Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Генетический банк in vitro как способ сохранения биологического разнообразия растительного мира 15
1.1. Основные пути сохранения разнообразия растительного мира, их
преимущества и недостатки 16
1.1.1. Особо охраняемые природные территории 17
1.1.2. Генетические банки
1.1.2.1. Полевые генные банки 18
1.1.2.2. Банки семян 20
1.2. Теоретические основы создания генетического банка in vitro 21
1.2.1. Клональное микроразмножение растений 22
1.2.1.1. Состав питательной среды 25
1.2.1.2. Выбор экспланта 29
1.2.1.3. Введение эксплантов в культуру in vitro 31
1.2.1.4. Собственно микроразмножение 34
1.2.1.5. Укоренение побегов 36
1.2.1.6. Подготовка регенерантов к условиям выращивания in vivo 40
1.2.2. Оценка уровня генетического разнообразия природных популяций 43
1.3. Решение проблемы сохранения биоразнообразия растений флоры
Саратовской области 46
Глава II. Материалы и методы 49
2.1. Объекты исследований 49
2.1.1. Silene cretacea 49
2.1.2. Potentilla volgarica 51
2.1.3. Tulipa gesneriana [= T. schrenkii, T. suaveolens] 52
2.1.4. Другие представители флоры 54
2.2. Методы биотехнолгии растений 57
2.2.1. Базовый состав питательных сред 57
2.2.2. Стерилизация инструментов и растительного материала 58
2.2.3. Условия культивирования и варианты экспериментов 58
2.2.4. Морфо-гистологический анализ 60
2.2.5. Методика укоренения регенерантов 60
2.2.6. Методика адаптации регенерантов к нестерильным условиям 61
2.2.7. Методика изучения семенной продуктивности 61
2.2.8. Методика депонирования для создания коллекции in vitro 62
2.2.9. Статистическая обработка результатов 63
2.3. Инокуляция эксплантов ризобактериями и методы, подтверждающие
колонизацию корней 63
2.3.1. Инокуляция бактериями 63
2.3.2. Микробиологический тест 64
2.3.3. Иммунодиффузия 64
2.3.4. Иммунофлуоресцентное микроскопическое выявление бактерий на корнях растений 65
2.3.5. Иммуноферментное выявление бактерий на корнях растений 65
2.3.6. Морфометрические параметры эксплантов 65
2.4. Молекулярно-генетический анализ 66
2.4.1. Выделение ДНК из растительных тканей 66
2.4.2. Полимеразная цепная реакция 66
2.4.3. Статистическая обработка данных 67
Глава III. Использование методов биотехнологии для сохранения редких и исчезающих видов растений в культуре in vitro 68
3.1. Особенности регенерации побегов Silene cretacea и их последующей адаптации к нестерильным условиям 68
3.1.1. Подбор регуляторов роста 68
3.1.2. Морфогенез 76
3.1.3. Укоренение 78
3.1.4. Адаптация к нестерильным условиям in vivo 81
3.1.5. Обсуждение 81
3.1.6.Заключение 90
3.2. Микроразмножение Potentilla volgarica и семенная продуктивность растений-регенерантов ex vitro 90
3.3. Размножение других охраняемых видов Саратовской области в культуре in vitro 3.3.1. Allium regelianum 99
3.3.2. Tamarix laxa и T. ramosissima 105
3.3.3. Представители семейства Fabaceae 109
3.3.4. Представители семейства Asteraceae 113
3.3.5. Другие представители коллекции 116
3.3.6. Заключение 117
Глава IV. Коллекция редких и исчезающих видов растений саратовской области в условиях замедленного роста 118
4.1. Silene cretacea 118
4.2. Potentilla volgarica 121
4.3. Другие представители флоры 123
4.4. Заключение 125
Глава V. Межпопуляционная изменчивость Tulipa gesneriana L. по данным issr маркирования 126
5.1. Анализ ISSR 126
5.2. Популяционная структура 127
5.3. Заключение 137
Выводы 139
Список использованной литературы
- Банки семян
- Tulipa gesneriana [= T. schrenkii, T. suaveolens]
- Микроразмножение Potentilla volgarica и семенная продуктивность растений-регенерантов ex vitro
- Другие представители флоры
Введение к работе
Актуальность темы. Глобальное изменение климата, экологические
катастрофы, войны и антропогенное воздействие приводят к уничтожению растительного генофонда. Потеря любого вида или его популяции – невосполнимый урон биологическому разнообразию Земли. Поэтому сохранение биологического разнообразия вошло в пятерку основных экологических проблем XXI века [Наше общее будущее, 1989; Конвенция…, 1995; Европейская…, 2003].
