2001; Lang, 1968; Santos, Mesquita, 1984; Wang et al., 2003; Zhekisheva et al., 2002]. На ультратонких срезах, исследованных методом трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) после предварительной фиксации OsO4 или KMnO4, они выявляются как крупные включения низкой электронной плотности [Klochkova et al., 2013; Lang, 1968; Santos, Mesquita, 1984]. На ранних этапах гематоцист включения нейтральных липидов представляют собой небольшие сферы и палочки, зажатые в цитозоле другими структурами клеток. Позднее они увеличиваются в размере и сливаются друг с другом, формируя крупные ЛГ [Lang, 1968]. Накопление большого количества ТАГ в клетках микроводоросли приводит к увеличению их размера и накоплению СВ [Boussiba, 2000; Damiani et al., 2010; Zhekisheva et al., 2002]. Также особенностью гематоцист является потеря подвижности и появление интенсивной красной окраски за счет накопления астаксантина [Boussiba, 2000; Droop, 1954; Triki et al., 1997]. Известно, что переход в состояние гематоцисты сопровождается выраженной редукцией фотосинтетического аппарата [Boussiba, 2000; Lang, 1968]. На ультратонких срезах гематоцист пластиды занимают существенно меньшую часть площади, чем у вегетативных клеток. При этом хлоропласт оттесняется ЛГ к центру клетки. Таким образом, ФСА H. pluvialis гематоцист не редуцируется полностью, а маскируется накапливаемым в клетке астаксантином [Lang, 1968].

Одновременно с образованием в цитоплазме ЛГ, содержащих астаксантин, происходит формирование вторичной клеточной стенки, которая по своим свойствам сильно отличается от покровов вегетативных клеток и зооспор [Hagen et al., 2002; Lang, 1968]. Клеточная стенка гематоцист H. pluvialis содержит 70% углеводов, 6% белков и 3% других веществ, устойчивых к ацетолизу [Hagen et al., 2002]. В качестве компонента, устойчивого к ацетолизу, по данным инфракрасной (ИК) Фурье-спектроскопии, выступает альгинан, алифатический биополимер, устойчивый к различным химическим воздействиям [Damiani et al., 2006; Montsant et al., 2001]. Протеомный анализ клеточной стенки H. pluvialis при переходе в состояние гематоцисты показал наличие как постоянно присутствующих в ней белков, так и специфичных для клеточных стенок гематоцист. В частности, для них характерно наличие фермента цитокининоксидазы, который может играть существенную роль в процессе перехода в состояние гематоцисты [Wang et al., 2004].

Переход клеток H. pluvialis в состояние гематоцисты сопровождается резкой перестройкой метаболизма. Это необходимо для адаптации к неблагоприятным условиям. В результате происходит изменение соотношения между основными группами органических веществ – белками, углеводами и липидами – и общее увеличение СВ клеток [Gu et al., 2014; Recht et al., 2014; Tran et al., 2009; Wang et al., 2004; Zhekisheva et al., 2002]. Активность клеток H. pluvialis при стрессе имеет двухфазный характер [Recht et al., 2014]. Первый этап – период высокой физиологической активности, характеризующийся активацией биосинтетических процессов, усиленной работы ЭТЦ пластид, а также существенным изменением морфологии клеток [Boussiba, 2000; Kobayashi et al., 1997]. На втором этапе физиологическая активность сохраняется, но имеет иной характер. Получение энергии при этом происходит преимущественно не за счет фотосинтеза, аз за счет катаболизма накопленного крахмала, постепенно падает содержание углеводов [Recht et al., 2014], возрастает роль “темнового” дыхания [Tan et al., 1995], содержание астаксантина продолжает повышаться, хотя менее резко.

