Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 13
1.1. Концепция фитобиома растения и экологические ниши эндофитных бактерий 13
1.2. Биоразнообразие эндофитных бактерий бобовых растений 20
1.3. Пути проникновения эндофитных бактерий в растительный организм и распространение их в эндосфере растений 27
1.4. Рост и развитие растений под влиянием фитогормон-подобных соединений эндофитных бактерий 32
1.5. Деструкция органических загрязнителей и других ксенобиотиков эндофитными бактериями 48
1.6. Влияние инокуляции растений эндофитными бактериями на продуктивность и устойчивость сельскохозяйственных растений 55
2. Объекты и методы исследования 63
2.1. Объекты исследования 63
2.1.1. Виды и сорта растений 63
2.1.2. Бактериальные культуры 63
2.1.3. Генетические конструкции и рефернтные штаммы 64
2.1.4. Грибные фитопатогены 64
2.2. Материалы для исследований 64
2.2.1. Питательные среды для культиирования бактерий 64
2.2.2. Среда для выращивания растений 64
2.3. Условия и методы проведения исследований 65
2.3.1. Выделение эндофитных бактерий 65
2.3.2. Видовая идентификация бактерий 66
2.3.3. Трансформация и визуализация генетически модифицированных штаммов 67
2.3.4. Проверка безопасности штаммов 67
2.3.5. Инокуляция растений 67
2.3.6. Определение антагонистической активности бактерий 68
2.3.7. Изучение колонизации корня с помощью конфокальной микроскопии 69
2.3.8. Оценка фитогормон-подобной активности бактерий 69
2.3.9. Содержание гормонов и антиоксидантов в растениях 70
2.3.10. Методы полевых исследований 76
2.3.11. Статистическая обработка данных 80
3 Результаты и их обсуждение 81
3.1. Исследование природных ассоциаций эндофитных бактерий в клубеньках и корнях бобовых растений 81
3.1.1. Экспериментальные предпосылки, вызвавшие интерес к изучению эндофитного микробиома клубеньков бобовых растений 81
3.1.2. Скрининг эндофитных бактерий, способных проявлять антагонизм к фитопатогенам и стимулировать рост растений гороха и фасоли 88
3.1.3. Таксономическая идентификация отдельных штаммов эндофитных бактерий и оценка их безопасности 98
3.1.4. Межмикробные взаимоотношения эндофитных бактерий, выделенных из природных ассоциаций клубеньков гороха и фасоли 107
3.2. Пути колонизации растений гороха эндофитными бактериями 112
3.3. Продуктивность и устойчивость бобовых растений, инокулированных эндофитными бактериями в полевых условиях 118
3.3.1. Анализ адаптивных свойств разных сортов гороха и фасоли 118
3.3.2. Анализ продуктивности растений гороха в полевых условиях при обработке семян эндофитными бактериями 124
3.3.3. Продуктивность и устойчивость к болезням растений фасоли при инокуляции изолятами и штаммами эндофитными бактерий 128
3.4. Взаимодействие растений гороха с эндофитными бактериями, выделенными из других видов растений 143
3.4.1. Анализ связи дозы вносимых эндофитов на семена бобовых растений с разным уровнем продукции фитогормонов бактериями 144
3.4.2. Рост и фитогормональный статус проростков гороха, инокулированных бактериями с разным уровнем продукции ИУК 154
3.4.3. Анализ вклада эндофитных бактерий с разным уровнем продукции цитокининов на рост и фитогормональный статус проростков гороха 160
3.4.4. Гормональный статус, характеристики роста проростков при инокуляции гороха комбинациями эндофитных бацилл и ризобий 167
3.4.5. Анализ морфометрических показателей инокулированных эндофитными бактериями растений гороха в полевых опытах 170
3.5. Повышение стрессоустойчивости бобовых растений при инокуляции эндофитными бактериями 181
3.5.1. Оценка способности коллекционных штаммов к росту на среде, содержащей гербицид 2,4-Д в качестве единственного источника углерода 181
3.5.2. Рост инокулированных эндофитными бактериями растений гороха и некоторые их биохимические параметры в условиях засоления 188
3.5.3. Связь биохимических показателей инокулированных растений фасоли в модельных опытах с продуктивностью в полевых условиях 199
3.6. Разработка методологических и биотехнологических подходов к оптимизации растительно-микробных взаимоотношений для повышения их адаптивного потенциала 203
Заключение 211
Выводы 218
Список литературы 220
- Биоразнообразие эндофитных бактерий бобовых растений
- Экспериментальные предпосылки, вызвавшие интерес к изучению эндофитного микробиома клубеньков бобовых растений
- Анализ связи дозы вносимых эндофитов на семена бобовых растений с разным уровнем продукции фитогормонов бактериями
- Разработка методологических и биотехнологических подходов к оптимизации растительно-микробных взаимоотношений для повышения их адаптивного потенциала
Биоразнообразие эндофитных бактерий бобовых растений
Эндофитами бобовых растений являются клубеньковые бактерии, относящиеся к семейству Rhizobiaceae, называемые «ризобиями», образующие высокоспецифичный азотфиксирующий симбиоз с растением-хозяином. Обнаружив в клубеньках наряду с ризобиями разные виды ненодулирующих эндофитных бактерий, канадский ученый Э. Штурц высказал мысль о том, что «клубеньковыми бактериями» правильнее было бы называть все сообщество бактерий, населяющих клубеньки, и что толкование привычных терминов нуждается в пересмотре (Sturz et al., 1997).