Наряду с традиционными способами сохранения биоразнообразия растительного мира, такими как создание особо охраняемых природных территорий, культивирование коллекций растений в ботанических садах и создание банка семян, в настоящее время широко используются методы биотехнологии растений, в том числе поддержание культур редких видов на питательной среде в генетических банках in vitro [Engelmann, 1997; Hammer et al., 2003; Белокурова и др., 2005; Молканова и др., 2010]. Однако прежде чем система in vitro может быть приспособлена для сохранения генофонда, она должна удовлетворять ряду требований, важнейшими из которых являются: введение материала в культуру in vitro, разработка эффективного способа регенерации растений для каждого закладываемого на хранение образца и генетическая стабильность [Вечернина, 2006; Молканова, 2010, 2015; Митрофанова, 2011; Генофонд…, 2012].
Несмотря на то, что в настоящее время существует множество работ, посвященных сохранению редких и исчезающих видов растений с использованием метода клонального микроразмножения [Вечернина, 2006; Новикова и др., 2008; Теплицкая и др., 2008; Мухаметвафина, Ахметова, 2011; Агеева и др., 2012; Ветчинкина и др., 2012; Доан и др., 2012; Жолобова, 2012; Соколов и др., 2013], многие из таких видов не введены в культуру in vitro, оставаясь малоизученными или не изученными вовсе в этом отношении.
Известно, что отбор образцов охраняемых видов растений ex situ целесообразно проводить с учетом данных об уровне и характере генетического разнообразия вида [Хадеева и др., 2011, 2012]. В этом отношении особый интерес представляет тюльпан Геснера (Tulipa gesneriana L.), разнообразный морфологически по окраске и размеру цветков, наличию или отсутствию пятна в основании цветка, форме бокала и листочков околоцветника. Для эффективного сохранения растений этого вида ex situ необходимо определить, полиморфен ли он генетически и какое количество генотипов является достаточным, чтобы охватить спектр его изменчивости на территории Саратовской области.
Цель исследования: разработать высокоэффективные протоколы
микроразмножения и сохранения in vitro наиболее уязвимых охраняемых растений флоры Саратовской области и провести анализ популяционного разнообразия сокращающегося в численности вида тюльпан Геснера.
Для достяжения этой цели были поставлены следующие задачи:
1. На примере Silene cretacea показать целесообразность использования ростстимулирующих ризобактерий Azospirillum brasilense Sp245 и методов
комбинаторики для оптимизации протокола микроразмножения и сохранения исчезающих видов растений в культуре in vitro;
-
Провести морфо-гистологический анализ процессов регенерации Silene cretacea и на его основе доказать, что формирование микропобегов в разработанной системе in vitro происходит путем прямого органогенеза;
-
Выявить условия индукции побего- и корнеобразования для эффективного введения в культуру in vitro Potentilla volgarica и других редких видов кальцефилов;
-
На примере Potentilla volgarica провести анализ семенной продуктивности растений, полученных в результате микроразмножения in vitro, и оценить возможность их использования для восстановления численности природных популяций;
-
Создать медленно растущую коллекцию in vitro как резервный фонд редких и исчезающих растений флоры Саратовской области;
-
Оценить уровень межпопуляционной изменчивости Tulipa gesneriana на территории Саратовской области с помощью метода молекулярно-генетического маркирования для последующего сохранения всего разнообразия контрастных генотипов в культуре in vitro.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Разработанная нами система репродукции in vitro (патент № 2552174 C1) является эффективной для ряда исчезающих кальцефильных растений (Silene cretacea, S. hellmanii, Anthemis trozkiana, Globularia punctata, Hyssopus cretaceous, Scrophularia sareptana, Centaurea kasakorum, C. ruthenica) и позволяет управлять продуктивностью этих объектов при решении задач введения в культуру или восстановления численности в природных популяциях.
-
С точки зрения межпопуляционной изменчивости образцы Tulipa gesneriana, собранные в различных районах Саратовской области, образуют два кластера с большой степенью сходства внутри каждого из них. Отбор материала для сохранения вида ex situ с охватом всего спектра генетического разнообразия вида в регионе целесообразно производить с растений этих двух контрастных генетических групп: 1 – особи, произрастающие на территории Балаковского, Пугачевского и Федоровского районов; 2 – особи, произрастающие на территории Александрово-Гайского, Дергачевского, Энгельского, Красноармейского, Новоузенского, Озинского, Перелюбского, Ровенского, Советского, Саратовского и Вольского районов Саратовской области.
Научная новизна. Впервые в культуру in vitro введена Potentilla volgarica – эндемичный вид, находящийся под угрозой исчезновения. Определены условия стерилизации семян, влияние трофических и гормональных факторов на этапах микроразмножения, укоренения и длительного депонирования с целью сохранения вида in vitro. Растения-регенеранты реинтродуцированы в природные условия с целью создания искусственных популяций и восстановления численности. Впервые для подбора оптимальных концентраций регуляторов роста растений на этапе микроразмножения использован математический метод ладейного многочлена. Выявлены корреляции между концентрациями отдельных фитогормонов и морфогенетическим ответом культуры in vitro. Впервые с использованием
молекулярно-генетического (ISSR) анализа изучена межпопуляционная
изменчивость природных популяций Tulipa gesneriana и выявлены основные контрастные генотипы, сохранение которых ex situ необходимо в первую очередь как генотипов, наиболее полно представляющих спектр полиморфизма растений вида на исследованной территории.
