Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Иммунологические особенности пшеницы тимофеева, гриба puccinia triticina и механизмы устойчивости растений к грибным болезням (обзор литературы)
1.1. Происхождение и иммунологические особенности Triticum timopheevii Zhuk 11
1.2. Характеристика возбудителя бурой ржавчины Puccinia triticina Erikss. 13
1.3. Проблема длительной устойчивости растений к болезням и использование видов-нехозяев для ее решения 16
1.4. Механизмы устойчивости растений к патогенным грибам 21
1.4.1.Образование активных форм кислорода 21
1.4.2. Реакция сверхчувствительности 29
1.4.3.Защитные PR-белки 32
1.4.4. Фенольные соединения, фитоалексины и лигнификация 35
1.4.5. Укрепление клеточной стенки с помощью каллозы 42
1.5. Цитологические и цитофизиологические исследования
взаимодействия устойчивых растений с ржавчинными грибами 45
Глава 2. Материалы и методы исследований 49
2.1. Объекты исследований 49
2.2. Методы исследований
2.2.1. Изучение устойчивости образцов в полевых и лабораторных условиях . 51
2.2.2. Определение содержания супероксид-аниона и перекиси водорода 54
2.2.3. Индукция и подавление окислительного взрыва
2.2.4. Цитологические исследования 55
2.2.5. Цитохимические исследования 57
2.2.6. Статистическая обработка данных 59
2.3. Реактивы, использованные в исследованиях 60
Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение
3.1. Оценка устойчивости пшеницы Тимофеева к бурой ржавчине в Западной Сибири 61
3.2. Цитологические особенности взаимодействия образцов T. timopheevii с P. triticina 76
3.3. Влияние активных форм кислорода на патогенез
3.3.1. Динамика образования супероксид-аниона и перекиси водорода в зараженных тканях T. timopheevii 84
3.3.2. Влияние салициловой кислоты и верапамила на образование активных форм кислорода в тканях T. timopheevii 88
3.3.3. Локализация супероксид-аниона и перекиси водорода в зараженных тканях
3.4. Синтез фенольных соединений при взаимодействии T. timopheevii с P. triticina 107
3.5. Синтез каллозы при развитии болезни 119
3.6. Корреляция между результатами развития P. triticina в тканях T. timopheevii и механизмами устойчивости 122
Заключение 127
Выводы 129
Список литературы 131
Приложения
- Проблема длительной устойчивости растений к болезням и использование видов-нехозяев для ее решения
- Изучение устойчивости образцов в полевых и лабораторных условиях
- Влияние активных форм кислорода на патогенез
- Синтез фенольных соединений при взаимодействии T. timopheevii с P. triticina
Введение к работе
Актуальность исследований. Бурая ржавчина, вызываемая паразитическим грибом Puccinia triticina Erikss., приводит к наиболее значимым экономическим потерям при выращивании мягкой пшеницы Triticum aestivum L. по сравнению с другими ржавчинами (стеблевой и желтой) (Huerta-Espino et al., 2010). Это связано с распространением патогена во всех зерновых регионах мира, быстрыми микроэволюционными процессами в его популяциях, регулярным преодолением устойчивости сортов. Ежегодные потери урожая от бурой ржавчины пшеницы составляют 5 – 10%, а в годы эпифитотий достигают 30 – 50% (Лебедев, 2000). Одним из подходов к решению проблемы защиты культурных растений является изучение и использование механизмов устойчивости иммунных видов (в зарубежной литературе – видов-нехозяев, nonhosts). Известно, что на видах-нехозяевах неспециализированные грибы прекращают развитие на ранних этапах. Устойчивость нехозяев считается непреодолимой, в то время как сортовая регулярно преодолевается патогенами (Heath, 2000; Дьяков, 2005; Ayliffe et al., 2010). Исследование физиологических основ устойчивости видов-нехозяев к бурой ржавчине высоко актуально.
В последние десятилетия интерес к устойчивости видов-нехозяев к болезням резко возрос. Для изучения резистентности нехозяев преимущественно используют генетические подходы, при этом используют коллекции мутантов Arabidopsis thaliana с неэффективными генами устойчивости, а также специальные восприимчивые к ржавчинам пшеницы модельные линии ячменя Hordeum vulgare L. и риса Oryza sativa L. (Niks et al., 2009; Ayliffe et al., 2010; Gill et al., 2015). Согласно современным представлениям растения обладают устойчивостью двух типов – базовой (нехозяев) и специфической (хозяев). Базовая устойчивость связана с тем, что нехозяева узнают консервативные молекулы (pathogen-associated molecular patterns – PAMPs), а устойчивые хозяева – специфические эффекторы (Gill et at., 2015). Альтернативным подходом является исследование взаимодействия растений со штаммами патогенов, которые в разной степени преодолели устойчивость видов-нехозяев. Несмотря на интерес к проблеме в настоящее время отсутствует представление о комплексе механизмов, обеспечивающих длительную защиту видов-нехозяев.