Действительно, за последние два десятилетия было найдено много новых видов, образующих клубеньки на бобовых растениях. Это не только а-протеобактерии 6 известных родов, таких как Rhizobium, Bradyrhizobium, Sinorhizobium (Ensifer), Mesorhizobium, Azorhizobium, Allorhizobium, но и представители других семейств и подклассов бактерий (Pongsilp, Boonkerd, 2007). Показано, что клубеньки могут быть образованы метилотрофными бактериями Methylobacterium nodularis (Sy et al., 2001). На плавающих стеблях растения бобового растения Neptunia natans клубеньки формировали бактерии Devosia neptuniae (Rivas et al, 2002). Пресноводные бактерии Blastobacter denitrificans нодулировали бобовое растение Aeschynomene indica (van Berkum, Eardly, 2002). Бактерии рода Phyllobacterium, выделеные из клубеньков Trifolium pratense, формировали симбиотические взаимоотношения с растениями клевера и люпина (Valverde et al., 2005). Вызывали клубенькообразование у бобовых выделенные из клубеньков акации бактерии Ochrobacter (Ngom et al., 2004). Не только a-протеобактерии, но и представители 3-протеобактерий найдены среди клубенькообразующих бактерий. Например, были установлены нодулирующие 3-протеобактерии рода Burkholderia (Moulin et al., 2001). Бактерии Cupriavidus, ранее Ralstonia, образовывали клубеньки на корнях растений мимозы (Chen et аі, 2001а). Из клубеньков растений Phaseolus vulgaris был выделен новый вид -протеобактерий, близкий к Herbaspirillum (Valverde et al., 2003). В клубеньках диких видов бобовых растений было идентифицировано множество некультивируемых видов, относящихся к группе -протеобактерий, хотя способность самостоятельно образовывать клубеньки ими не доказана (Muresu et al., 2008; Benjelloun et al., 2019). Коэволюция симбиотических отношений бобовых растений и ризобий рассмотрены в статье (Martinez-Romero, 2009), а новейшая таксономия клубеньковых бактерий приводится в работе (Rivas et al., 2009).
Важно отметить, что не все штаммы ризобий, обитающие в клубеньках, обладали симбиотическими генами (Lei et al., 2008; Lenart-Boro et al., 2019). Ризобии обнаружены и в небобовых растениях (Sessitsch et al., 2002). Их потенциал может быть использован для стимуляции роста растений при инокуляции разных видов небобовых культур (Hossain, Martensson, 2008). С учетом вышесказанного, сообществу бактерий, обитающих в клубеньках, относятся не только обладающие sym-генами ризобии, а ризобии могут быть не только симбиотическими, но и ассоциативными бактериями. Следовательно, описывая эндофитные бактерии, нужно иметь в виду дискуссионное сегодня многообразие толкования терминов и уточнять, какие именно группы бактерий являются предметом обсуждения.