Практическая значимость работы. Результаты исследований позволяют
расширить представления о клеточных механизмах морфогенеза и регенерации
растений при микроклональном размножении in vitro, а также об адаптации их к
нестерильным условиям; вносят вклад в разработку моделей подбора оптимальных
соотношений фитогормонов в составе питательной среды и в решение такой
фундаментальной проблемы как механизмы растительно-микробных симбиозов.
Полученные данные позволяют оптимизировать метод микроклонального
размножения in vitro для массового получения посадочного материала редких видов
растений в целях восстановления численности природных популяций, создания
коллекций in vitro, реинтродукции и зеленого строительства. Полученные
результаты используются в учебном процессе кафедр ботаники, генетики,
микробиологии и физиологии растений Саратовского национального
исследовательского университета имени Н.Г. Чернышевского, а также в работе
лаборатории микроклонального размножения учебно-научного центра
«Ботаническитй сад» СГУ им. Н.Г. Чернышевского.
Связь работы с научными программами. Работа выполнена по теме Минобрнауки России в рамках базовой части государственного задания в сфере научной деятельности по Заданию № 2014/203, код проекта 1287, при частичной финансовой поддержке гранта РФФИ № 16-04-00142 «Исследование состояния и структуры популяций Tulipa gesneriana L. на европейской части России».
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены в устных и
стендовых докладах на конференциях: VI и VII Региональная научная конференция
«Исследования молодых ученых в биологии и экологии» (Саратов, 2014, 2015); VIII
Всероссийская научно-практическая конференция «Аграрная наука в XXI веке:
проблемы и перспективы» (Саратов, 2014); XXI Международная конференция
студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов – 2014» секция «Биология»
(Москва, 2014); I Региональная и II Всероссийская научно-практические
конференции «Особо охраняемые природные территории Саратовской области:
прошлое, настоящее, будущее» (Хвалынск, 2014, 2015); VI Международная научно-
практическая конференция «Биотехнология как инструмент сохранения
биоразнообразия растительного мира (физиолого-биохимические,
эмбриологические, генетические и правовые аспекты) (Ялта, 2014); Международная
научно-практическая конференция «Вавиловские чтения» (Саратов, 2014, 2015);
II Международная научная конференция «Генетика и биотехнология XXI века:
проблемы, достижения, перспективы» (Минск, 2015); III Международная
конференция «Генетика, геномика, биоинформатика и биотехнология растений»
(Новосибирск, 2015); V Международная школа для молодых ученых «Эмбриология,
генетика и биотехнология» (Санкт-Петербург, 2016).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 28 работ, в том числе 5 статей в рецензируемых журналах из списка, рекомендованного ВАК МОН РФ, патент на изобретение и монография.
Декларация личного участия автора. Автор лично провел в 2012-2016 гг. экспериментальные исследования по плану, согласованному с научным руководителем. Все манипуляции с живой культурой тканей и органов растений in vitro, полимеразная цепная реакция и оформление полученных данных осуществлены автором. Доля личного участия автора в подготовке и написании совместных публикаций составляет более 50%.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из списка сокращений, введения, пяти глав, заключения, выводов, списка литературы и приложения, изложена на 183 страницах, в том числе 120 страницах основного текста, иллюстрирована 37 рисунками и 24 таблицами. Список литературы включает 354 работы, в том числе 193 – на иностранных языках.
Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю – проф., д.б.н. А.С. Кашину за неоценимую методическую помощь и ценные консультации на всех этапах выполнения работы, сотрудникам лаборатории иммунохимии ИБФРМ РАН (г. Саратов) к.б.н. Г.Л. Бурыгину, к.б.н. Н.В. Евсеевой и д.б.н. С.Ю. Щеголеву за всестороннюю помощь при выполнении части работы, связанной с культурой бактерий Azospirillum brasilense Sp245, и д.б.н. И.А. Шанцеру (Гербарий ГБС им. Н. В. Цицина РАН, г. Москва) за помощь в проведении статистической обработки молекулярно-генетических данных.
Банки семян
Особо охраняемые природные территории (ООПТ) – объемные участки биосферы, которые полностью или частично, постоянно или временно исключены из традиционного интенсивного хозяйственного оборота. Такие территории, прежде всего, создаются для поддержания целесообразного экологического [естественного] равновесия биосферы и ее подразделений, а также среды жизни и здоровья людей. К ним относятся национальные парки, заповедники, памятники природы, заказники, территории запретных и защитных лесных зон [Реймерс, Штильмарк, 1978].