Вид пшеница Тимофеева Triticum timopheevii Zhuk. обладает уникальной устойчивостью к ржавчинным болезням и считается перспективным источником генов для защиты культурной пшеницы. Иммунитет T. timopheevii к ржавчинным болезням был многократно подтвержден в европейской части России (Якубцинер, 1932; Дорофеев и др., 1987; Михайлова, 2005; Волкова, 2006, Волкова и др., 2013). В настоящее время в западносибирской популяции возбудителя бурой ржавчины P. triticina происходят изменения, приводящие к регулярному преодолению ранее эффективных генов устойчивости (Мешкова, Россее-ва, 2008; Плотникова и др., 2012). В связи с этим возникла возможность изучения физиологической основы устойчивости T. timopheevii к ржавчине с применением набора клонов гриба, различающихся совместимостью с растениями. Данные исследования представляют большой теоретический и практический
интерес, поскольку комплекс механизмов иммунитета T. timopheevii к ржавчинным болезням ранее не изучали.
В ХХ в. основное внимание было уделено исследованию физиологических и цитологических аспектов сортовой устойчивости к грибным болезням, при этом в качестве основного механизма защиты рассматривали реакцию СВЧ (Рейтер, Юдкин, 1981; Андреев, Плотникова, 1989; Kombrink, Somssvich, 1995). Кроме того, исследовали значение синтеза фитоалексинов и лигнифика-ции клеточных стенок в защите от разных патогенов (Beardmore et al., 1983; Moerschbacher et al., 1988). Позже была выявлена важная роль активных форм кислорода (АФК), защитных PR-белков и системной приобретенной устойчивости в защите растений (Jabs, Slusarenko, 2000; Тарчевский, 2000; Van Loon, 2006; Максимов, 2010; Asthir et al., 2010; Нужная и др., 2014; Веселова и др., 2015; Яруллина и др., 2016 и др.). В сортах ржи, устойчивых к листовой и стеблевой ржавчине, обнаружены изменения в количестве и соотношении фенол-карбоновых кислот и их гликозидов (Волынец, 2016). Установлена важная роль апопласта и лизосомальной системы в защите злаков от стеблевой и листовой ржавчины (Карпук, 2000, 2016).
Целью работы было исследование комплекса защитных механизмов вида-нехозяина Triticum timopheevii от бурой ржавчины с использованием набора природных клонов Puccinia triticina, способных в разной степени развиваться на растениях.
Задачи исследований:
1. Изучить устойчивость набора образцов T. timopheevii к популяциям
P. triticina из регионов России и выявить формы со стабильной резистентностью к болезни.
2. Выявить характерные особенности взаимодействия P. triticina с образ
цами T. timopheevii с помощью цитологических методов.
-
Изучить динамику накопления активных форм кислорода (O2–, H2O2) на фоне естественного хода болезни, а также после индукции или подавления окислительного взрыва, определить их роль в защите T. timopheevii.
-
Исследовать значение синтеза фенольных соединений и полисахарида каллозы в устойчивости T. timopheevii.
-
Провести анализ влияния защитных реакций на результаты взаимодействия T. timopheevii с патогенным грибом.
Научная новизна. Впервые исследован комплекс механизмов защиты вида-нехозяина к ржавчине на примере уникальной модели – образцах ранее иммунного вида T. timopheevii, зараженных природными клонами P. triticina с разной совместимостью с растениями. Установлено, что образцы T. timopheevii гетерогенны по резистентности и проявляют различия при заражении региональными популяциями P. triticina на стадии проростков. Иммунитет T. timopheevii к болезни обеспечивался набором механизмов, отличных от проявлений сортовой устойчивости: 1) ингибированием развития гриба на поверхности листа на стадии ростковой трубки; 2) генерацией супероксид-аниона замыкающими клетками устьиц при контакте с аппрессориями; 3) накоплением
O2– при внедрении гаусторий в клетки с последующей реакцией сверхчувствительности (СВЧ); 4) отмиранием колоний, связанным с подавлением образования гаусторий гриба, но не зависящим от активных реакций растений; 5) подавлением роста колоний на поздних этапах развития и спорогенеза без реакции СВЧ, но за счет накопления в тканях перекиси водорода, синтеза каллозы и лигнина с производными синаповой кислоты (сирингина). Впервые показана тенденция преодоления иммунитета T. timopheevii на стадии проростков ржавчинным грибом, а также продемонстрирована утрата растениями защитных механизмов.