Как отмечает Э. Штурц (Sturz et al., 2000) еще в начале ХХ в. микробиологи описали в клубеньках клевера не только бактерии рода Rhizobium, но и Agrobacterium radiobacter (Bejerinck, Van Delden, 1902). Бактерии Aerobacter, Bacillus и Flavobacterium были выделены из корней клевера (Phillipson, Blair, 1957). Сообщалось также об эндофитных бактериях, населяющих клубеньки сои (Manninger, Antal, 1970; Bai et al., 2002a, Zhao et al., 2018b), фасоли (Lpez-Lpez et al., 2010), гороха посевного (Murugesan et al., 2010), голубиного гороха (Rajendran et al., 2008), вигны (Bhutani et al., 2018). Биоразнообразие эндофитных бактерий в клубеньках некоторых видов культурных растений представлено в таблице 1.2.
Эндофитные бактерии были выявлены и в клубеньках диких видов бобовых растений (Zakhia et al., 2006; Muresu et al., 2008; Deng et al., 2011; Xu et al., 2014; De Meyer et al., 2015; Сазанова и др., 2017; Кузнецова и др., 2017). Таксономический состав этих бактерий более разнообразен (табл. 1.3). В произрастающих в горах Китая бобовых растениях, было идентифицировано 35 видов эндофитных бактерий, относящихся к ризобиальным и неризобиальным семействам (Xu et al, 2014). В клубеньках диких бобовых растений доминировали те же виды, что и в культурных растениях. Так, по данным генетического анализа 654 изолятов клубеньков 30-ти видов диких бобовых растений Бельгии доля представителей Bacillus составила 18 %, Pseudomonas - 16 % (De Meyer et al., 2015). В клубеньках Mimosa pudica были выявлены представители Enterobacter sp. и Serratia sp. (Snchez-Cruz et al., 2019).
Бактериальные эндофиты были найдены не только в клубеньках, но и в других частях растений: в ксилеме корней люцерны (Gagn et al., 1987) и стеблей гороха (Elvira-Recuenco, van Vuurde, 2000), в листьях фасоли (Costa et al., 2012), в корнях и семенах фасоли (Lpez-Lpez et al., 2010), корнях люцерны (Khalifa et al., 2016), семенах гороха посевного (merda et al., 2005). Строгой приуроченности разных видов бактерий к определенным частям растений обычно не прослеживается. В то же время, например, в листьях растений клевера чаще встречался вид Pantoea agglomerans, в корне -Agrobacterium rhizogenes, а в клубеньках - Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli и R. loti (Sturz et al., 1997). В растениях сои представители Burkholderiaceae доминировали в корнях, а Moraxellaceae - в тканях стебля (Kuklinski-Sorbal et al., 2004). Различия в видовом составе эндофитных бактерий могут быть связаны с источниками поступления бактерий - почвой или филлосферой, поддерживающими отличающиеся микробиомы.
Существенную роль в дифференциации микробных сообществ внутри растения играет генотип растения-хозяина, его потребности и способность регулировать разные симбиотические системы. В экспериментах с растениями сои мутанты (Nod) и (Nod++) с нарушенным контролем нодуляции содержали в корнях сходные микробиомы и доминирующие в них виды эндофитных бактерий по сравнению с растениями дикого генотипа (Nod) (Ikeda et al., 2008). Степень нодуляции влияла и на филогенетический состав культивируемых бактериальных эндофитов в стеблях сои (Okubo et al, 2009). Вследствие неработающего симбиоза у симбиотических мутантов лядвенца японского {Lotus japonicus) менялся состав бактериального микробиома корня, таким образом растение-хозяин дополнял недостаток функций ризобий привлечением широкого спектра других бактерий (Zgadjai et al., 2016).
Бактериальный состав и численность эндофитных бактерий зависит от стадии развития растения и от органа растения. На растениях сои было показано, что с возрастом растения численность эндофитов увеличивалась, а по мере продвижения бактерий от ризосферы в эндоризосферу и надземные части растений - уменьшалась (Kuklinski-Sorbal et al., 2004). Сходные результаты были получены в исследовании колонизации эндофитами диких видов бобовых растений. При отсутствии бактерий в растительных тканях на 5-е сутки роста растений через 1,5 месяца плотность их достигла 30 клеток/г сырой массы, а в стадии цветения увеличилась на 2-3 порядка. Наибольших значений (10 тыс. клеток / г сырой массы) она достигала в корнях, в стеблях - 100-1000 клеток / г сырой массы. Были выявлены и видовые различия: в растениях Hedysarum spinosissimum самая высокая плотность (107 КОЕ / г сырой массы) была зафиксирована в тканях корня, а растениях Н. coronarium численность эндофитов была выше в стеблях, чем в корнях (Muresu et al., 2008).