Ряд российских ботанических садов принимает активное участие в программах по сохранению растений in situ. Они разрабатывают предложения по выделению территорий и участков растительности в качестве зон с различным уровнем государственной охраны, участвуют в изучении флоры и растительности охраняемых территорий, проводят работы по рекультивации техногенных ландшафтов, реинтродукции редких и исчезающих видов растений и т.д. [Андреев, Горбунов, 1997].
Преимуществом ООПТ является сохранение не отдельно взятых видов, а экосистемы в целом. К недостаткам можно отнести то, что в условиях глобального изменения климата наиболее консервативные виды растений, чувствительные к флуктуациям факторов внешней среды, могут выпадать из естественных фитоценозов даже в переделах ООПТ. Поэтому необходим регулярный мониторинг и создание «страхового» фонда ex situ. 1.1.2. Генетические банки
Эффективность сохранения генофонда растений ex situ может быть резко повышена путём создания генетических банков растений. По классификации Международного центра генетических ресурсов различают следующие виды генетических банков: 1 - генные банки семян; 2 - полевые генные банки (специальные, обычно клоновые, посадки плодовых и лесных пород, корневищных и клубневых культур); 3 - хранение растительного материала in vitro (культур меристем, тканей и сеянцев в условиях замедленного роста) [Вечернина, 2006; Молканова и др., 2010; Митрофанова, 2011; Генофонд…, 2012; Молканова и др., 2015].
Крупнейшими генетическими банками ex situ в мире являются (Hawkes et al., 2000; Brner et al., 2015): Institute of Crop Germplasm (Китай) (300 000 образцов), National Seed Storage Laboratory (США) (268 000 образцов) и N.I. Vavilov Research Institute of Plant Industry (Россия) (177 680 образцов).
Основу системы сохранения биоразнообразия дикорастущих растений России ex situ составляют ботанические сады и дендрарии. В их коллекциях представлено около 1/3 флоры страны [Молканова и др., 2010; Генофонд…, 2012]. В течение длительного исторического периода приоритетным направлением в деятельности ботанических садов была интродукция и акклиматизация растений, изучение и мобилизация генетических ресурсов полезных растений. Это направление сохраняет важную позицию и в настоящее время [Особо…, 2012]. Особое внимание уделяется охране в условиях культуры редких видов растений. Крупные коллекции редких и исчезающих растений России созданы в ряде российских ботанических садов (БС): в БС Ботанического института имени В.Л. Комарова (БИН РАН) (118 видов), БС Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова (113 видов), на Пятигорской эколого-ботанической станции БИН РАН (110 видов), в ГБС РАН (103 вида), Сахалинском БС (80 видов) и др. Ботаническими садами накоплен значительный практический опыт выращивания редких растений. Наметились и получили развитие оригинальные методические подходы к сохранению редких видов в условиях ex situ, например: создание искусственных ценозов (ГБС РАН, Центральный сибирский БС Сибирского отделения РАН, БС Уральского отделения РАН); метод воссоздания и интродукции растительных сообществ (Ставропольский БС); метод внедрения исчезающих видов в естественную растительность ботанических садов (Полярно-альпийский БС-институт Кольского научного центра РАН) и другие [Генофонд…, 2012].
Несмотря на успехи, достигнутые ведущими ботаническими садами в области выращивания растений в культуре, охрана исчезающих видов ex situ в форме сохранения образцов в искусственных условиях несет в себе ряд недостатков, которые обусловлены следующими причинами: - небольшим числом особей, выживающих в культуре; - методически неверным отбором образцов для переноса в культуру, не обеспечивающим достаточную репрезентативность охраняемого генофонда; - увеличением вероятности ауткроссинга, ведущего к понижению или полной потере фертильности или к гомозиготности; - ограниченным генетическим разнообразием материала, полученного при вегетативном размножении; - неспособностью к выживанию многих растений в культуре, особенно в искусственно созданных условиях, например, в оранжереях [Новикова и др., 2008]. Эти причины почти неизбежно приводят к той или иной степени генетической эрозии сохраняемого в культуре таксона. Однако тщательный отбор исходного материала, обеспечивающий максимально возможное сохранение генотипического разнообразия, точная документация, использование в скрещиваниях различных линий и клонов, достаточная пространственная изоляция охраняемых коллекционных фондов могут обеспечить существенное снижение степени этой эрозии [Генофонд…, 2012].
Tulipa gesneriana [= T. schrenkii, T. suaveolens]
Руководствуясь правилами сбора редких и находящихся под угрозой исчезновения видов растений для ботанических садов, материалом для ввода в культуру in vitro выбрали зрелые семена растений [Горбунов и др., 2008], так как они обеспечивают максимальный охват существующей генотипической изменчивости в популяциях и частичное их изъятие не наносит существенный урон популяции. Исключение составили Tamarix laxa и Thymus cimicinus, которые вводили в культуру in vitro сегментами побегов с 2-3 пазушными почками.