Практическая значимость связана с тем, что выявлен набор механизмов устойчивости, обеспечивающий длительную защиту вида T. timopheevii от бурой ржавчины. Определены образцы, сохраняющие стабильную устойчивость к популяциям P. triticina из регионов РФ. Эти результаты могут быть использованы для интрогрессии генов устойчивости в геном T. aestivum, конструирования сортов с длительной устойчивостью к ржавчинным болезням, а также для разработки средств защиты. Научные положения диссертации рекомендуется использовать для обучащихся вузов по дисциплинам: «Физиология и биохимия», «Защита растений», «Иммунитет растений».
Апробация работы. Материалы диссертационной работы были пред
ставлены на научных форумах разного уровня: I Международная интернет-
конференция «Современные тенденции в сельском хозяйстве» (Казань, 2012);
Третья Всероссийская и международная конференция «Современные проблемы
иммунитета растений к вредным организмам» (Санкт-Петербург, 2012);
III Вавиловская международная конференция «Идеи Н.И. Вавилова в современ
ном мире» (Санкт-Петербург, 2012); X Международная научно-методическая
конференция «Интродукция нетрадиционных и редких растений», посвященная
памяти академика РАСХН Николая Сергеевича Немцева (Ульяновск, 2012);
Международная научно-практическая конференция «Академическая наука –
проблемы и достижения» (Москва, 2013); Международная научно-практическая
конференция, посвященная 95-летнему юбилею агрономического факультета
«Научные инновации – аграрному производству» (Омск, 2013); XX Междуна
родная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломо
носов-2013» (Москва, 2013); Вторая международная научно-практическая кон
ференция «Актуальные проблемы изучения и сохранения фито- и микобиоты»
(Минск, 2013); III Всероссийский съезд по защите растений «Фитосанитарная
оптимизация агроэкосистем» (Санкт-Петербург, 2013); Национальная научно-
практическая конференции «Материально-техническое обеспечение АПК Рос
сии: импортозамещение, перспективы и опыт корпорации «Енисей» (Омск,
2014); Международная научно-практическая конференция, посвященная
60-летию освоения целинных и залежных земель, «Исторические аспекты, со
стояние и перспективы развития земледелия в Сибири и Казахстане» (Омск,
2014); Национальная (Всероссийская) научно-практическая конференция
«Агрометеорология и сельское хозяйство: история, значение и перспективы», посвященная 100-летнему юбилею со дня образования учебной лаборатории
агрометеорологии (Омск, 2016); Международная конференция «Современные проблемы иммунитета растений к вредным организмам» (Санкт-Петербург, 2016).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 21 работа, в том числе 5 в изданиях, входящих в перечень журналов, рекомендованных ВАК РФ.
Личное участие автора в получении научных результатов. Личный вклад соискателя заключается в разработке идеи работы, постановке и проведении экспериментов, анализе данных и интерпретации результатов.
Структура и объем диссертации. Работа изложена на 168 страницах машинописного текста, состоит из введения, списка сокращений, 3 глав, заключения и списка литературы, включающего 259 источников (из них 153 – источники на иностранном языке). Работа содержит 6 таблиц, 25 рисунков, иллюстрирована 29 микрофотографиями.
Проблема длительной устойчивости растений к болезням и использование видов-нехозяев для ее решения
Возбудитель бурой ржавчины – паразитический гриб Puccinia triticina Erikss. принадлежит к отделу Basidiomycota, классу Urediniomycetes H. Dorfelt, emend. Swannet Taylor, порядку Uredinales (Brogn.) Dietel, семейству Puccinia-ceae Chevall., роду Puccinia Pers.ex Pers. (Азбукина, 2005). P. triticina – наиболее пластичный из трех видов ржавчинных грибов, поражающих пшеницу (P. triticina, P. graminis f. sp. tritici, P. striitormis). Бурая (листовая) ржавчина встречается во всех регионах мира и РФ, где выращивают пшеницу (Пересыпкин и др., 1991; Кудинцова и др., 2010). Восприимчивые к бурой ржавчине сорта пшеницы регулярно теряют 5–15 %, а в годы эпифитотий 45–70 % урожая могут составлять (Степанов, Чумаков, 1967; Лебедев и др., 1994; Kolmer, 1996; Лебедев, 1999, 2000а, 2000б). Поражение бурой ржавчиной происходит постоянно, поэтому экономические потери выше в сравнении с поражением стеблевой ржавчиной, вспышки которой происходят относительно редко (Huerta-Espino, et al., 2010). На территории РФ бурая ржавчина пшеницы распространена во всех зерновых регионах, но наибольший вред приносит в Краснодарском крае, Центрально-Черноземном регионе, Нечерноземной зоне, Поволжье и Западной Сибири. Ранее частота вспышек заболевания составляла 4–6 лет из 10 (Санин, 1995), а в последние годы болезнь развивается значительно чаще (Санин, 2013).