Ткани клубеньков бобовых растений являются наиболее богатыми по содержанию высокоэнергетических веществ. Это обусловливает возможность поддержания в них более высокой плотности эндофитных бактерий. В клубеньках растений сои плотность бактерий составляла 105-107 КОЕ/г сырой массы. Это на два порядка больше, чем плотность эндофитных бактерий в тканях стебля и корня (Hung et al, 2007). Число бактерий в клубеньках было связано как с сортом растения-хозяина, так и с активностью процессов азотфиксации. Так, в клубеньках растений гороха сорта Тарчальска содержалось в 3 раза меньше клеток эндофитных бактерий, чем в клубеньках сорта Клиф. Крупные красные клубеньки содержали вдвое больше клеток эндофитных бактерий, чем мелкие красные клубеньки и втрое больше, чем неактивные крупные бежевые клубеньки (Lenart-Boro et al, 2019).
Экспериментальные предпосылки, вызвавшие интерес к изучению эндофитного микробиома клубеньков бобовых растений
Одной из задач, поставленной в ранее проведенных исследованиях (Кашаева, 1994), являлась оценка конкурентоспособности коллекционных штаммов ризобий, отличившихся высокой эффективностью применения их в качестве инокулянта для растений гороха. В конце 80-х гг. ХХ века генетические методы идентификации интродуцируемых штаммов были мало доступны. Методы, основанные на устойчивости штаммов к антибиотикам, а также на их серологических свойствах, имели свои недостатки. Поэтому комплекс природных особенностей отдельных штаммов бактерий (цвет, консистенция колоний, форма края, особенности роста на различных тестовых средах), позволяющий по внешним признакам колоний отличать их как в исходных культурах, так в изолятах клубеньков инокулированных ими растений (Кашаева, 1992; Садыков, Кашаева, 1992), были взяты нами за основу для «узнавания» их в смеси с посторонними штаммами и разработки экспресс-метода оценки конкурентоспособности. Большинство коллекционных штаммов R. leguminosarum, выделенных из клубеньков гороха, образовывали на маннитно-дрожжевой среде (YEM-агар) слизистые белые или кремовые колонии с ровным краем, которые оставались бесцветными на среде с красителем Конго красный, характеризовались рядом других признаков, описанных в классическом руководстве по клубеньковым бактериям (Vincent, 1970). Ранее считалось, что клубеньки бобовых населены только представителями семейства Rhizobiaceae. При этом один клубенек образован, как правило, только одним штаммом ризобий. Поэтому бактерии, выделенные из поверхностно стерилизованного клубенька, рассеянные до однотипных одиночных колоний, имеющие соответствующие описанным в руководстве морфолого-культуральные свойства и образующие клубеньки на асептически выращенных растениях гороха, считались ризобиями.
Из 120 штаммов выделенной нами коллекции R. leguminosarum, штаммы 12 и 101 имели отличительные постоянно воспроизводимые морфолого-культуральные свойства, на основе которых инокулируемые штаммы можно было идентифицировать в популяциях, выделенных из клубеньков изолятов. Штамм 12 имел желтовато-кремовый оттенок колоний, а штамм 101 - бежевый цвет и неровный край колоний. Вариации этих свойств ризобий упоминались в названном руководстве (Vincent, 1970), поэтому не возникало сомнений в том, что штаммы 12 и 101 относятся к ризобиям. Появилась идея использовать обнаруженные нами небольшие отличия морфолого-культуральных свойств у коллекционных штаммов для оценки их конкурентоспособности на фоне аборигенных рас клубеньковых бактерий, при условии, что свойства интродуцируемых штаммов не совпадают со свойствами штаммов-аборигенов (Садыков, Кашаева, 1992). Эта задача была успешно реализована и описана в диссертации (Кашаева, 1994). Несмотря на очевидные ограничения, метод удобен своей простой, он был апробирован при сравнении с общепринятым серологическим методом, конкурентоспособность штаммов, выявленная экспресс-методом, хорошо коррелировала с продуктивностью растений гороха.