В качестве модельных объектов исследования процессов регенерации и подбора условий культивирования in vitro были выбраны Silene cretacea и Potentilla volgarica, а для изучения молекулярно-генетического полиморфизма - Tulipa gesnenana.
Смолёвка меловая [Silene cretacea, Caryophyllaceae] - приземистый полукустарничек 5-30 см высотой, с многочисленными стеблями, одревесневающими в основании (рис. 1). Листья линейные, шероховатые по краям, иногда изогнутые. Корневая система стержневая на протяжении всей жизни растения. Цветёт в мае-июле. Плод - коробочка. Размножение исключительно семенное [Цвелев, 2004; Девятов, 2008]. Silene cretacea была обнаружена на территории Красноармейского района Саратовской области в 2008 году сотрудниками Саратовского государственного университета имени Н.Г. Чернышеского [Невский и др., 2009]. До этого вид не отмечался на территории области более 150 лет, поэтому не вошел во второе издание «Красной книги Саратовской области». Занесена в Красную книгу Российской Федерации [2008] со статусом «Зв» - вид с узкой экологической амплитудой (эндемик Восточной Европы и Казахстана), рекомендована к включению в третье издание Красной книги Саратовской области со статусом «вид, находящийся на грани исчезновения» [Невский и др., 2009], а также входит в список особо охраняемых растений Европы [Council..., 1992; Bilz et al., 2011].
В прикладном аспекте S. cretacea интересна тем, что является перспективным источником 2-дезоксиэкдизона и других веществ из класса фитоэкдистероидов - полигидроксилированных стеринов, структурно идентичных и близких гормонам линьки членистоногих. Эти вещества обладают широким спектром физиологической активности, малой токсичностью и отсутствием гормонального действия по отношению к млекопитающим [Baltaev, 2000; Dinan, 2001; Tuleuov et al, 2014]. Доказано, что фитоэкдистероиды обладают противогрибковым, анаболическим, гипогликемическим, гепатопротекторным, тонизирующим действиями, некоторые из них проявляют противоопухолевые и радиопротекторные свойства [Zibareva, 2000; Bthori et al, 2008]. 27.2 Potentilla volgarica
Лапчатка волжская [Potentilla volgarica, Rosaceae] - травянистый многолетник 15-20 см высотой с дважды перистыми листьями, рассеченными на очень узкие сегменты, внизу тонко войлочно-опушёнными. Корень стержневой, в верхней части утолщенный, с возрастом разделяющийся на каудексы (рис. 2). Цветёт в мае. Возможно повторное цветение во второй половине лета или осенью. Плод - многоорешек. Размножение семенное [Красная книга..., 2006; Красная книга..., 2008].
Potentilla volgarica является узколокальным кальцефильным эндемиком Приволжской возвышенности и имеет категорию «1» - вид, находящийся под угрозой исчезновения - как в Красной книге Саратовской области [2006], так и в Красной книге Российской Федерации [2008]. В настоящее время вид сохраняется на территории национального парка «Хвалынский» и памятника природы «Мухин дол» в Вольском районе [Серова, Березуцкий, 2008], а также культивируется на участках открытого грунта учебно-научного центра «Ботанический сад» СГУ имени Н.Г. Чернышевского.
Так как смолёвка и лапчатка представлены на территории Саратовской области единичными популяциями, в качестве модельного объекта для изучения молекулярно-генетического полиморфизма был выбран Тюльпан Геснера (рис. 3.), представленный в области относительно большим числом популяций.
Тюльпан Геснера {Tulipa gesneriana L. = Т. schrenkii Regel [Мордак, 1990], Т. suaveolens Roth [Zonneveld, 2009; Everett, 2013]) - луковичный поликарпик, эфемероид, является высоко декоративным охраняемым видом, занесенным в Красную Книгу РФ и имеющим тенденцию к сокращению численности на территории Российской Федерации [Литвинская, 2008], в т.ч. и в Саратовской области [Худякова, Давиденко, 2006]. Вид распространён в южной России, в степях южного Прикаспия, Крыма, Армении, Кавказа, в Казахстане от восточных до западных границ, на северной границе озёр Арал и Балхаш [Everett, 2013]. На территории Саратовской области Т. gesneriana находится вблизи северной границы своего ареала в европейской части России. Размножается дикорастущий Т. gesneriana исключительно семенами, вегетативное размножение зарегистрировано только в культуре [Литвинская, 2008].