P. triticina является членом биоценозов и агроценозов, но в настоящее время его основным хозяином является широко распространенная в мире зерновая культура – мягкая пшеница T. aestivum L. При этом установлено, что патоген способен поражать другие виды родов семейства Poaceae: Triticum, Aegi-lops, Agropyron, Eremopyrum, Brachypodium и др. (Берлянд-Кожевников, 1974; Лебедев, 1999, 2000а, 2000б).
Для ржавчинных грибов порядка Uredinales, включающего род Puccinia, был характерен сложный цикл развития, состоящий из трех стадий и пяти спо-роношений. Половую эциальную стадию грибы проходили на промежуточных видах растений, а вегетативную урединиостадию и телиостадию – на основных видах-хозяевах (D Oliveira, Samborski, 1966; Азбукина, 2005). Эциальный хозяин P. triticina василистник – Thalictrum isopyron, а урединии и телии развиваются на пшенице. В агроценозах промежуточный хозяин (василистник) встречается редко, в результате чего вид P. triticina практически полностью утратил половую стадию развития и приспособился к существованию в вегетативной ди-кариотичной урединиостадии (Dyakov, 1989; Дьяков, 1998). Гриб образует в течение сезона несколько генераций урединиоспор и существует в форме клонов с вегетативным способом размножения. За счет высокой интенсивности размножения патогена и регулярно возникающих мутаций создается генетическая изменчивость, достаточная для эволюции патогена (Sharma, 1970; Дьяков, 1998).
Л.А. Михайлова выделяла на территории бывшего СССР по крайней мере 6 популяций P. triticina: 1) Закавказья и предгорий Кавказа, 2) европейской части, 3) Средней Азии; 4) Западной Сибири и Северного Казахстана, 5) Восточной Сибири; 6) Дальнего Востока. Европейская популяция отличается от западносибирской и азиатской), а Поволжье является районом, где европейская и азиатская популяции взаимодействуют (Михайлова, 1995 а, 6, 1996 а, б; Павлова, Михайлова, 1997). Результаты исследований популяций Южного Урала, Западной Сибири (Омская, Тюменская, области, Алтайский край) и Северного Казахстана показали, что эти популяции очень близки (Мешкова, 2002; Мешкова, Россеева, 2008; Гультяева, Баранова, 2010). На основании молекулярно-генетических исследований и анализа популяций по признаку вирулентности Е.И. Гультяева (Гультяева и др., 2016) сделала вывод о том, что на европейской части России существует единая популяция гриба, субпопуляции которой в предгорьях Кавказа, Поволжье и в северо-западном регионе имеют различия, связанные с адаптациям гриба к сортам и условиям существования. Близкие по свойствам популяции Южного Урала, Западной Сибири и Северного Казахстана отнесены к единой азиатской популяции.
В южных и северо-западных регионах в течение вегетации урединиоспо-ры заражают яровые посевы пшеницы, а осенью попадают на посевы озимой пшеницы или диких злаков и зимует в форме урединиоспор или мицелия (Бер-лянд-Кожевников, 1978; Азбукина, 2005; Лебедев, 1999; Веденеева и др., 2002; Волкова, 2006). В тоже время в Западной Сибири инокулюм патогена ежегодно гибнет, в результате суровых зим и ограниченного распространения озимых посевов. Поэтому основным источником заражения посевов является занос уре диниоспор во второй половине лета из западных регионов России и Северного Казахстана (Рейтер, 1984; Мешкова, 2006).
В последние годы отмечено ускорение темпов эволюции P. triticina, регулярно появляются новые вирулентные патотипы гриба. В Поволжье потерял эффективность ген Lr19, а в Западной Сибири и Северном Казахстане - ген Lr9 (Крупнов, 2005; Мешкова, 2008). В 2006-2010 гг. в Западной Сибири появились клоны, вирулентные к генам Lr24, Lr25 (Плотникова и др., 2012 а, б). Однако во всех регионах частичную устойчивость обеспечивают гены возрастной устойчивости Lr12, Lr13, Lr22a, Lr34, Lr35, Lr37 (Волкова, 2010; Гультяева, Баранова, 2010; Плотникова, Штубей, 2013).
В связи с регулярным преодолением устойчивости сортов необходимо пополнять генофонд пшеницы новыми генами к бурой ржавчине, а также расширять представления о механизмах длительной устойчивости растений.