Позже в ходе паспортизации коллекции выяснилось, что некоторые удобные отличительные свойства коллекционных штаммов R. leguminosarum были связаны с присутствием в бактериальной культуре помимо основного ризобиального штамма клеток одного или нескольких сопутствующих штаммов других видов бактерий. Эти так называемые «спутники» образовывали устойчивую ассоциацию с ризобиальным штаммом, так как постоянно воспроизводились при пересевах и при выделении из изолятов клубеньков инокулированных этим штаммом растений. Важно также, что очищенные от своих «бактериальных спутников» чистые культуры штаммов R. leguminosarum 12 и 101 обеспечивали меньший пророст биомассы четырехнедельных растений, чем исходные бактериальные изоляты клубеньков. По результатам этих экспериментов возникло представление о том, что «спутники ризобий», обнаруживаемые в клубеньках, не являются случайными, а могут придавать бактериальной ассоциации полезные свойства не только на питательных средах in vitro, но и при взаимодействии с растениями in vivo.
Одно из таких свойств было выявлено в 1995 г. в экспериментах с горохом сорта Альфа, в котором штаммы R. leguminosarum 12 и 101 (исходные изоляты клубеньков, еще не очищенные от бактерий-спутников) в контролируемых условиях испытывали в автономных и совместных обработках семян препаратом Бациспецин БМ на фоне возбудителя корневых гнилей гороха Fuzarium oxisporum f. sp. pisi (Кашаева и др., 1995; Гарипова и др., 1999). Основой препарата Бациспецин БМ служил штамм Bacillus sp. 739, подавляющий развитие грибных фитопатогенов пшеницы с выявленным позже широким спектром антагонистической активности (Мелентьев и др., 2017). Возбудитель фузариоза гороха был выделен непосредственно из тканей больных растений того же сорта гороха, бессменно возделываемого на полях совхоза-завода «Янаульский». Целью эксперимента являлась оценка влияния комбинированных обработок растений гороха клубеньковыми бактериями и бациллами на продуктивность растений гороха и способность инокулированных растений противостоять корневым гнилям.
Поскольку Бациспецин БМ ранее проявлял биофунгцидные свойства против возбудителей болезней пшеницы, предполагалось, что бациллы будут направлены и против Fuzarium oxisporum f. sp. Pisi, а штаммы R. leguminosarum 12 и 101, проверенные при взаимодействии с растениями гороха Чишминский, Ирендек, Труженик, сформируют азотфиксирующие клубеньки и на сорте Альфа. Однако в опытах in vitro Бациспецин БМ не был активен против возбудителя корневых гнилей гороха. В то же время изоляты клубеньков – штаммы 12 и 101 – оказали на патоген фунгицидное действие. На чашках Петри зона подавления составила в среднем 0,5 см (табл. 3.1).
В системе in planta снижение развития корневых гнилей при инокуляции штаммом 12 и комбинацией штамм 101+Бациспецин БМ было сравнимо с химическим протравителем ТМТД (табл. 3.2). Клубенькообразующая активность штаммов 12 и 101 при автономных обработках на сорте гороха Альфа была низкой, но в сочетании этих штаммов с препаратом Бациспецин БМ она увеличилась: растения сформировали в среднем по 9 клубеньков. Причиной положительного влияния препарата Бациспецин БМ на активизацию нодуляции могла являться продукция гидролитических ферментов штаммом Bacillus sp. 739. Ранее было показано (Морозов и др., 1994), что штамм Bacillus sp. 739 при взаимодействии с растениями пшеницы частично повреждал колеоризу, не вызывая системного патогенного эффекта. Позже у этого штамма была обнаружена активность ферментов хитиназы и -1,3-глюканазы (Актуганов и др., 2007). Возможно, гидролитические ферменты могли опосредованно влиять на повышение восприимчивости растительных тканей к ризобиальной инфекции.
