Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Основы взаимодействия партнеров в симбиотических ассоциациях 8
1.1. Природа лишайникового симбиоза 8
1.2. Биохимические системы регуляции взаимодействия между лишайниковыми симбионтами 13
1.3. Взаимодействия в системе «хозяин-патоген» 16
Глава 2. Активированные кислородные метаболиты в биологических системах 19
2.1. Молекулярные механизмы генерации активированных кислородных метаболитов 19
2.2. Общая характеристика основных форм активированных кислородных метаболитов 21
Глава 3. Деструктивные процессы, индуцированные активированными кислородными метаболитами 24
3.1. Модификация ДНК 24
3.2. Окисление белков 24
3.3. Окисление хлорофиллов 24
3.4. Окисление липидов 25
Глава 4. Особенности состава мембранных липидов лишайников 33
4.1. Состав индивидуальных фосфолипидов 33
4.2. Состав индивидуальных гликолипидов 35
Глава 5. Системы защиты от окислительных повреждений 37
5.1. Низкомолекулярные соединения 38
5.1.1. Токоферолы 38
5.1.2. Другие фенольные соединения 43
5.1.3. Глутатион 45
5.1.4. Каротиноиды 46
5.2. Высокомолекулярные соединения 51
5.2.1. Супероксиддисмутазы 51
5.2.2. Пероксидазы 54
5.2.3. Каталаза 58
Материалы и методы исследования 60
Глава 1. Объекты исследования и постановка эксперимента 60
1.1. Объекты исследования 60
1.2. Постановка эксперимента 60
1.3. Изоляция лишайниковых симбионтов 62
Глава 2. Методы исследования 64
2.1. Анализ липидов и продуктов их окисления 64
2.1.1. Экстракция общих липидов 64
2.1.2. Выделение фракции гликолипидов, фосфолипидов и ДГТС 64
2.1.3. Разделение индивидуальных классов полярных липидов 65
2.1.4. Количественное определение фосфолипидов 66
2.1.5. Количественное определение гликолипидов 67
2.1.6. Количественное определение ДГТС 69
2.1.7. Определение относительного количества гидроперекисей жирных кислот в составе полярных липидов 69
2.1.8. Получение метиловых эфиров жирных кислот 71
2.1.9. Газо-жидкостная хроматография метиловых эфиров жирных кислот 71
2.2. Анализ токбферолов 73
2.2.1. Экстракция токоферола 73
2.2.2. Выделение фракции токоферола 73
2.2.3. Количественное определение токоферола 74
2.3. Анализ каротиноидов 74
2.3.1. Экстракция каротиноидов 74
2.3.2. Разделение каротиноидов 75
2.3.3. Количественное определение каротиноидов 77
2.4. Определение активности ферментов антиокислительной защиты 79
2.4.1. Приготовление ферментной вытяжки 79
2.4.2. Определение активности супероксиддисмутазы 79
2.4.3. Определение активности гваяколпероксидазы 80
2.4.4. Определение количества белка 80
2.5. Определение антиокислительной активности лишайниковых веществ в опытах in vitro 81
2.6. Статистическая обработка результатов 82
Результаты и обсуждение 84
Глава 1. Результаты разделения симбионтов лишайников. Получение фракций, обогащенных грибами, водорослями и цианобактериями 84
Глава 2. Мембранные липиды лишайниковых симбионтов в норме и в условиях окислительного стресса 92
2.1. Состав индивидуальных фосфолипидов 92
2.2. Изменения в составе индивидуальных фосфолипидов лишайниковых симбионтов в ходе АКМ-индуцированного окислительного стресса 97
2.3. Состав жирных кислот фосфолипидов 105
2.4. Действие АКМ на состав жирных кислот фосфолипидов 112
2.5. Состав индивидуальных гликолипидов лишайниковых фотобионтов 123
2.6. Изменения в составе индивидуальных гликолипидов в ходе АКМ-индуцированного окислительного стресса 124
Глава 3. Антиокислительная система низкомолекулярных веществ липидной фазы у симбионтов лишайников 130
3.1. Каротиноиды лишайниковых симбионтов в норме и в условиях окислительного стресса 130
3.1.1. Состав каротиноидов 130
3.1.2. Изменение содержания каротиноидов как одна из реакций адаптации к воздействию АКМ 132
3.2. Содержание токоферолов у лишайниковых симбионтов в
норме и в условиях окислительного стресса 138
Глава 4. Ферменты антиокислительной защиты лишайниковых симбионтов в норме и в условиях действия АКМ 142
4.1. Супероксиддисмутаза 142
4.2. Гваяколпероксидаза 146
Глава 5. Антиокислительная активность лишайниковых веществ 151
Заключение 159
Выводы 163
Литература
- Биохимические системы регуляции взаимодействия между лишайниковыми симбионтами
- Окисление хлорофиллов
- Другие фенольные соединения
- Выделение фракции гликолипидов, фосфолипидов и ДГТС
Введение к работе
Полученные за последние годы многочисленные данные по анатомии, цитологии и физиологии лишайников дают основание рассматривать их как высокоспециализированную паразитическую ассоциацию (Ahmadjian, 1993) с элементами мутуалистических отношений (Hawksworth, 1988). Ее высокая стабильность по сравнению с большинством паразитарных систем связана с физиологическими особенностями симбионтов. Так, в качестве фотобионта (хозяина) в лишайниковом симбиозе могут существовать только самые неприхотливые виды водорослей, способные противостоять механическому и химическому воздействию грибного компонента. С другой стороны, способность водорослей нормально развиваться в талломе лишайника может быть обусловлена умеренностью паразитизма самого гриба, который, как известно, отличается от других паразитических видов более медленным ростом и низкой активностью физиологических процессов (Голлербах, Седова, 1974; Голубкова, 1977, 1993).