Перенос клеток H. pluvialis в неблагоприятные условия не приводит к моментальному снижению физиологической активности. Напротив, в первые двенадцать часов происходит резкий скачок метаболической активности. Уже в первые часы активно экспрессируются гены ряда ферментов центрального метаболизма (пути Эмбдена-Мейергофа-Парнаса, пентозофосфатного пути, дыхательной цепи транспорта электронов), а также ферментов синтеза изопреноидов (в частности, флавоноидов и каротиноидов), белков, участвующих в передаче сигналов внутри клетки [Rumenau et al., 2007; Tran et al., 2009; Wang et al., 2004]. Первые 24 часа после переноса в стрессовые условия сильно увеличивается СВ клеток, идет усиленный синтез углеводов и ЖК [Recht et al., 2014], причем, возрастает доля ненасыщенных, в частности олеиновой кислоты [Peled et al., 2011; Zhekisheva et al., 2005]. Первые 12 часов почти не происходит деградация хлорофилла [Recht, 2014], повышается уровень экспрессии b6f-комплекса, который потом почти полностью деградирует [Gu et al., 2014]. Позднее физиологическая активность клеток существенно снижается [Recht et al., 2014].

При стрессе для H. pluvialis характерна активация различных защитных систем. В первые часы увеличивается уровень экспрессии ферментов детоксикации АФК, однако активность антиоксидантных ферментов поддерживается на высоком уровне лишь первые двое суток [Wang et al., 2004], происходит синтез астаксантина и ТАГ [Boussiba, 2000; Kobayashi et al., 1997; Recht et al., 2014; Zhekisheva et al., 2002]. Известно, что даже после десяти суток пребывания в стрессовых условиях в клетках H. pluvialis детектируется присутствие фотосинтетических пигментов [Gu et al., 2013; Tan et al., 1995; Zlotnik Shmerler et al., 1993]. При стрессе экспрессируются белки, связывающиеся с РНК, отвечающие за повышение pH внутри клетки и ряд других белков, ассоциированных со стрессом. По-видимому, их функция заключается в защите фотосинтетического аппарата [Gu et al., 2013]. Наблюдается повышение уровня экспрессия ферментов хлородыхания [Rumeau et al., 2007], в частности пластидной терминальной оксидазы (PTOX) [Li et al., 2008]. У H. pluvialis отмечено наличие двух генов PTOX: PTOX1 и PTOX2. Повышение экспрессии PTOX1 происходит при индукции синтеза астаксантина. Также повышается уровень экспрессии ряда ферментов синтеза каротиноидов (изопентенилпирофосфатизомеразы, -циклазы ликопина, гидроксилазы и кетолазы -иононовых колец, фитоиндесатуразы) [Li et al., 2008].

Определение влияния солености на рост микроводорослей

Интересно, что синтез астаксантина у H. pluvialis индуцируется не только различными стрессовыми факторами. Накопление пигмента может происходить при действии ингибитора клеточного деления винкристина (ингибитора сборки микротрубочек) [Boussiba, Vonshak, 1991]. Индукцию синтеза астаксантина и переход в состояние гематоцисты индуцирует добавление к вегетативным клеткам микроводоросли абсцизовой кислоты или ее полусинтетических аналогов (однако гормон не усиливает накопление астаксантина зрелыми гематоцистами). Таким образом, данный гормон может играть роль при индукции перехода H. pluvialis в состояние гематоцисты [Kobayashi et al., 1997, 1998]. В экспериментах с другой продуцирующей астаксантин водорослью C. zofingiensis установлено, что в активации синтеза пигмента также задействованы митохондрии. Установлено, что интермедиаты цикла Кребса могут индуцировать синтез астаксантина у микроводоросли независимо от стрессовых воздействий [Vanlerberghe, McIntosh, 1997]. Известно, что добавление органического источника углерода (ацетата) к культуре H. pluvialis также приводит к каротиногенезу [Kobayashi et al., 1991, 1993].

Таким образом, индукция накопления астаксантина осуществляется при помощи широкого спектра факторов, запускающих программу синтеза пигмента на различных уровнях: транскрипционном, трансляционном и посттрансляционном. Поэтому последовательность событий, происходящих при запуске каротиногенеза, нельзя свести к какому-либо одному механизму. Данное обстоятельство ставит вопрос о функции накопления астаксантина в клетках микроводорослей.