Анализ связи дозы вносимых эндофитов на семена бобовых растений с разным уровнем продукции фитогормонов бактериями
В полевых экспериментах по инокуляции бобовых растений эндофитными бактериями были установлены как положительные, так и отрицательные эффекты инокуляции семян эндофитами на рост и продуктивность растений. Благоприятное влияние бактерий на рост и развитие растений, как правило, связано с активацией прорастания и ускорением формирования органов. Известно, что многие ризосферные бактерии продуцируют фитогормоны (Glick, 2012; Egamerdieva et al., 2017; Olanrewaju, Babalola, 2017). Выявлены некоторые закономерности между соотношением гормонов и определенным типом архитектуры корня и побега в постэмбриональном развитии растений (Zamioudis et al., 2013; Lee et al., 2018). Тесная взаимосвязь эндофитных бактерий с растением обуславливает их непосредственное влияние на эндогенные процессы, ведущие к модуляции скорости и степени развития первичных и боковых корней, изменению пространственной конфигурации корня, определяющей и архитектуру побега растения (Verbon, Liberman, 2016; Кошкин, 2017). Вместе с тем остаются неясными вопросы, связанные с вкладом эндофитных бактерий, продуцирующих различный уровень фитогормонов, в продукционный процесс инокулированных растений. В связи с этим представляло интерес:
а) изучение фитотоксической (ростовой) реакции разных видов растений на инокуляцию эндофитными бактериями;
б) определение уровня продукции бактериями фитогормонов и их влияние на рост и гормональный баланс растений гороха;
в) выявление связи морфометрических показателей инокулированных проростков гороха с продукционным процессом в различных условиях среды.
Решению этих задач посвящена данная глава.
Для унификации возрастного состояния растений в стадии проростка морфометрические параметры измеряли (корень и эпикотиль/гипокотиль) на разные сутки от замачивания семян. При инокуляции растений гороха три из четырех испытанных штаммов В. megaterium 511, 512 и 521 способствовали увеличению длины корня на 29-43% по сравнению с контролем, один штамм (В. megaterium 512) стимулировал рост эпикотиля на 43%. Но в двух вариантах обработок штаммами В. megaterium 521 и В. subtilis 522 снизилась энергия прорастания. У растений редиса инокуляция всеми исследованными штаммами оказала незначимое по сравнению с контролем влияние на длину корня, один штамм В. megaterium 521 подавлял рост гипокотиля на 29 % по сравнению с неинокулированными проростками. Энергия прорастания инокулированных растений редиса тоже уменьшилась по сравнению с контролем. Ростовые параметры инокулированных растений огурца не изменились по сравнению с контролем, энергия прорастания уменьшилась. При взаимодействии с растениями томата отмечено ухудшение ростовых показателей у проростков, инокулированных штаммом В. megaterium 512. Соотношение побег/корень у инокулированных проростков мало изменялось по сравнению с контролем и зависело от особенностей прорастания конкретного вида растений. Таким образом, эндофитные бактерии, выделенные из клубеньков фасоли, оказали благоприятное влияние на ростовые показатели другого бобового растения - гороха, а при взаимодействии с другими видами растений влияние на ростовые параметры было либо нейтральным, либо отрицательным. Результаты этих экспериментов свидетельствуют о видоспецифическом действии эндофитных бактерий, природа которого пока не ясна.
При изучении 29 выделенных из пшеницы штаммов В. subtilis выяснили, что рост корней и побегов зависит не только от вида растения, но и от дозы (плотности) бактерий в инокулюме. На «своем» растении-хозяине -пшенице - при внесении бактерий на семена в потности 107 клеток/семя 27 штаммов стимулировли рост корня на 210% в сравнении с контролем. При повышении титра клеток бактерий до 108 клеток/семя только половина бактериальных штаммов обеспечила прибавку роста корня в среднем 117%.
А плотность бактерий 109 клеток/семя привела к уменьшению длины корня по сравнению с контролем в 1,9 раза во всех вариантах бактериальных обработок (рис. 3.9).
Теми же штаммами инокулировали семена рапса (рис. 3.10). Из проверяемых 29 штаммов всего 4 штамма оказывали стимулирующее влияние на рост корня на 18-55% от контроля при каждой дозе вносимых бактерий, при этом дозы стимулирующих рост растений штаммов были разными. В целом, по сравнению с растениями пшеницы доза-зависимый эффект на растениях рапса был менее выражен.
В экспериментах по инокуляции растений гороха эндофитами пшеницы (табл. 3.38) только 2 из 9 штаммов B. subtilis при внесении их в суспензии 105 кл./семя стимулировали рост корня по сравнению с контролем на 21% и 40% и один из них – рост эпикотиля. При повышении плотности клеток бактерий в инокулюме до 107 клеток/семя четыре штамма вызвали торможение роста корня. Таким образом, положительное влияние эндофитов пшеницы, внесенных в плотности 107 клеток/семя, на рост «своего» хозяина не оказало подобного действия на рост проростков гороха.