В настоящее время достигнуты большие успехи в области экспериментальной лихенологии. Однако биохимические основы взаимодействия симбионтов в талломе лишайника до сих пор остаются не выясненными. Предполагают, что для лишайниковой ассоциации, в которой микобионт постоянно контактирует со многими особями одноклеточных водорослей-хозяев, характерны те же неспецифические биохимические реакции, что и для типичной паразитарной системы. В частности, взаимодействие организмов в такой системе сопровождается генерацией активированных кислородных метаболитов (АКМ), которые образуются в результате действия ряда веществ, продуцируемых патогеном, а также в ходе защитных реакций хозяина. В связи с этим нами была выдвинута гипотеза о том, что эволюционный успех лишайникового симбиоза объясняться еще и тем, что в этой
высокоспециализированной ассоциации сформировались надежные и эффективные системы детоксикации АКМ, обеспечивающие защиту симбионтов от окислительного повреждения.
Защитные механизмы древних групп организмов (грибы, водоросли, мохообразные, папоротники, хвощи и плауны) не уступают по сложности защитным системам цветковых растений (Heath, 1987; Каратыгин, 1993). Лишайниковые симбионты, прошедшие долгий путь совместного существования, по-видимому, не являются исключением.
У живых организмов существуют две принципиальные стратегии (действующие независимо или в комбинации), обеспечивающие защиту от окислительного повреждения, вызванного действием АКМ (Cumming, Taylor, 1990). Первая включает изменение молекулярного состава мембран, что влечет за собой изменение проницаемости и, соответственно, доступности клеточных компонентов для токсичных продуктов. Вторая основана на активации систем, обеспечивающих химическую детоксикацию АКМ и свободных органических радикалов. Изучению реализации данных стратегий у симбионтов лишайников и посвящено наше исследование.
На первом этапе оценивалось действие АКМ на основной субстрат окисления -мембранные липиды. Прежде всего необходимо было ответить на следующие вопросы: 1) как влияет окислитель на фосфо- и гликолипиды (имеют место синхронные изменения в составе индивидуальных липидов или существуют различия в их чувствительности); 2) происходят ли в ходе окислительного стресса какие-либо адаптивные перестройки в липидном компоненте мембран; 3) изменяется ли состав ЖК липидов? Для того чтобы выяснить, как реагирует лишайник на экзогенное воздействие - как единый организм или же антагонизм в отношениях бионтов в условиях окислительного стресса еще более усиливается - исследования были проведены отдельно на фракциях, обогащенных тем или иным симбионтом (грибами, зелеными водорослями или цианобактериями). Индуктором АКМ служила смесь - Fe +-аскорбат, которую часто используют в подобных исследованиях (Kunimoto et al., 1981; McKersie et al., 1990 и др.), в частности при моделировании окислительного действия элиситоров в паразитарной системе (Rogers et al., 1988; Degousee et al., 1994).
На втором этапе исследований планировалось изучение ряда систем, способных в той или иной мере осуществлять антиокислительную защиту. В норме и в условиях окислительного стресса на фракциях, обогащенных различными симбионтами, были изучены изменения в составе низкомолекулярных липофильных соединений (токоферолы и каротиноиды), а также оценена активность ферментов антиокислительной защиты (супероксиддисмутазы, гваяколпероксидазы). Кроме того на модели сопряженного окисления (3-каротина и ненасыщенных ЖК было проведено сравнительное исследование потенциальной антиокислительной активности наиболее распространенных лишайниковых веществ фенольной природы.
Изучение особенностей функционирования антиокислительных систем лишайников имеет большое значение для разрешения многочисленных вопросов, касающихся взаимоотношений организмов в симбиотических ассоциациях. Кроме того, установленные в этом направлении закономерности помогут на новом уровне
взглянуть на проблему адаптации лишайников к стрессовым воздействиям окружающей среды.