Плоские семена тюльпанов лежат в трехгнездной коробочке шестью стопками и распространяются ветром или потоками воды [Бочанцева, 1962]. По-видимому, большая часть семян рассеивается на незначительное расстояние от материнского растения. Об этом свидетельствует множество всходов вокруг него, что было отмечено нами при сборе материала. Опыляются тюльпаны мелкими мухами и пчёлами [Литвинская, 2008], которые, вероятно, не обеспечивают перенос пыльцы на большие расстояния. Важным фактором, способствующим генетической дифференциации популяций тюльпанов является способность их к апомиксису - развитию семян без оплодотворения. Т. gesneriana свойственна адвентивная эмбриония, т.е. развитие диплоидного зародыша непосредственно из соматической клетки ткани семязачатка [Bambacioni-Mezzetti, 1932; Beth, 1938; Хохлов и др., 1978].
Сбор материала (листьев) проводили в природных популяциях Т. gesneriana в 2013 и 2014 гг. в 16 районах Саратовской области и 2 районах Волгоградской области (рис. 4). В результате собрано 200 образцов, представляющих 18 популяций, обозначенных в соответствии с табл. 1. Число собранных образцов на популяцию варьировало от 8 до 17, в зависимости от разнообразия окраски околоцветника.
Микроразмножение Potentilla volgarica и семенная продуктивность растений-регенерантов ex vitro
Доля стерильных эксплантов при использовании изложенной выше методики стерилизации (см. гл. 2, п. 2.2.2) составила 100%. Прорастание сеянцев S. cretacea наблюдали на 4-30 сутки культивирования. Процент нежизнеспособных семян составил в среднем 20%.
Таким образом, применение бытового NaOCl в качестве стерилизующего агента, являющееся экономически выгодным и часто используемым для дезинфекции семян различных систематических групп (см. гл. 1, п. 2.1.3), целесообразно при стерилизации семян S. cretacea. При этом выход обеззараженных эксплантов S. cretacea при использовании NaOCl не уступал количеству, полученному с использованием в качестве стерилизующего агента препарата «Лизоформин-2000», рекомендованного по литературным данным [Жолобова, 2012].
Через 30 суток культивирования проростки эксплантировали на среду MS с добавлением следующих вариантов цитокининов: БАП 0.5 мг/л, КН 0.5 мг/л, зеатин 0.5 мг/л или 2-ip 0.5 мг/л.
При культивировании S. cretacea на питательной среде MS с БАП 0.5 мг/л, рекомендованной для данного объекта [Ветчинкина и др., 2012; Жолобова, 2012], наблюдали непрямой органогенез - разрастание каллусной ткани с несколькими меристематическими очагами (рис. 5). Через 3-4 пассажа жизнеспособность экплантов постепенно снижалась и появлялись такие явления как некроз тканей, оводнение и остановка морфогенеза. Гибель эксплантов растений при этом составляла 54-56% за один пассаж, а коэффициент размножения - 3.5 + 0.3 микропобегов на эксплант. В шестом Рис. 5. Состояние эксплантов S. cretacea на питательной среде MS с БАП 0.5 мг/л через 21 сутки культивирования (5-й пассаж) пассаже культура полностью отмирала. Апробация других цитокининов не дала положительных результатов: уже в первом пассаже во всех случаях было отмечено нарастание каллуса, единичные микропобеги и признаки некроза (табл. 4).
Уменьшение (до 0.1 мг/л) или увеличение (до 1.0 мг/л) концентрации цитокининов в питательной среде статистически достоверных различий в частоте морфогенеза исследуемого объекта не дало. Дальнейший подбор оптимальных условий регенерации S. cretacea осуществляли путём усложнения сочетаний регуляторов роста и оптимизации минерального состава питательной среды.
Морфогенетический ответ эксплантов S. cretacea на различные экзогенные цитокинины [через 21 сутки культивирования] Регулятор роста,мг/л Кол-во регенерировавших микропобегов на эксплант , шт. Кол-во погибших эксплантов, % Контроль 3.3+0.25 БАП 0.5 3.5 + 0.30 55.0 Кинетин 0.5 - 100.0 Зеатин 0.5 2.7 + 0.18 39.9 2-ip 0.5 0.9 + 0.06 85.7 Примечание: среднее арифметическое значение ± доверительный интервал при Ро.95. Замена минерального состава MS на WPM увеличивала коэффициент размножения до 7.25 + 3.05 микропобегов на эксплант, однако, недостатками использования БАП в качестве единственного источника цитокининов являлись образование большого количества каллуса и появление стрессовой антоциановой окраски.
В последующих экспериментах базовой питательной средой (БПС) служила среда, содержащая макро- и микросоли WPM, сахарозу (20 г/л), витамины и аминокислоты по прописи MS. На этапе подбора регуляторов роста к БПС добавляли БАЛ, КН, ГК и ИУК в концентрациях 0.2, 0.5, 1.0 мг/л. Результаты анализировали на 21-е сутки культивирования.