Изучение устойчивости образцов в полевых и лабораторных условиях
Для изучения роли АФК в патогенезе были проведены комплексные исследования генерации перекиси водорода Н2О2 и супероксид-аниона O2– с помощью биохимических и цитохимических методов, а также изучено развитие инфекционных структур гриба. Генерацию АФК и развитие P. triticina изучали на листьях: – интактных (контроль); – с индуцированным окислительным взрывом, для чего за 2 сут до инокуляции растения обрабатывали 0,01 %-ным (0.63 мМ) водным раствором СК из расчета 10 мл/100 листьев) (Тютерев, 2002); – с подавленным окислительным взрывом, для чего концы отрезков листьев обрабатывали до инокуляции 0,01 %-ным водным раствором верапамила (“Сalbiochem”, США) в течение 12 ч (Плотникова, 2008).
С использованием методов световой, люминесцентной микроскопии проводили цитологические исследования .
На изучение особенностей развития инфекционных структур гриба на поверхности и в тканях листьев, для выявление активных реакций в форме СВЧ реакции и отложений на клеточных стенках растений были нацелены. гистологические исследования
Инфицированные листья для цитологических исследований подготавливали по бензимидазольному методу (Михайлова, Квитко, 1970). Исследования проводили на целых листьях пшеницы фиксированных.через 0,5, 1, 2, 3, 5, 10 сут после инокуляции (п/ин).
Фиксацию проводили путем кипячения кусочков листьев в течение 2 мин в лактофенольной смеси (дистиллированная вода – 10 мл; молочная кислота – 10 мл, фенол – 10 г, глицерин – 10 мл, спирт – 80 мл). Фиксация позволяет длительно хранить материалы до изучения.
Окраску материала проводили по модифицированному лактофенольному методу Шиптона-Брауна (Плотникова, 1990). Для этого листья окрашивали в 1 %-ном анилиновом синем в лактофеноле при температуре 60 оС в течение 0,5-1 ч. Затем в насыщенном растворе хлоралгидрата (2,5 г хлоралгидрата/ мл H2O) окраску дифференцировали в течение 1-2 ч при температуре 60 оС. В результате отмершие в результате реакции СВЧ – темно-синими, клетки растений неповрежденные становились светло-голубыми, структуры гриба – синими.
Изучали показатели: число клеток погибших в результате СВЧ, размеры отложений различного состава в зонах колоний, аппрессориев и подустьичных везикул на устьицах, количество ростковых трубок на поверхности листьев, гаусторий в колониях, размеры пустул и колоний.
Учитывали результаты развития 30–40 спор при всех сроках наблюдений. Гриб считали погибшим, остановившийся на поверхности листа на стадиях ростковой трубки, аппрессория/ подустьичной везикулы на устьице, а так же колонии без пустулы. Долю погибшего инокулюма (%) на перечисленных стадиях развития, вычисляли от количества проросших спор.
Размеры пустул и колоний измеряли окуляр-микрометром, площадь рассчитывали по формуле площади эллипса. Рассчитывали средние значения площади 20-25 колоний и пустул на каждом листе.
Цитологическое изучение взаимоотношений растений пшеницы и возбу дителя бурой ржавчины было проведено с помощью световых микроскопов МБИ – 15 и Биолам – 21, Люмам – 8. Микрофотосъемку проводили цифровой фотокамерой “Olympus SP-320” (Япония) с разрешением с цветными све тофильтрами. Цитологические и цитохимические исследования проводятся на одних и тех же фиксированных листьях по разработанной для этого цели технологии (Плотникова, 2008). Последовательное окрашивание целых фиксированных листьев позволяет изучить развитие инфекционных структур и точно установить в местах контакта с патогеном локализацию защитных реакций растений. Выявление O2– и Н2О2
Присутствие супероксид-аниона определяли с помощью НСТ (нитроси-ний тетразолий (Пирс, 1962). По модифицированному методу М. Хис проводили витальную окраску зараженных листьев (Плотникова, Мешкова 2009) в 0,1%-ном растворе нитросинеготетралозия в дехлорированной водопроводной воде. В ткани вводили раствор красителя путем вакуум-инфильтрации листьев. Межклетники заполнялись раствором красителя после удаления воздуха. Инфильтрированные листья выдерживали в красители 30 мин, а затем фиксировали с помощью лактофенольного фиксатора. При взаимодействии O2– с красителем образуется прочное соединение не растворимое в спиртовых фиксаторах диформазан синего цвета.
Присутствие Н2О2 определяли окрашиванием листьев 3,3 -диамино-бензидин тетрахлоридом (ДАБ) (“Sigma”, США). Для этого проводили вакуум-инфильтрацию кусочков листьев 0.02%-ным ДАБ в дехлорированной водопроводной воде. ДАБ в присутствии Н2О2 – вишневое соединение (Пирс, 1962; Heath, 1998). Через 30 мин материал фиксировали в лактофеноле.