Помимо теоретического значения, полученные результаты могут быть полезны и для решения ряда практических задач. Многие соединения растительного и грибного происхождения, обладающие антиокислительной активностью, находят широкое применение в различных отраслях промышленности и медицины. Углубленное изучение свойств этих веществ, а также их роли в устойчивости живых организмов к изменяющимся факторам внешней среды является научной основой дальнейшего направленного поиска новых биологически активных соединений.
Биохимические системы регуляции взаимодействия между лишайниковыми симбионтами
В ряде публикаций отмечается зависимость между уровнем морфологической организации лишайникового таллома, формой физических контактов между клетками мико- и фотобионта и химическим разнообразием вторичных соединений. Известно, что виды лишайников с примитивно устроенными талломами обычно не содержат специфических вторичных соединений (или это немногочисленная группа веществ). Напротив, виды с высоко организованными талломами способны синтезировать широкий спектр вторичных метаболитов (Culberson, 1969; Culberson et al., 1977; Elix, Whitton, 1984).
Биохимические аспекты регуляции активности фотобионта. Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что вторичные лишайниковые вещества, синтезируемые микобионтом, служат фактором, контролирующим функциональную активность фотобионта. Как правило, эти соединения способны увеличивать проницаемость мембран фотобионта, что влечет за собой ускоренный отток фотоассимилятов в клетки гриба (Follmann, 1960; Follmann, Peters, 1966). В частности, было показано, что усниновая кислота ингибирует рост и фотосинтетическую активность изолированных из лишайников зеленых водорослей Trebouxia, угнетает подвижность их зооспор, а также увеличивает проницаемость мембран (Kinraide, Ahmadjian, 1970). Физодовая и гирофоровая кислоты, напротив, стимулируют активность фотосинтеза и одновременно увеличивают проницаемость клеточных мембран как у свободноживущих, так и у изолированных зеленых водорослей (Равинская, Вайнштейн, 1976; Вайнштейн, 1985). Механизм действия лишайниковых веществ продемонстрирован в работах испанских исследователей (Vicente et al., 1978; Legaz, 1985). Было показано, что вторичные лишайниковые вещества способны ингибировать активность уреазы, которая, катализируя гидролиз мочевины до СО2 и NH3, участвует в регуляции фотосинтетической активности фотобионта (эффект стимуляции активности фотосинтеза уреазой достигается за счет увеличения процентного содержания СОг в межклетниках). Специфический механизм такого ингибирования объясняется тем, что лишайниковые вещества связываются с тиольными группами уреазы, что влечет за собой почти полное угнетение каталитической активности фермента (Cifuentes, 1985).
Биохимические аспекты регуляции активности микобионта. В литературе отсутствует фактический материал, объясняющий, каким образом осуществляется контроль над паразитической активностью микобионта. Ряд авторов, разделяющих точку зрения о регуляторном действии вторичных метаболитов на рост и развитие фотобионта, предполагают наличие у последнего факторов, участвующих в подавлении синтеза фитотоксичных, типичных для патогенных грибов хинонов. Такое подавление возможно на участке декарбоксилирования орселлиновой кислоты до орселлина -предшественника токсичных хинонов. Вместо этого орселлиновая кислота подвергается многоступенчатой этерификации с образованием типичных для лишайников депсидов, депсидонов и дибензофуранов, которые регулируют проницаемость клеток фотобионта (а в некоторых случаях угнетают их рост и развитие), но все же не обладают ярко выраженной фитотоксичностью (Schultz, Mosbach, 1971; Culberson, Ahmadjian, 1980) (рис. 4). Способность водоросли противостоять паразитической активности гриба может быть связана с наличием спорополленина - высокомолекулярного вещества, образующегося путем окислительной полимеризации каротиноидов и их эфиров, который откладывается в больших количествах в клеточных стенках фотобионта (Вайнштейн, 1988; Ahmadjian, 1993). На роль фактора, регулирующего паразитическую активность гриба, была предложена система фитохромов фотобионта - сложных белков из группы хромопротеинов. Предполагают, что они участвуют в регуляции дыхания, окислительного фосфорилирования, а также контролируют синтез вторичных метаболитов у микобионта (Legaz, Vicente, 1991). Растительные гормоны также выдвигались в качестве факторов, контролирующих паразитическую активность (Ott, Zwoch, 1992). Например, было показано прямое действие индолилуксусной кислоты и кинетина на дифференциацию таллома у культивируемых синтетических лишайников (Remmeretal., 1986). фото
За последние годы появилось много работ, характеризующих взаимоотношения организмов в системе «хозяин-патоген» в терминах свободнорадикальных реакций (Sutherland, 1991; Mechdy, 1994; Goodman, 1994). Способность к инициации таких реакций была показана для большой группы растений в ответ на действие патогенных грибов (Doke, 1983, 1985; Vera-Estrella et al., 1992; Schwacke, Hager, 1992), бактерий (Devlin, Gustine, 1992) и вирусов (Doke, Ohashi, 1988; Mittler et al., 1998). В то же время, было отмечено, что жизнедеятельность патогенов также сопровождается генерированием свободных радикалов. Несмотря на очевидную аналогию взаимоотношений между организмами в системе «хозяин-патоген» и в лишайниковой ассоциации, на сегодняшний момент в литературе отсутствуют данные о возможном свободнорадикальном механизме контроля взаимоотношений между симбионтами лишайника. Взаимодействия в системе «хозяин-патоген».