Несмотря на то, что факт накопления красного пигмента в клетках H. pluvialis был известен еще с середины XIX века [Droop, 1954; Elliot, 1934; Hazen, 1899; Lorenz, 1999], вопрос о физиологической роли этого явления долгое время оставался неясен [Boussiba, Vonshak, 1991]. То, что астаксантин накапливается в клетках микроводоросли при действии различных стрессовых факторов, таких как очень яркий свет [Boussiba, Vonshak, 1991; Droop, 1954], должно указывать на защитную роль данного явления. Предположение о защитной роли красного пигмента у микроводорослей высказывалось еще в XIX веке [Hazen, 1899]. В самом деле, хорошо известно, что каротиноиды задействованы в целом ряде защитных механизмов [Goodwin, 2012; Young, 1991]. Они участвуют в циклах эпоксидации/деэпоксидации, регулируемых трансмембранным протонным градиентом мембран тилакоидов, приводящих к образованию тушителей возбужденных состояний хлорофилла в условиях избыточной освещенности [Bilger, Bjrkman, 1990; Demmig-Adams, Adams, 1996]. К ним относятся виолаксантиновый, диадиноксантиновый и 3-эпоксилютеиновый циклы [Demmig-Adams, Adams, 1996; Mller, et al., 2001]. Антиоксидантные свойства каротиноидов проявляются и при непосредственном тушении ими АФК [Красновский, Парамонова, 1993; Truscott, 1990; Young,

Frank, 1996] (см. раздел 2.2). Также каротиноиды способствуют стабилизации структуры мембран и пигмент-белковых комплексов ФСА [Havaux, 1998; Havaux, Tardy, 1996]. В самом деле, содержащие гематоцисты H. pluvialis становятся более устойчивыми к действию АФК, чем вегетативные клетки [Kobayashi et al., 1997, 2000]. Однако фотозащитная роль астаксантина не столь очевидна. В фотоавтотрофной клетке основным местом генерации токсичных АФК являются пластиды [Asada, 2006], а эфиры астаксантина локализованы в совершенно ином компартменте, в ЛГ в цитозоле (см. раздел 2.7.3.7), что указывает на невозможность функционирования пигмента как антиоксиданта у H. pluvialis [Fan et al., 1998]. Также нет данных об участии астаксантина в циклах эпоксидации/деэпоксидации (подобно зеаксантину и виолаксантину) и его присутствии в тилакоидных мембранах. Сам процесс образования астаксантина в клетке сопровождается прекращением роста [Boussiba, Vonshak, 1991] и редукцией ФСА [Boussiba, Vonshak, 1991; Lang, 1968]. Таким образом, теряется необходимость в защите от фотоповреждения, которое может возникнуть при интенсивной работе ЭТЦ пластид. Кроме того, пигмент может накапливаться в клетке и в отсутствии света при гетеротрофном росте [Droop, 1955]. Данные факты позволили усомниться в защитной роли пигмента [Boussiba, Vonshak, 1991; Fan et al., 1998]. Однако в пользу гипотезы о защитной роли астаксантина в клетках микроводоросли выступает тот факт, что подавление синтеза пигмента приводит к гибели в неблагоприятных условиях [Hagen et al., 1994].