Выявление каллозы Присутствие полисахарида каллозы выявляли путем окрашивания листьев красителем 1 %-ным кораллином в 4 % соде Na2CO3 (розоловая кислота, ау-рин). Окрашенные анилиновым синим листья промывали водой, и красили 20 30 мин до яркого окрашивания листа, затем дифференцирют в 4 % соде Na2CO3 на стекле 10 – 15 мин. Отложение каллозы приобретает красно-розовую окраску разной интенсивности.
Влияние активных форм кислорода на патогенез
Развитие болезней (патогенез) – сложный динамический процесс, который зависит от взаимодействия двух организмов. Согласно современным представлениям, после узнавания авирулентного патогена запускается сигнальная трансдукция, приводящая к согласованной активации сотен генов, что обеспечивает реализацию защитных реакций растений (Boller, Keen, 2000; Тарчевский, 2002). Одновременно у патогенов активируются сигнальные системы, обеспечивающие морфогенез и взаимодействие с растениями. Нарушение взаимодействия партнеров может приводить к изменению конечного результата и симптомов болезни.
Биотрофные ржавчинные грибы образуют набор высоко специализированных инфекционных структур для взаимодействия с тканями растений. Цитологические исследования дают возможность оценить развитие патогена и определить критические моменты патогенеза, на которых проявляются защитные реакции растений.
Для цитологических исследований были выбраны образцы T. timophee-vii, проявившими при заражении западносибирской популяции популяцией 2011 г.: иммунитет – к-38555 и к-46956, устойчивость – к-30920 и самые сильные симптомы болезни – к-35915. Листья образцов T. timopheevii заражали (раздельно) тремя популяциями гриба, полученными путем размножения спор, собранных в Северо-западном регионе, Поволжье и Западной Сибири.
Исследования показали, что на листьях восприимчивого сорта мягкой пшеницы все споры P. triticina успешно проросли, образовывали ростковые трубки, а затем аппрессории на устьицах через 0,5 сут п/ин. Цитоплазма ап-прессориев перетекала в подустьичные везикулы, на устьицах оставались их пустые оболочки (рис. 5 а). Позже формировались инфекционные гифы с материнскими клетками гаусторий (МКГ). Через 1 сут п/ин в мезофилльные клетки проникали гаустории, необходимые для питания гриба и биотрофного взаимодействия. Клетки гриба имели плотную цитоплазму, гифы образовывали много МКГ и гаусторий (рис. 5 б). Через 10 сут п/ин все колонии сформировали крупные пустулы (рис. 5 в).
Анализ результатов развития инокулюма популяций гриба P. triticina из разных регионов РФ на образцах T. timopheevii показал, что, взаимодействие сводилось к 5 характерным вариантам: I – развитие прекращалось на стадии ростковых трубок (рис. 5 г); II – инокулюм погибал на стадии аппрессория (реже – подустьичной везикулы) при попытке внедрения в устьица (рис. 5 д); III – отмирание колоний происходило после внедрения 2-3 гаусторий в мезофилльные клетки и сопровождалось реакцией СВЧ, проявляющейся в форме коллапса клеток и быстрого разрушения их цитоплазмы, которая при этом интенсивно окрашивалась (рис. 5 е); IV – гибель мелких колоний со слабо окрашеннымивакуолизирован ными клетками происходила через 3–5 сут п/ин., до абортации колоний не отмечались активные реакции растений, включая реакцию СВЧ (рис. 5 ж). V – колонии формировали пустулы разного размера, на устойчивых растениях образовывались пустулы малых размеров, т.е. спорогенез был по давлен (рис. 5 з). Типичная реакция СВЧ с коллапсом клеток не проявлялась, клетки погибали к моменту спороношения, образуя визуальные зоны некроза вокруг пустул (балл 1-2), а восприимчивых растениях образовывались пусту лы среднего размера без цитологических признаков несовместимости (балл 3).
Иммунитет растений (отсутствие спороношения гриба) проявлялся при вариантах взаимодействия I, II, III и IV, а при варианте V – устойчивость или восприимчивость. Сравнение результатов показало существенные различия в соотношении вариантов взаимодействия растений с разными популяциями P, triticina. Рисунок 5. Развитие инфекционных структур P. triticina на листьях T. aestivum (а-в) и T. timopheevii (г-з): а – аппрессорий на устьице, 1 сут п/ин; б – колония с гаусториями, 3 сут п/ин; в – крупная урединиопустула на листе мягкой пшенцы, 10 сут п/ин; г – ростковая трубка без аппрессория, 1 сут п/ин; д – аппрессорий, погибший на устьице, 1 сут п/ин; е –проявление реак ции СВЧ на устойчивом растении (стрелки), 2 сут п/ин; ж – абортивная колония с вакуолизированными гифами и гаусториями (стрелки), 3 сут п/ин. з – мелкая пустула на листе T. timopheevii, 10 сут п/ин. Окраска анилиновым синим.