При взаимодействии растения-хозяина и патогена происходят сложные изменения в энергетическом и пластическом обмене обоих партнеров. Характерной чертой патоген-индуцированного повреждения является ускорение окислительных процессов, которые включают в себя активацию молекулярного кислорода с образованием большого числа активированных кислородных метаболитов (Sutherland, 1991; Mechdy, 1994), липоксигенирование (Peever, Higgins, 1989; Gardner, 1991; Hatcher, 1995) и пероксидацию мембранных липидов (Degousee et al., 1994), а также деструктивные изменения других физиологически важных соединений. В работе И.А. Тарчевского (1993) представлены возможные этапы взаимодействия патогенных организмов с растением-хозяином. Первый этап - конформационное узнавание. Второй - экскреция клетками патогенных грибов и бактерий ферментов, гидролизующих биополимеры и липиды кутикулярного покрова, что обеспечивает разрыхление поверхностного слоя и интенсивное проникновение патогена в ткани хозяина. Третий этап - образование в ходе деградации биополимеров и липидов различных физиологически активных промежуточных продуктов (элиситоров), выполняющих функцию сигнальных веществ в обеспечении ответной реакции клеток хозяина. В роли элиситоров могут выступать продукты деградации кутина (оксигенированные жирные кислоты и спирты), полисахариды клеточных стенок хозяина (Dixon, 1986; Kolattukudy, 1987), а также оксигенированные продукты мембранных фосфолипидов (ФЛ), образованные в результате активации липоксигеназ (Ильинская, Озерецковская, 1998). Аналогичную функцию могут выполнять липиды и липопротеины, продуцируемые патогенным грибом, причем элиситорным эффектом обладают их жирнокислотные остатки (Ильинская и др., 1991). Среди таких жирных кислот (ЖК) могут быть несвойственные растениям арахидоновая и эйкозапентаеновая (Zook, Кис, 1986; Конова, Бехтерева, 1991). Однако, в работе D.A. Davis, W.W. Currier (1988) было показано, что для индукции синтеза фитоалексинов и развития реакции сверхчувствительности необходимо гораздо большее количество эйкозаполиненасыщенных ЖК, чем то, которое имеется у патогена. Поэтому, для выяснения роли эйкозаноидов в развитии защитной реакции необходимы дальнейшие исследования. Возможно, в качестве элиситоров выступают не сами эйкозаноиды, а продукты их окисления. Известно, что в растениях могут осуществляться окислительные превращения чужеродных арахидоновои и эикозапентаеновои кислот с образованием типичных для животных лейкотриенов и липоксинов
Окисление хлорофиллов
Исследования последних лет показали, что 02 и Н202 являются малоэффективными окислителями липидов (константы скорости имеют значения ниже 103 М-1 с-1) (Каган и др., 1986). Значительно большей активностью в отношении липидов обладает гидроксильный радикал (НО ), который экстрагирует водород из О _ 1 1 липидной молекулы со скоростью 5x10 М с : -СН2- + НО - -С Н- + Н20. Такая реакция возможна в составе ЖК цепей мембранных липидов (Мерзляк, 1989; Halliwell, Gutteridge, 1990). Образовавшийся свободный радикал ЖК «стабилизируется» посредством делокализации неспаренной валентности. В результате происходит миграция двойной связи с образованием коньюгированного диенового хромофора, поглощающего в УФ области, который мгновенно вступает в реакцию с 02, с образованием пероксильного радикала: -С Н- + 02 - -СНОО -(Yu, 1994). Пероксильные радикалы, образующиеся в молекулах полиненасыщенных ЖК, представлены большим числом различных стереоизомеров. Например, у линолевой кислоты (Cig:2) пероксильные радикалы могут образовываться в равных количествах как при 9-ом, так и при 13-ом углеродных атомах. Каждый из образовавшихся пероксидов (9-00 и 13-00 ) может существовать в четырех геометрических формах. В диапазоне физиологических температур доминируют транс/цис формы, а при повышении t до 40—50С начинают преобладать транс/транс изомеры, при этом пропорция 9-00713-00 не изменяется (Porter et al., 1980; Porter, 1984; Frankel, 1985) (рис. 6). При анализе продуктов ПОЛ необходимо учитывать, что аналогичные пероксисоединения могут образовываться в ходе оксигеназного пути деградации ненасыщенных ЖК (Brash et al., 1987; Тарчевский, 1993; Grechkin, 1998). В этом случае, количество тех или иных изоформ определяется тем, какой изофермент липоксигеназы катализирует реакцию. Например, липоксигеназа сои катализирует, в