Результаты апробирования питательных сред с различными комбинациями БАЛ, КН, ГК и ИУК представлены в таблице 5. Использование БАЛ в сочетании с ИУК в соотношении 2:1, 1:1, 1:2 способствовало образованию большого количества каллуса, побеги образовывались в небольшом количестве (4.3 ± 0.2 микропобегов/эксплант) и имели укороченные междоузлия (почти в 2 раза меньше контрольных). Добавление ГК (0.5-1.0 мг/л) в питательную среду повышало коэффициент размножения до 9.0 ± 1.0 микропобегов/эксплант, но регенерировавшие побеги сильно вытягивались и истончались, что осложняло дальнейшую работу с ними.
Повышение концентрации БАЛ приводило к оводнению побегов. В связи с этим исследования были направлены на поиск более сложного сочетания регуляторов роста, способного индуцировать процесс прямой регенерации микропобегов.
Была составлена четырёхфакторная трёхуровневая таблица, включающая четыре фитогормона (БАЛ, КН, ГК и ИУК) с тремя уровнями концентрации 0.2, 0.5, 1.0 мг/л (табл. 6), в границах которой посредством рандомизации на конфигурациях ладейных расстановок [Riordan, 2002] проводился поиск оптимального варианта сочетания фитогормонов для регенерации S. cretacea.
Максимальные значения коэффициента размножения (9.3 ± 1.3 микропобегов/эксплант) и длины побега (17.5 ± 0.7 мм) наблюдали в варианте БАЛ 0.2 + КН 1.0 + ГК 1.0 + ИУК 0.5 мг/л. Изменение концентраций фитогормонов приводило к снижению органогенной активности и разрастанию каллусоподобных тканей. Выявлена сильная положительная корреляция между коэффициентом размножения и длиной побега (г = 0.83; р 0.05) и отрицательная - между коэффициентом размножения, длиной побега, - с одной стороны, - и массой тканей каллусного типа, - с другой (г = - 0,78 и г = - 0.81 соответственно; р 0.05).
Другие представители флоры
Лук регелевский {A. regelianum A. Becker) - эндемик юго-востока Русской равнины, имеющий тенденцию к сокращению численности [Панин, Буланый, 2006; Сагалаев, 2008]. Разработке эффективных протоколов микроразмножения представителей рода Allium посвящено немало работ отечественных и зарубежных авторов [Вечернина и др., 2000; Новикова и др., 2008; Hussey, Falavigna, 1980; Ziv, Lilien-Kipnis, 2000; Le Guen-Le Saos et al., 2002; Musial et al, 2005]. Но, не смотря на разнообразие подходов к управлению процессами морфогенеза изучаемых объектов, их объединяет общее представление о том, что выбор экспланта и условия культивирования подбираются индивидуально в зависимости от культивара и его генотипа.
Доля освобождённых от инфекции семян после ступенчатой стерилизации (см. гл. 2, п. 2.2.2) составила 95.0%, количество проросших семян - 53.3%.
Массовое прорастание семян наблюдали на 4-9 день культивирования. Через 1-1.5 мес. экспонирования проростки формировали луковицы с диаметром 4-6 мм.
При подборе условий культивирования A. regelianum использовали три варианта эксплантации: одну часть луковиц, выросших из семян, оставляли целыми, у второй - разрезали донце пополам, у третьей - разрезали донце крест-накрест на 4 одинаковые доли. Регуляторы роста добавляли по той же схеме, что и с модельными объектами. Было установлено, что луковицы, разрезанные на 2 равные части, обладали наибольшим морфогенетическим потенциалом по сравнению с остальными вариантами эксплантации. Коэффициент размножения при добавлении в питательную среду БАП, кинетина, зеатина и 2-ір (по 0.5 мг/л) через 6 недель культивирования составил 1:4-1:9 в каждом из вариантов. Луковицы, помещенные на питательную среду целыми, не пролиферировали ни в одном из перечисленных вариантов; разрезанные на 4 доли -формировали такое же количество микролуковичек, что и разрезанные пополам, однако лишь 1/3 подобных эксплантов оставалась жизнеспособной, 2/3 - некротизировали.
Необходимо подчеркнуть, что из всех перечисленных цитокининов менее предпочтительным был БАП, поскольку при длительном воздействии на культуру (более трёх пассажей) он вызывал оводнение эксплантов и регенерировавших микролуковичек. Наиболее стабильные результаты отмечены при культивировании лука на среде MS, дополненной БАП (0.2-0.3 мг/л) в сочетании с зеатином (0.5 мг/л). Коэффициент размножения в данном варианте составил 8.3 ± 0.8 микролуковичек на эксплант на протяжении десяти циклов клонального микроразмножения. Повышение концентрации БАП и зеатина (до 0.5 мг/л и 1.0 мг/л, соответственно) оказывало ингибирующий эффект и снижало эффективность микроразмножения до 5.7 ± 0.6. Полученные микролуковички окончательно формировались и образовывали корни на питательной среде MS без регуляторов роста со стандартным содержанием сахарозы (30 г/л) через 4-5 недель культивирования при + 25С и 16/8-фотопериоде (рис. 21).