Было установлено, что накопление каротиноида у H. pluvialis снижает уровень повреждения белка D1 реакционных центров (РЦ) фотосистемы II (ФСII) [Wang et al., 2004]. Каким образом осуществляется защитная функция пигмента? Можно думать, что благодаря высоким значениям коэффициента экстинкции в полосе его поглощения в сине-зеленой области [Britton, 1995] астаксантин осуществляет защиту клетки от фотоповреждения путем оптического экранирования поглощающих свет фотосинтетических пигментов [Соловченко, Мерзляк, 2010; Boussiba, 2000; Hagen et al., 1994]. Известно, что при действии на клетки яркого света ЛГ мигрируют от центра к периферии. В этом может выражаться фотозащитная роль находящегося в них астаксантина: увеличение интенсивности действующего света приводит к такому изменению пространственной ориентации внутриклеточных структур, при которых все они оказываются заслонены поглощающими свет глобулами. Светозависимая миграция не подавляется ингибиторами полимеризации микротрубочек (винбластином и винкристином), но подавляется ингибиторами сборки актиновых микрофиламентов (цитохалазином В и латрункулином А), таким образом, в транспорте глобул задействованы актиновые микрофиламенты [Peled et al., 2013]. Миграция индуцируется синим светом (в области поглощения астаксантина), но не индуцируется красным; индуцируется дибромометилизопропилбензохиноном (даже при неярком свете), но не индуцируется диуроном, то есть определяется уровнем восстановленности пула пластохинонов (тем же фактором, который индуцирует синтез астаксантина) [Peled et al., 2013]. Однако, из сравнения спектров поглощения хлорофиллов и астаксантина следует, что эффективное экранирование может осуществляться лишь при сильном избытке последнего [Fan et al., 1998]. Таким образом, фотозащита путем экранирования может осуществляться лишь в зрелых гематоцистах, где количество вторичных каротиноидов существенно превосходит количество фотосинтетических пигментов [Fan et al., 1998]. При этом сильно редуцированный ФСА клеток оттесняется в центральную часть клетки ЛГ, заслоняющими его от света [Lang, 1968]. Однако на ранних этапах формирования гематоцист биосинтез астаксантина в клетках микроводоросли также может играть важную защитную роль [Fan et al., 1998]. Усиление работы ЭТЦ пластид вследствие резкого повышения облученности приводит к ее перевосстановлению, увеличению количества молекулярного кислорода, выделяемого ФСII в ходе реакции Меттлера, а также повышению содержания в клетке восстановительных эквивалентов (НАДФН). Все это приводит к повышению вероятности возникновения токсичных АФК [Asada, 2006]. Известно, что синтез астаксантина сопровождается утилизацией восстановительных эквивалентов и молекулярного кислорода при помощи PTOX и в ходе реакций образования ксантофиллов (см. раздел 2.7.3). Установлено, что до 10% O2, выделяемого в ходе функционирования пластидной ЭТЦ может утилизироваться в ходе образования астаксантина при его интенсивном накоплении H. pluvialis [Han et al., 2013]. Таким образом, накопление астаксантина является активным фотозащитным механизмом, функционирующим для снижения возникновения АФК в клетке [Fan et al., 1998; Han et al., 2013]. По-видимому, аналогичную защитную роль выполняет накопление в клетке ТАГ, так как синтез протяженных остатков ЖК требует большого количества восстановительных эквивалентов, избыток которых наблюдается в клетке при избыточной освещенности и/или дефиците минерального питания [Соловченко, 2012]. Однако вопрос о роли накопления астаксантина в отсутствии стрессовых факторов остается малоизученным. Известно, что в подвижных клетках H. pluvialis пигмент также играет очень важную роль, так как участвует в фототаксисе, находясь в стигме [Braune, Ekelund, 1990; Litvin et al., 1978]. Одни из первых работ [Litvin et al., 1978] по изучению роли каротиноидов в фоторецепции у микроводорослей были выполнены именно на H. pluvialis. Предположительно в клетке должны быть конститутивные и стресс-индуцируемые пути биосинтеза астаксантина [Han et al., 2013]. Возможно, у H. pluvialis может происходить конститутивный синтез пигмента вне зависимости от стрессовых факторов, но в сравнении с другими пигментами клетки содержание астаксантина остается на низком уровне вследствие деления клеток. Однако экспериментальных фактов, подтверждающих это предположение явно недостаточно.