-26 основном, образование 13-00 , а липоксигеназа картофеля - 9-00 (В1ёе, 1998). Таким образом, окисление липидов в мембранах может идти как неферментативным, так и ферментативным путями, которые имеют между собой много общего и даже могут переходить один в другой. Радикалы, образовавшиеся ферментативным путем, могут инициировать неферментативное окисление, а гидропероксиды ЖК, образовавшиеся в ходе автоокисления, могут подвергаться дальнейшим ферментативным превращениям наравне с продуктами оксигеназных реакций с конечным образованием одних и тех же соединений (Blee, Shuber, 1990; Grechkin et al., 1991b). Независимо от того, протекает ли окисление с участием ферментов или без, согласно общей теории жидкофазного окисления органических соединений, рассматривают следующие основные стадии его развития: зарождение, продолжение, разветвление и обрыв цепи (Бурлакова, Храпова, 1985; Schaich, 1992; Yu, 1994; Климов, Никульчева, 1995 и др.).
Стадия зарождения цепи включает реакции образования пероксильных радикалов ЖК. Эти реакции могут инициироваться не только АКМ, но и липоксигеназами: RH- R\ R + 02 - ROO . Стадия продолжения цепи включает реакцию взаимодействия пероксильных радикалов (ROO ) с новыми ЖК цепями, как свободными, так и этерифицированными молекулах мембранных ФЛ: ROO + RH - ROOH + R .
Скорость реакций на этой стадии существенно зависит от активности ферментов, участвующих в образовании и гибели свободных органических радикалов и АКМ, от присутствия ингибиторов, активаторов и прочих веществ, высоко эффективных даже в малых концентрациях, а также от состава мембранных липидов (особенно, от количества двойных связей в ненасыщенных ЖК) (Журавлев, 1982; Бурлакова, Храпова, 1985; Elstner, Osswald, 1994). По-видимому, определяющую роль на этапах зарождения и продолжения цепи играет пространственная организация молекул липидов, которая влияет на доступность остатков ненасыщенных ЖК для свободных радикалов и Ог. Чем плотнее упаковка ЖК в липидах мембран, тем меньше доступ окисляющих агентов и тем ниже скорость зарождения новых свободных радикалов. Существует большое количество путей постсинтетической модификации липидов, обеспечивающих определенную структурную организацию молекул, в том числе, определенную плотность упаковки ЖК. Такая модификация может происходить за счет реакций цис/транс изомеризации, десатурации, элонгации и т.д. (Harwood, 1994; Heipieper et al., 1995; Keweloh, Heipieper, 1996).
Кроме того, одним из механизмов регуляции интенсивности ПОЛ на стадии продолжения цепи могут быть изменения в пропорциях липидных классов (Orr, Raison, 1987; Brown et at., 1991; Olsson, 1995; Olsson et al., 1996), а также в соотношении стерины/ФЛ и белки/ФЛ (Феофилова, 1994; Quartacci et al., 1995).
Стадия разветвления цепи (гомолитическое разрушение гидропероксидов) приводит к образованию из гидроперекисей новых свободных радикалов: ROOH - RO + НО . В основном, расщепление идет при достаточно высоких температурах (Каган и др., 1986) или, чаще, катализируется ионами металлов переменной валентности (Buettner, 1993). Гидроперекиси липидов могут взаимодействовать с ионами металлов, находящихся в разной степени окисленности. Наиболее быстро проходит реакция с участием Ре2+-комплекса: ROOH + Ре2+-комплекс - RO + НО + Ре3+-комплекс. Образовавшийся алкоксильный радикал (RO ), аналогично пероксильному (ROO ), способен участвовать в продолжении цепи окисления, реагируя с новыми молекулами ЖК: RO + RH - ROH + R . Следует отметить, что гомолитический распад гидроперекисей, приводящий к образованию свободных радикалов, которые отвечают за стадию разветвления цепи, не единственный путь катаболизма этих соединений. Активирование двойной связи. -находящейся по соседству с гидроперекисной группой, приводит к распаду гидроперекиси на альдегиды. Такой распад становится эффективным при повышенных температурах и протекает, по-видимому, по механизму, включающему внутримолекулярную перегруппировку гидроперекиси: -СН(ООН)-СН=СН- - -сн=сн-о-сн-он - -СОН + -СН2-СОН (Каган и др., 1986; Климов, Никульчева, 1995). Легкая поляризуемость неподеленной электронной пары гидроперекисной группы является причиной высокой скорости взаимодействия липидных гидроперекисей с нуклеофильными агентами (в основном, меркаптосоединениями), что сопровождается гетеролитическим разрывом 0-0 связей и образованием соответствующих окси-производных без промежуточных стадий радикалообразования: ROOH + X - ROH + ХОН (Бурлакова, Храпова, 1985; Каган и др., 1986).