В литературе также отмечено, что высокая плотность клеток эндофитных бактерий или их метаболитов в инокулюме может тормозить рост обработанных ими семян бобовых растений. Например, инокулированные растения вигны Vigna cylindrica снижали ростовую активность при внесении бактерий рода Bacillus в плотности 109 КОЕ/мл и стимулировали – в плотности 107 КОЕ/мл (Чан, Егоров, 2011). Штамм Streptomyces griseoflavus P4 аналогично действовал на рост сои (Htwe, Yamakawa, 2016). При изучении инокуляции штаммом B. thuringiensis KR-1 семян гороха и чечевицы тоже был обнаружен доза-зависимый эффект, влияющий на рост и клубенькообразующую активность: оптимальной являлась плотность бактерий 106 КОЕ/мл, а повышене или снижение ее на порядок приводило к ингибирование роста и нодуляционной активности (Mishra et al., 2009). Ростовые параметры проростков арабидопсиса менялись в зависимости от расстояния вносимых бактерий B. amyloliquefaciens IN937a и B. subtilis GB03 от корней, определяющего концентрацию бактериальных метаболитов (Ryu et al., 2005).
Торможение роста корней, возникающее с увеличением бактериальной нагрузки на растение, могло быть связано с восприятием растением соединений, определяющих так называемое чувство кворума («quorum sensing») и вызывающих защитные реакции (Hartmann et al., 2014), а также с продукцией бактериями ИУК, так как известно, что соединение с ауксиновой активностью 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д) в высоких концентрациях ингибирует рост двудольных растений, в том числе и гороха.
Анализ продукции ИУК штаммами B. subtilis и взятого в качестве контроля типичной для гороха симбиотической бактерии R. leguminosarum штамма 1078, показал (рис. 3.11), что бацилльные штаммы синтезировали этот гормон в концентрациях 1,57-5,18 мкг/мл (10-6 – 510-5 моль/л) при добавлении в среду 100 мкг триптофана. Наименьшим уровнем продукции ИУК характеризовался штамм R. leguminosarum 1078 – 1,1 мкг/мл.
Разработка методологических и биотехнологических подходов к оптимизации растительно-микробных взаимоотношений для повышения их адаптивного потенциала
Производство безопасной для человека и окружающей среды продукции сельского хозяйства является одной из актуальных проблем. Безусловно, она может быть решена на основе управления фитобиомом - сложной системой, включающей сельскохозяйственные растения, почву, условия среды, насекомых-вредителей и другие экологические факторы. Одной из малоизученных подсистем фитобиома является микробиом эндофитных бактерий, способных проникать внутрь растений, тесно и бессимптомно сосуществовать с растением-хозяином, заполняя его внутренние ниши. Бактериальный метагеном, или иначе холо-геном, существенно дополняет функциональные возможности растения. Эндофитные бактерии способны к азотфиксации, фосфатмобилизации, продукции сидерофоров, фитогормонов, сигнальных факторов, запускающих иммунитет растений, деструкции или обезвреживании химических токсикантов (пестициды, тяжелые металлы). Эти свойства бактерий помогают содержащим их растениям противостоять вызовам окружающей среды.
Однако одомашнивание и интродукция видов и сортов культурных растений в новые местообитания, обеднение биоразнообразия почвенной микробиоты вследствие интенсивного сельскохозяйственного производства разрывают эволюционно сложившиеся взаимоотношения растений с эндофитным микробиомом, ухудшают их способность эффективно использовать этот ресурс (Hale et al., 2014, Perez-Jamollo et al., 2016). Многие новые сорта не формируют симбиотические связи с полезной эндофитной микрофлорой, так как эти признаки не находятся в фокусе внимания селекционеров. Но даже самые сбалансированные по полезным хозяйственным качествам генотипы растений не могут быть идеальными в разнообразных условиях среды: высокая устойчивость к одним фитопатогенам может сопровождаться уязвимостью по отношению к другим, эффективный ответ на одни стрессоры может быть бесполезным по отношению к другим. Поэтому активизация симбиотических связей с микроорганизмами, умение «рекрутировать» нужные функции бактерий фитобиома являются важной адаптивной стратегией для растений (рис. 22).