Изменение пигментного состава в клетках H. pluvialis в экспериментах по изучению функционирования ФСА

Поскольку для естественной среды обитания H. pluvialis BM1 характерны резкие колебания солености, можно предположить наличие у данного штамма повышенной толерантности к резким колебаниям этого фактора внешней среды. Для оценки толерантности H. pluvialis BM1 к повышенной солености водоросль культивировали на среде BG-11 с повышенным содержанием NaCl (25), близкому к средней солености Белого моря [Добровольский, Залогин, 1982]. Определено, что культивирование при повышенной солености приводит к некоторому снижению соотношения Хл/Кар (рис. 14). В спектрах поглощения пигментов, экстрагированных из клеток при помощи ДМСО (между 5 и 0 сутками культивирования и между 7 и 0 сутками культивирования), культивируемых при повышенной солености появлялся максимум поглощения астаксантина, не отмеченный в контроле. Таким образом, снижение соотношения Хл/Кар происходило за счет накопления астаксантина. Кроме того, аналогичные изменения соотношения Хл/Кар наблюдаются и в контроле, что может быть связанно с условиями культивирования (механический стресс клеток вследствие перемешивания) (см. раздел 3.3). Однако культивирование при повышенной солености не приводило к деградации хлорофиллов (рис. 14). Напротив, рост их содержания был сопоставим с таковым в контроле (рис. 14). В то же время известно, что повышение солености до 8 у известных штаммов H. pluvialis приводит к задержке роста культуры и высокой смертности клеток [Boussiba, 2000; Boussiba, Vonshak, 1991; Sarada et al., 2002].

Таким образом, у H. pluvialis BM1 выявлена повышенная, по сравнению с другими штаммами этого вида, толерантность к солености. Однако точное определение пределов толерантности требует более детальных исследований. Тем не менее, более галотолерантный штамм H. pluvialis BM1 потенциально более пригоден для получения астаксантина биотехнологическим путем в районах, в которых доступны только солоноватые воды, а количество пресной воды ограничено.

С целью индукции образования гематоцист вегетативные клетки H. pluvialis BM1 переносили в стрессовые условия (дистиллированная вода и яркий свет, см. раздел 3.4). При этом наблюдалось массовое образование клеток, по морфологии соответствующих описанию гематоцист H. pluvialis [Droop, 1954; Lorenz, 1999]. Суспензия приобретала интенсивную красную окраску (рис. 15а,г) за счет повышения содержания вторичных каротиноидов (см. ниже). Кинетика накопления каротиноидов (рис. 15в) была сходной с таковой для других штаммов микроводоросли [Boussiba, Vonshak, 1991]. За шесть суток культивирования в стрессовых условиях содержание пигментов достигало 5% от СВ культуры, а массовое соотношение Кар/Хл повышалось с 0,18±0,01 до 13,00±0,01. Затем происходило снижение содержания каротиноидов, вероятно, обусловленное деградацией пигментов и (или) более интенсивным накоплением ТАГ.

Гематоцисты H. pluvialis BM1 (3 сутки культивирования в стрессвоых условиях (культивирование в дистиллированной воде, освещенность 480 мкмоль квантов ФАР/м2/с, 25 С) (а). Спектры поглощения экстрактов пигментов, выделенных при помощи ДМСО из вегетативных клеток (зелёный пунктир) и гематоцист (3 сутки культивирования в стрессовых условиях) (красная линия) (б). Кинетика накопления каротиноидов при формировании гематоцист H. pluvialis BM1 (в). Суспензия клеток H. pluvialis BM1 при индукции формирования гематоцист (г).

Превращение вегетативных клеток H. pluvialis BM1 в гематоцисты сопровождалась снижением содержания хлорофиллов, что видно из сравнения спектров поглощения пигментов, выделенных при помощи ДМСО из вегетативных клеток и клеток, в течение трех дней культивируемых в стрессовых условиях (рис. 15б). На электронных микрофотографиях (Рис. 15в) видно, что превращение в гематоцисты сопровождалось сокращением площади, занимаемой на срезах пластидами, уменьшением протяженности мембран тилакоидов. Таким образом, в клетках происходила редукция ФСА. Содержание каротиноидов на уровне 5% от СВ является сравнительно высоким показателем для лабораторных культур H. pluvialis (типичные значения —3,0–4,0% СВ [Lorenz, Cyzewsky, 2000; Olaizola, 2000].