Другие фенольные соединения
Лишайниковые вещества фенольной природы. Большинство лишайниковых микобионтов также продуцируют разнообразные фенольные соединения, среди которых депсиды, депсидоны, дибензофураны, ксантоны и др. (рис. 10). Поскольку по химической структуре эти соединения близки известным АО, по-видимому, они также должны обладать антиокислительными свойствами (Шапиро, 1996). Это было экспериментально подтверждено в работах последних лет. Так, ацетоновый экстракт из Xanthoria parietina тормозил окисление пирогаллола практически с такой же эффективностью, что и синтетический АО ализарин (Silberstein et al., 1996). Авторы предполагают, что активность ацетонового экстракта данного вида лишайника обусловлена присутствием антрахинона париетина, являющегося структурным аналогом ализарина. Также, на модели окисления микросом был показан прямой антиокислительный эффект липофильного полифенольного соединения - физодовой кислоты (Ichinose et al., 1994). Основываясь на данных, полученных in vitro, можно предположить, что и в талломе лишайника полифенольные соединения действуют как антиоксиданты. Такая функция лишайниковых полифенолов выглядит особенно актуальной на фоне антагонистических отношений бионтов в талломе. Состояние окислительного стресса, свойственное для системы «хозяин-патоген», вероятно, характерно и для лишайниковой ассоциации. В этой связи становится понятной имеющая место корреляция между количеством полифенолов и уровнем организации лишайникового таллома. Способность патогена (микобионта) успешно противостоять защитным механизмам хозяина (фотобионта) может объясняться в том числе и наличием целого ряда биологически активных полифенолов.
Глутатион по своей структуре является трипептидом (у-Ь-глютамил-Ь-цистенил-глицин). Это наиболее распространенное у животных (Yu, 1994) и растений (Foyer et el., 1997) серосодержащее соединение. У некоторых видов растений встречаются гомологи глутатиона, в которых глицин замещается аланином (Zopes et al., 1993) или серином (Klapheck et al., 1992). Окисление сульфогруппы глутатиона (Г-SH) приводит к образованию окисленного глутатиона (r-SS-Г), в котором две молекулы Г-SH связываются, образуя дисульфидный мостик. В норме количество окисленной формы r-SS-Г составляет 5—10% от общего количества глутатиона. В ходе окислительного стресса количество r-SS-Г резко увеличивается (Zhu et al., 1996). Как правило, вслед за этим активируется синтез восстановленных форм глутатиона. Предполагают, что синтез Г-SH запускается в ответ на появление в клетке окисленных форм глутатиона (Smith, 1985) или АКМ (May, Leaver, 1993).
Глутатион - полифункциональное соединение. Как и аскорбиновая кислота, он восстанавливает токофероксильные радикалы: ТО + Г-SH - ТОН + r-s\ 2r-S + НАДФН -» r-SS-Г + НАДФ (Yu, 1994). Участие глутатиона в детоксикации АКМ до сих пор дискутируется. По мнению отдельных исследователей, глутатион вступает в реакцию с АКМ (Foyer et al., 1997). Другие авторы полагают, что глутатион не способен утилизировать реактивные формы кислорода, а также напрямую ингибировать ПОЛ (Zhu et al., 1996).
Еще одной функцией глутатиона является участие в синтезе фитохелаторов (Chen, Goldsborough, 1994). Кроме того, Г-SH играет важную роль в системе «хозяин-патоген». Было показано, что увеличение количества T-SS-Г коррелирует с аккумуляцией фитоалексинов в клетках хозяина (Gustine, 1987). По мнению некоторых авторов, глутатион регулирует транскрипцию «защитных» генов в ходе патогенеза (Wingate et al., 1988).