Инокуляция семян эндофитными бактериями, обладающими полезными для растений свойствами, может в определенной степени повысить продуктивность и стрессоустойчивость растений безопасным для окружающей среды и экономически недорогим способом, что особенно актуально в современных условиях остроты экологической, энергетической и продовольственной проблем. Следует отметить, что микробиологические препараты давно используются в растениеводстве. Но для бобовых растений созданы они на основе клубенькообразующих бактерий, а также эпифитных ростстимулирующий бактерий полифункционального действия. Эндофитные бактерии стали предметом пристального внимания лишь в последнее десятилетие. Преимущество эндофитных бактерий в том, что они в большей степени защищены растением, избавлены от конкуренции с аборигенной микрофлорой и благодаря тесным взаимоотношениям с макросимбионтом способны изнутри влиять на метаболизм растения.
Результаты проведенной нами экспериментальной работы показали, что в каждом исследуемом растении гороха и фасоли были обнаружены эндофитные бактерии с разнообразной физиологической активностью, которая может быть полезной для повышения адаптивных свойств растений.
Выявлено, что перспективным источником выделения штаммов-кандидатов для бобовых растений являются корневые клубеньки, в которых обнаружена высокая вероятность встретить ЭБ c необходимыми свойствами: стимуляция роста растений, подавление фитопатогенов, деструкция ксенобиотика, индукция устойчивости к стрессу и др.
Идея использовать для инокуляции не только отдельные штаммы, как это принято теоретически и на практике, но и интактные микробиомы бактерий, сосуществующие с ризобиями в клубеньках, привела к повышению устойчивости и продуктивности бобовых растений в стрессовых условиях среды. Отобранные по сохранности в микробиоме ризобий ассоциации (Ф4, Ф5, Ф6) несколько лет сохраняли постоянство состава и способность повышать продуктивность и устойчивость определенных сортов растений. Селекция природных бактериальных ассоциаций клубеньков, сохраняющих свой состав и активность при длительном хранении in vitro, позволяет, с одной стороны найти совместимые друг с другом бактерии, а с другой облегчает хранение и воспроизводство необходимых штаммов бактерий. В этой связи актуальной является задача поддержания в коллекциях не только чистых культур бактерий, но природных бактериальных консорциумов. Эта мысль была высказана позже и другими исследователями (Калакуцкий, 2017). В случае эндофитных бактерий возникает потребность следующего уровня -сохранение в коллекциях не только ассоциаций культивируемых видов бактерий на микробиологических средах, но и микробиома некультивируемых видов в культурах тканей растений - подход, который требует дальнейшей научной и технологической проработки.
Общепринятой стратегией в селекции ростстимулирующих бактерий является поиск суперпродуцентов фитогормонов или стимуляторов роста растений. Однако в процессе нашего исследования было выявлено, что штаммы с высоким уровнем продукции ИУК и активирующие рост растений пшеницы, при взаимодействии с растениями гороха оказывались неэффективными или стимулировали рост и урожайность только при инокуляции в строго определенных невысоких дозах. Следовательно, сложно подобрать универсальный штамм для любого вида и сорта растений, еще сложнее технически обеспечить такое высокоточное нанесение эндофтных бактерий на семена. Это вызывает необходимость заблаговременного капсулирования семян определенными штаммами бактерий в подобранных дозах.
Для определения оптимальных доз эндофитных бактерий и анализа механизмов опосредованного бактериями изменения гормонального статуса растений гороха целесообразно учитывать выявленный пороговый уровень экзогенного поступления ИУК и активность ферментов, участвующих в ее метаболизме/катаболизме, как, например, ИУКО, в корнях трехсуточных растений. Важным аспектом, требующим внимания, являются обнаруженные сортовые и видовые различия в отзывчивости бобовых растений на инокуляцию, индивидуальная реакция растений на дозы вносимых штаммов. В этой связи перспективными являются исследования, выявляющие физиологические механизмы такой специфичности. Маркерами физиологического состояния растений в ответ на инокуляцию ЭБ, могут служить показатели реакций фитоиммунитета, например, содержание пролина, малонового диальдегида, аскорбиновой кислоты и другие.
Многолетние полевые эксперименты показали, что максимальный эффект от применения препаратов на основе эндофитных бактерий достигается в стрессовых условиях среды. В агроклиматических условиях Южного Урала были установлены дифференцированные реакции сортов бобовых растений в ответ на колебания биотических и абиотических факторов. По величине варьирования признаков продуктивности были охарактеризованы разные сорта растений и определены их «слабые» адаптивные признаки, которые могут быть улучшены путем подбора комплементарных штаммов эндофитных бактерий.