В целом, разделение экстрактов вегетативных клеток H. pluvialis BM1 методом ВЭЖХ показало, что их пигментный состав сходен с таковым для других зеленых водорослей. Профиль элюции (рис. 16а) содержал пики, соответствующие пигментам ФСА: неоксантину, виолаксантину, лютеину, -каротину, хлорофиллам а и b. Особенностью вегетативных клеток H. pluvialis BM1 являлось присутствие в них различных эфиров астаксантина в небольших количествах (их время удерживания составляло 8 мин и больше). Данные соединения (но в большем количестве) выявлялись в гематоцистах (см. ниже). Присутствие в вегетативных клетках эфиров астаксантина могло быть обусловлено тем, что пигмент в них не деградирует, а распределяется между дочерними клетками при делении. Небольшое количество астаксантина должно присутствовать в стигме монадных форм микроводоросли и принимать участие в фоторецепции [Litvin et al., 1978].

Индукция перехода в состояние гематоцисты сопровождалась резким изменением пигментного профиля (Рис 16б). В результате разделения методом ТСХ экстрактов гематоцист (на шестые сутки культивирования) было получено пять содержащих пигменты фракций (рис. 15б). Их спектры поглощения были схожи с таковым для астаксантина. При повторной регистрации спектра поглощения первой фракции (Rf = 0,17 – 0,20) после ее инкубации на воздухе при комнатной температуре в течение 10-15 мин наблюдалось смещение максимума поглощения до значения 494 нм, характерного для астацина [Cooper et al., 1975]. Подобное изменение в могло быть связано с окислением астаксантина кислородом воздуха. Следовательно, пигмент в данной фракции содержался в неэстерифицированном виде. Наибольшее количество астаксантина (80,0% по массе) находилось суммарно во второй (Rf = 0,30 – 0,34) и третьей (Rf = 0,32–0,37) фракциях, обладающих сходной хроматографической подвижностью в используемой системе растворителей (рис. 16б). Существенно меньше пигмента содержалось во фракциях IV (Rf = 0,43 – 0,46) и V (Rf = 0,54 – 0,56 и в свободном состоянии (3,5 % по массе от общего количества пигментов).

Анализ отдельных содержащих пигменты фракций, полученных при разделении экстрактов гематоцист путем ТСХ, был проведен при помощи ВЭЖХ (рис. 16б). В профиле элюции были выявлены пики, соответствующие фракциям со спектрами поглощения, характерными для астаксантина, и различными временами удерживания. Путем интегрирования профиля элюции было определено, что астаксантин на данном сроке культивирования составляет около 99,5% от всех пигментов микроводоросли. ВЭЖХ-анализ первой фракции ТСХ подтвердил наличие в них астаксантина в неэстерифицированной форме: его время удерживания было сходно с таковым для заведомого свидетеля (чистого астаксантина). Также отмечалось присутствие соединения со временем удерживания, соответствующем неоксантину (рис. 16б). Профиль элюции пигментов из второй фракции содержал восемь пиков, находящихся в диапазоне времен удерживания 8–10 мин. В целом, разделение пигментов из третьей фракции позволило выявить ряд пиков, имеющихся в профиле элюции второй. Таким образом, соединения в них обладают сходными свойствами, что подтверждается близкими значениями Rf, на хроматограмме ТСХ (рис. 16). Скорее всего, они могли содержать различные эфиры астаксантина и ЖК. Пятая фракция характеризуется наличием в ней большого числа трудно разделимых неполярных соединений со спектрами поглощения, схожими со спектрами астаксантина. По-видимому, это различные геометрические изомеры диэфиров пигмента с ЖК.