Глутатионы лишайников. Было показано, что количество суммарной фракции глутатионов лишайников в норме колеблется от 550 нмоль г см. у Xanthoria parietina до 1800 нмоль г-1 см. у Ramalina lacera (Silberstein et al., 1996), причем их концентрация сильно изменяется в течение года. Например, у Pseudevernia furfuraceae, собранного летом, содержание глутатионов было почти в два раза выше, чем у собранного осенью (Kranner, Grill, 1996). Кроме того, их количество резко меняется при увлажнении талломов (Kranner, Grill, 1994). Несмотря на то, что концентрация глутатионов у лишайников сравнима с их концентрацией у растений (Badiani et al., 1996; Grace, Logan, 1996), имеются существенные различия в соотношении Г-SH и Г-SS-Г. Если у растений в норме количество окисленной формы, как правило, не превышает 10% (Kampfenkel et al., 1995), то у лишайников T-SS-Г может составлять 40% и более от общей фракции глутатионов (Kranner, Grill, 1996). Этот факт свидетельствует либо о более высоком уровне процесса окисления, протекающего в норме в талломе лишайников, либо о менее активной, по сравнению с растениями, системе регенерации окисленного глутатиона. В любом случае, в условиях стресса пул восстановленного глутатиона может оказаться недостаточным для успешного функционирования антиокислительных систем.
Каротиноиды уже давно рассматривают в ряду антиоксидантов в связи с их способностью утилизировать свободные радикалы (Krinsky, 1979, 1989; Krinsky, Deneke, 1982; Burton, Ingold, 1984; Larson, 1988; Loggini et al., 1999 и др.). Однако, несмотря на то, что антиокислительная активность каротиноидов была продемонстрирована в многочисленных исследованиях in vitro, включая липидные растворы, липосомы и изолированные мембраны, механизм антиокислительного действия этих соединений до сих пор точно не выяснен.
Наиболее эффективны каротиноиды в тушении избыточной энергии триплетных хлорофиллов (Маслова и др., 1996) и 02 (Krinsky, 1971; Foote, Denny, 1988; Rau, 1988; Di Mascio et al., 1989, 1992): T хлорофилл + каротиноид — хлорофилл + каротиноид, Ог + каротиноид — 02 + 3каротиноид. Образующийся триплетный каротиноид легко отдает избыточную энергию в окружающую среду в виде тепла. Особая роль в процессе тушения избыточной энергии принадлежит ксантофиллу зеаксантину. В ряде экспериментов была показана положительная корреляция между накоплением зеаксантина и активностью процесса рассеивания энергии (Demmig et al., 1987; Demmig-Adams, 1990). Необходимый для тушения избыточной энергии "дополнительный" зеаксантин может образовываться путем аскорбат-зависимой деэпоксидации виолаксантина (Neubauer, Yamamoto, 1992).
Кроме участия в защите клеточных структур от фотодеструкции, не менее важными представляются реакции взаимодействия каротиноидов с органическими радикалами ЖК (Palozza, Krinsky, 1992; Yu, 1994). Хотя не исключена возможность взаимодействия каротиноидов с пероксильными радикалами, согласно реакции: каротиноид + ROO — каротиноид + R.OOH, большинство авторов полагает, что каротиноиды действуют не как доноры водорода, что характерно для токоферола и других фенольных соединений, а как «ловушки» радикалов. Согласно этой точке зрения, пероксильные радикалы ЖК ковалентно связываются с коньюгированной системой двойных связей каротиноида.
Выделение фракции гликолипидов, фосфолипидов и ДГТС
Содержание ФЛ (в мкг липидного Р) определяли по методу Васьковского (Vaskovsky et al., 1975). ФЛ, разделенные с помощью ВЭТСХ, обнаруживали, обрызгивая пластинки 10% раствором серной кислоты в метаноле с последующим нагреванием при 180С в течение 10 мин. Каждую зону силикагеля, соответствующую индивидуальному липидному классу, переносили в пробирки из термостойкого стекла и добавляли 0.05 мл 72% хлорной кислоты. Пробирки нагревали в металлическом блоке при 180—200С в течение 30 мин. После охлаждения в пробирки добавляли 0.9 мл рабочего раствора реагента, содержащего молибдат натрия и солянокислый гидразин. В качестве контроля использовали зону силикагеля, свободную от липидных пятен. Для построения калибровочной кривой (рис. 15) отбирали силикагель, на который предварительно были нанесены растворы КН2РО4 различной концентрации, содержащие от 0.1 до 1 мкг фосфора. Силикагель в контрольных и опытных пробирках тщательно перемешивали с реагентом и нагревали смесь на кипящей водяной бане в течение 15 мин. Силикагель отделяли центрифугированием при 2000 g в течение 10 мин. Поглощение супернатанта измеряли на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 815 нм.