На этапе адаптации к нестерильным условиям регенеранты высаживали в пластиковые контейнеры по 200-300 мл с субстратом, состоящим из смеси садовой земли и песка в соотношении 1:1. Доля жизнеспособных регенерантов составила 77.9 + 6.5%.
В настоящее время работы по созданию генетических банков in vitro ведутся во многих ботанических садах России, в том числе и с использованием в качестве объектов представителей рода Allium. Например, в работе Т.В. Полубояровой и др. [2011] разработана методика культивирования ряда дикорастущих видов луков на этапе ввода и пролиферации. При этом в качестве первичных эксплантов использовали цветоложе. В первом пассаже отмечен высокий коэффициент размножения (28) и доказана генетическая стабильность материала. Однако авторами не отслежены последующие биотехнологические этапы, основное внимание которым уделено в нашем исследовании.
Использование нами ступенчатой стерилизации, в которой дезинфицирующим агентом являлся гипохлорит натрия, оказалось достаточно эффективным (95% семян без инфекции). Результаты не уступают данным (93% чистых семян) Т.В. Полубояровой и Т.П. Новиковой [2009], которые использовали схему стерилизации, включающую обработку 70% этанолом в течение 30 секунд и 0.2 % раствором сулемы - 10-15 минут, для проращивания дикорастущих луков подрода Melanocrommyum. Процент проросших семян в нашем эксперименте (53.3%) оказался в 4 раза выше по сравнению с результатами (13.0%), полученными СЕ. Агеевой с соавт.. [2012] после обработки семян A. regelianum 5% раствором ЛЗФ в течение 7 минут. Авторы отмечали прорастание семян на 9-й день культивирования, что подтверждает наши данные.
Приёмы с вырезанием или надрезанием донца широко применяются в цветоводстве для получения микролуковичек гиацинта, нарцисса, пролески и других растений с плёнчатыми луковицами [Мак-Миллан Броуз, 1992].
Подход, послуживший основой для нашего эксперимента с разрезанием донца, был использован в 1980 году G. Hussey и A. Falavigna для микроклонального размножения элитных сортов культурного вида А. сера in vitro. В качестве первичных эксплантов авторы использовали чешуи луковиц с фрагментом донца, а в последующих субкультивированиях - регенеранты, разрезанные вдоль на две равные части до базальной пластинки. Авторами было доказано происхождение микролуковичек из пазушных меристем, их генетическая стабильность, а также возможность использования их в качестве эксплантов для следующего цикла микроразмножения. Показано, что при выполнении продольного разреза очень важно разрушить апикальную меристему побега. Если этого не сделать, то только одна половина (без вершины) будет регенерировать множественные побеги, тогда как половина с неповрежденной верхушкой восстановит один единственный побег. Это объясняет, почему в нашем эксперименте целая луковичка in vitro не образовывала регенеранты.
Авторы сходятся в том, что для эффективной пролиферативной активности у различных видов Allium необходимо присутствие в среде цитокининов [Агеева и др., 2012; Ziv, Lilien-Kipnis, 2000; Kim et al, 2003], в то время как экзогенные гиббереллины, например, напротив оказывали ингибирующее действие на рост листьев и корней и формирование луковичек. Добавление в питательную среду ингибиторов гиббереллинового синтеза (таких как ациномидол) способствововало пролиферации микролуковичек [Le Guen-Le Saos et al, 2002]. По этой причине мы в своей работе сосредоточили внимание на подборе сочетания цитокининов для достижения максимального положительного эффекта пролиферации.
Ранее при попытке оптимизации клонального микроразмножения A. regelianum использование целых луковичек и БАЛ в качестве единственного регулятора роста не дало положительных результатов [Агеева и др., 2012]. Аналогичная картина наблюдалась в нашем эксперименте с использованием БАЛ в качестве единственного цитокинина и без разрезания луковичек. Как и у вышеупомянутых авторов, коэффициент размножения не превысил 3 микролуковичек на эксплант при довольно длительном культивировании.
Использование нами среды MS, дополненной БАЛ (0.2-0.3 мг/л) в сочетании с зеатином (0.5 мг/л), с использованием приёма разрезания микролуковичек привело к существенному увеличению коэффициента размножения до 8.3 ± 0.8 микролуковичек на эксплант на протяжении, по крайней мере, десяти циклов клонального микроразмножения. Аналогичный позитивный эффект совместного использования БАЛ и зеатина отмечался нами ранее в работе с культурой Potentilla volgarica Juz. [Крицкая, Кашин, 2013].