Соотношение вариантов взаимодействия зависело от образца и популяции патогена (рис. 6). При заражении проростков T. timopheevii спорами западносибирской популяции на иммунных образцах к-38555 и к-46956 выявлены все варианты взаимодействий (I – V). При этом отмечена гибель значительной части инокулюма (от 10 до 70 %) на стадиях ростковой трубки или аппрессория при попытке внедрения в устьица (варианты I и II), т.е. проявлялась так называемая прегаусториальная устойчивость (Niks, 1980). Cущественная доля инокулюма (от 20 до 100 %) погибала после гибели 2-3 клеток в результате интенсивной реакции СВЧна стадии микроскопических колоний (вариант III). В тоже время на более восприимчивых образцах к-30920 и к-35915 прегаусториальная устойчивость проявлялась в слабой степени, а также сократилось значение устойчивости, связанной с реакцией СВЧ, но в растениях остались механизмы устойчивости, приводящие к абор-тации колоний без реакции СВЧ (вариант IV) и ограничению роста и споро-генеза гриба (вариант V).
При заражении тех же образцов популяцией, собранной в Ленинградской области, большинство растений были иммунны. При этом лишь на единичных растениях проявлялась прегаусториальныя устойчивость, в единственном образце к-46956 гибель небольшой доли колоний сопровождалась реакцией СВЧ (вариант III). а преобладающим механизмом устойчивости была абортация колоний без СВЧ (вариант IV).
К поволжской популяции те же образцы проявили устойчивость (тип 1-2). Цитологические исследования показали, что клоны этой популяции практически преодолели прегаусториальную устойчивость. При этом защита рас тений в основном обеспечивалась отмиранием колоний без СВЧ и подавлением спорогенеза гриба (варианты IV и V).
Изучение взаимодействия западносибирской популяции 2013 г. с взрослыми растениями пшеницы Тимофеева показало, что иммунитет растений обеспечивался прегаусториальная устойчивость (варианты I, II), а также гибель гриба, связанная с реакцией СВЧ, проявлялась в слабой степени. Преимущественным вариантом несовместимого взаимодействия был IV, проявляющийся в ранней абортации колоний и не связанный с реакцией СВЧ (рис. 7).
Детальные исследования устойчивости образцов T. timopheevii к различным популяциям P. triticina, а также изучение цитологических особенностей взаимодействия были проведены нами впервые. Это позволило выявить набор критических стадий взаимодействия, на которых проявлялась несовместимость гриба с растениями. Иммунитет может быть обеспечен за счет 4 вариантов несовместимого взаимодействия, приводящих к подавлению развития патогена до внедрения в клетки (варианты I и II) или в тканях растения (варианты III и IV). Дополнительная защита растений обеспечивалась за счет замедления роста колоний на поздних этапах развития и ограничения спороношения гриба (вариант V). Это свидетельствует о том, что пшеница Тимофеева защищена от бурой ржавчины несколькими эффективными механизмами устойчивости.
Однако возбудитель ржавчины ячменя P. hordei погибал на стадии внедрения в устьица, т.е. проявлялась прегаусториальная устойчивость (Niks, 1980).Прегаусториальная устойчивость считается проявлением самой высокой степени несовместимости видов-нехозяев с ржавчинными грибами (Niks, 1980; Heath, 2000 a).
Синтез фенольных соединений при взаимодействии T. timopheevii с P. triticina
Дополнительно роль окислительного взрыва в защите от патогена была изучена на альтернативной модели – растениях с подавленным окислительным взрывом. В восприимчивых растениях мягкой пшеницы не отмечено влияния верапамила на развитие гриба в течение 3 сут п/ин, но позже мицелий резко замедлял рост, клетки гриба вакуолизировались и погибали. Как отмечено выше, гибель гриба могла быть связана с нарушением метаболизма растений после нарушения действия Са2+-каналов. В связи с этим результаты взаимодействия с устойчивыми растениями рассматривали в течение 3 сут п/ин. На обработанных верапамилом растениях T. timopheevii развитие гриба на поверхности листьев не менялось, но он стал способен проникать во все устьица, формировать и образовывать разветвленные колонии. После внедрения 2- 3 гаусторий коллапс клеток не отмечен, т.е. реакция СВЧ не проявлялась (рис. 14 г). Средние размеры колоний в образцах T. timopheevii увеличивались на 15-20 %.
По мнению голландского фитопатолога Эллингбо (Ellingboe, 1976) для преодоления устойчивости видов-нехозяев микроэволюция патогена должна идти в двух направления – преодоления механизмов устойчивости растения (или их подавления); – установления биотрофных отношений, обеспечивающих полноценное питание и размножение за счет растения.