Исходя из содержания фосфора в пробах рассчитывали количество ФЛ. Для этого количество фосфора (мкг) умножали на переводной коэффициент: к= МфЛ где МФЛ - молекулярный вес ФЛ, Мр - молекулярный вес фосфора, Np - число атомов фосфора в молекуле ФЛ. Молекулярный вес ФЛ вычисляли по формуле: МФЛ = Мпг + Мш х NXK , где Мпг - молекулярный вес полярной группы ФЛ , Мжк - средний молекулярный вес ЖК, Ижк - количество ЖК в молекуле ФЛ. Мжк вычисляли по формуле: %ЖК, х Мжк, Мжк =2 Я 1=1 где %ЖКІ - относительное содержание ЖК, входящей в состав ФЛ, в процентах, Мжк, п - молекулярный вес ЖК, входящей в состав ФЛ, %ЖК: - сумма процентов всех /=1 идентифицированных ЖК ( 100). I ю оо Q. О о X 1-о п. и: ГО ;«: О Ш т I-о
Количество ГЛ определяли по методу Радина (Radin et al., 1955) с модификациями (Бычек, 1995). Зоны силикагеля, соответствующие индивидуальным ГЛ, переносили в пробирки, добавляли 1 мл антронового реактива, тщательно перемешивали и нагревали на водяной бане в течение 15 мин при 85С. Антроновый реактив готовили разведением исходного раствора (20% антрон в 95% H2SO4) водой в соотношении 2:1. После нагревания пробы охлаждали, силикагель осаждали
Мпг ФХ = 329.3, Мпг ФЭ = 269.2, Мпг ФГ = 300.1, Мпг ДФГ = 508.3, Мпг ФС = 3 13.3, Мпг ФИ = 388.2 (Досонидр. Поглощение надосадочной жидкости измеряли на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 625 нм. В качестве контроля использовали холостую пробу с чистым силикагелем и 1 мл антронового реактива. Калибровочную кривую (рис. 16) строили по стандартному раствору галактозы (от 10 до 100 мкг галактозы в пробе). ю см CD о о I t-о с го о т 0.25 0.15 . 0.2 0.1 0. 10 20 30 мкг галактозы Рис. 16. Калибровочная кривая для определения гликолипидов. Исходя из содержания галактозы в пробах рассчитывали количество ГЛ. Для этого количество галактозы умножали на переводной коэффициент: М, ГЛ К Мг х Nr где Мрл - молекулярный вес ГЛ, Мг - молекулярный вес галактозы, Np - число остатков галактозы в молекуле ГЛ. Молекулярный вес ГЛ вычисляли по формуле: Мгл =МПГ +МжкхМ, где Миг - молекулярный вес полярной группы ГЛ , М жк - средний молекулярный вес ЖК, Ыжк - количество ЖК в молекуле ГЛ. Мпг МГДГ = 3, 1991). центрифугированием при 2000 g в течение 10 мин. 08, Мпг ДГДГ = 470, Мпг СХДГ = 372.
Содержание ДГТС определяли по методу Кабары-Чена (Kabara, Chen, 1976) с модификациями. Зону силикагеля, соответствующую ДГТС, обнаруженную раствором серной кислоты, снимали с пластинки и растирали до однородного состояния. Силикагель помещали в термостойкие пробирки, добавляли 1 мл 15М H2SO4 и тщательно перемешивали содержимое. В качестве контроля использовали силикагель с чистых участков пластинки. Пробирки нагревали в металлическом блоке при 150— 160С в течение 20 мин. После охлаждения пробирок, силикагель отделяли центрифугированием при 2000 g в течение 10 мин. Поглощение образцов измеряли при длине волны 375 нм. Расчет проводили по калибровочной кривой (рис. 17), которую строили по стандартным растворам пальмитиновой кислоты.
и растительным тканям (Gidrol et al., 1989; Blokhina et al., 1999). Данный метод основан на том, что гидроперекиси липидов, существующие, в основном, в коньюгированной форме, имеют максимум поглощения в УФ, отличающийся от максимума поглощения неокисленных НЖК с несопряженными двойными связями (Pryor, Castle, 1984). У коньюгированных диеновых гидроперекисей максимум поглощения находится в интервале 232—236 нм, в зависимости от положения сопряженных двойных связей (Brash et al., 1987), с плечом в области 258—284 нм, соответствующим триеновым гидроперекисям и кето-производным ЖК (Кейтс, 1975; Recknagel, Glende, 1984; Каган и др., 1986), в то время как максимум поглощения НЖК с несопряженными двойными связями лежит в более коротковолновой области спектра (190—220 нм). Поскольку в анализируемом материале, как правило, преобладают ЖК с изолированными двойными связями, максимум поглощения, характерный для сопряженных связей вырождается в плечо на склоне интенсивного максимума поглощения изолированных двойных связей. По этой причине оптическая плотность, измеряемая в интервале 232—236 нм, является суммой оптических плотностей сопряженных двойных связей (продуктов ПОЛ) и изолированных двойных связей, не являющихся продуктами ПОЛ, и следовательно, не может быть количественной мерой содержания гидроперекисей. Поэтому более правильным является представление результатов в виде относительных величин, например, с использованием индекса Клейна (индекс окисленности ЖК), который вычисляется как отношение поглощения образца в интервале 232—236 нм к поглощению в интервале 215—220 нм (Klein, 1970).