Мы рассматривали взаимоотношения P. triticina с растениями пшеницы Тимофеева с этих позиций. Важной особенностью взаимодействия грибов с видами-нехозяевами, а также с иммунными сортами является остановка на ранних этапах развития, часто на поверхности органов или после проникновения в единичные клетки растений (Heath, 2000). При выявлении механизмов устойчивости важнейшую роль играют цитологические и цитохимические методы, позволяющие исследовать взаимодейтсвие грибов с растениями на клеточном уровне.
Цитохимические исследования роли АФК в защите растений от ржавчинных грибов единичны. Основные исследования были проведены на модели «возбудитель ржавчины вигны U. vignae – иммунный сорт вигны». На этой модели генерация O2– не выявлена, но отмечено повышение активности пероксидаз и накопление Н2О2 в клетках, погибших после внедрения гаусторий в результате реакции СВЧ. После обработке вигны ингибиторами окислительного взрыва реакция СВЧ подавлялась, отмечен более активный рост мицелия U. vignae (Heath, 1998). Позже на примере зараженного возбудителем желтой ржавчины P. striiformis f. sp. tritici устойчивого сорта мягкой пшеницы было показано одновременное накопление O2– и Н2О2 в клетках растений при медленном развитии реакции СВЧ (3 сут вместо 1 сут в наших экспериментах) (Wang, Huang, 2007). Также на примере устойчивого сорта, зараженного желтой ржавчиной, были получены данные о повышении содержания O2– и Н2О2, а также ферментов антиоксидантной системы – СОД, супероксиддисмутазы, диаминоксидазы, полиаминоксидазы, пероксидазы (Asthir, Koundal, 2010). При этом авторы провели одноразовые исследования, что не позволяет понять влияние АФК на разные стадии патогенеза.
Данные о роли АФК в устойчивости видов-нехозяев к ржавчинным грибам in planta были получены только на примере взаимодействия P. tritici-na c иммунным овсом Avena sativa, а также P. coronata c мягкой пшеницей. При этом было показано, что остановка ржавчинных грибов происходила на устьицах, т.е. на более ранней стадии, чем на иммунных сортах вигны и устойчивых к желтой ржавчине сортах пшеницы. Установлено, что суперокси-данион генерировался замыкающими клетками устьиц, накапливался в цитоплазме аппрессориев и полностью подавлял развитие патогенов (Плотникова, 2008). Аналогично происходило взаимодействие P. triticina с иммунной линий пшеницы с геном Lr19 от иммунного вида Agropyron elongatum (Плотникова, Мешкова, 2009).
Фунгицидное действие растений может быть связано с проникновением через водопроницаемые оболочки гриба высокотоксичного супероксид-аниона и быстрым разрушением клеточных структур гриба (Naton et al., 1996). Результаты электронно-микроскопических исследований подтверждают цитотоксическое воздействие растений на гриб на стадии проникновения в устьица. На иммунной линии пшеницы с геном Lr19 показано, что в ап-прессории и подустьичной везикуле P. triticina была нарушена структура ядер, разрушены митохондрии и повышена электронная плотность цито плазмы. Одновременно в цитоплазме клеток пшеницы, контактировавших со структурами паразита, увеличивалось число пероксисом (Плотникова, 2007).
Результаты исследований взаимодействия P. triticina с пшеницей Тимофеева показывают, что окислительный взрыв на устьицах имеет значение и для защиты этого вида, но он защищал растения не полностью, а также проявлялся преимущественно при взаимодействии с клонами западносибирской популяции. Эксперименты с верапамилом подтверждают важность окислительного взрыва в предотвращении проникновения гриба в устьица.
В настоящее время известно, что интенсивность окислительного взрыва может снижаться при изменении свойств или утрате свойств элиситоров (Bent, 1996). Эти результаты могут быть объяснены тем, что в процессе мик-роволюции у части клонов гриба изменились элиситоры, выделяющиеся при контакте аппрессориев с устьицами либо гриб приобрел способность выделять супрессоры защитных реакций. Однако при индукции окислительного взрыва у T. timopheevii с помощью СК окислительный взрыв на устьицах при контакте с аппрессориями гриба усиливался. Вероятно, это связано стем, что у гриба остались элиситоры защитных реакций. Ранее сходный эффект был обнаружен при изучении взаимодействия P. triticina с растениями линии ТсLr19, обработанными СК или ее физиологическими аналогами (янтарной кислотой или бензотиадиазолом - Бион - benzo (1,2,3) thiadiazole-7-carbothioic acid-S-methylester). На этой линии на необработаннывх растениях авирулент-ный изолят был способен проникать в ткани и колонизировать растения, а после обработки индукторами устойчивости погибал на устьицах. В тоже время обработка растений не влияла на ранние этапы взаимодействия с вирулентным изолятом (Плотникова, Штубей, 2009; Плотникова, 2009).