Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 9
1.1. Мобильность ионных каналов и виды пластичности нервной клетки 9
1.2. Клеточный аналог привыкания 11
1.3. Эндо- и экзоцитоз ионных каналов и механизмы пластичности нервной клетки 13
1.3.1. Роль моторных белков в эндо- и экзоцитозе ионных каналов 13
1.3.1.1. Кинезин – моторный белок антероградного транспорта .16
1.3.1.1.1. Строение кинезина 16
1.3.1.1.2. Механизм движения кинезина .17
1.3.1.2. Динеин – моторный белок ретроградного транспорта 18
1.3.1.2.1. Строение динеина .18
1.3.1.2.2. Механизм движения динеина 19
1.3.1.3. Миозин – моторный белок актиновых микрофиламентов .19
1.3.1.3.1. Особенности строения миозина .19
1.3.2. Роль моторных белков в механизмах пластичности нейрона 20
1.3.2.1. Высвобождение медиатора в пресинаптическом окончании 20
1.3.2.2. Возбуждающие рецепторы .25
1.3.2.3. Тормозные рецепторы 29
1.3.2.4. Перестройка актинового цитоскелета 31
1.3.2.5. Сигнальные молекулы, участвующие в рециклировании рецепто-ров 32
1.3.2.6. Рецепторы нейротрофинов 34
1.4. Латеральная диффузия ионных каналов и механизмы пластичности нервной клетки 36
1.4.1. Ультраструктура плазмалеммы и кластеризация ионных каналов.. 36
1.4.1.1. Липидные рафты .38
1.4.1.2. Актин-связывающие белки 40
1.4.2. Механизмы латеральной диффузии рецепторов 42
1.5. Вклад эндо- и экзоцитоза и латеральной диффузии ионных каналов в механизмамы пластичности нейрона 45
2. Методика 48
2.1. Экспериментальный объект .48
2.2. Препаровка париетального ганглия 48
2.3. Регистрация трансмембранных ионных токов 48
2.4. Тестирующая аппликация 49
2.5. Протокол эксперимента 51
2.6. Фармакология .51
2.7. Статистический анализ 56
3. Результаты 59
3.1. Влияние Eg5 Inhibitor V, ингибитора кинезина Eg5, на депрессию АХ-тока нейронов на клеточном аналоге привыкания 59
3.2. Влияние Eg5 Inhibitor III, ингибитора кинезина Eg5, на депрессию АХ-тока нейронов на клеточном аналоге привыкания .61
3.3. Влияние EHNA, ингибитора динеина, на депрессию АХ-тока нейронов на клеточном аналоге привыкания 62
3.4. Влияние ML-7, ингибитора миозина легких цепей киназы, на депрессию АХ-тока нейронов на клеточном аналоге привыкания .63
3.5. Влияние MLCK-IP-18, ингибитор миозина легких цепей киназы, на депрессию АХ-тока нейронов на клеточном аналоге привыкания 64
3.6. Влияние MCD, вымывающего холестерол из плазматической мембраны, на депрессию АХ-тока нейронов на клеточном аналоге привыкания .65
3.7. Влияние Ro 48-8071, ингибитор синтеза холестерола, на депрессию АХ-тока нейронов на клеточном аналоге привыкания .66
3.8. Влияние антител против белка спектрина на депрессию АХ-тока нейронов на клеточном аналоге привыкания .67
3.9. Влияние антител против белка мерлина на депрессию АХ-тока нейронов на клеточном аналоге привыкания 68
4. Обсуждение 72
4.1. Влияние ингибиторов кинезина Eg5 III и Eg5 V, динеина EHNA и миозина ML-7 и MLCK-IP-18 на эндо- и экзоцитоз Ах-рецепторов при кратковременной депрессии Ах-тока в командных нейронах H. lucorum на клеточном аналоге привыкания 72
4.2. Влияние MCD, вымывающего холестерол, ингибитора синтеза холе-стерола Ro 48-8071 и антител против актинсвязывающих белков spectrin и merlin на латеральную диффузию Ах-рецепторов при кратковременной депрессии Ах-тока в командных нейронах H. lucorum на клеточном аналоге привыкания .77
4.3. Модель участия эндо- и экзоцитоза и латеральной диффузии нАх-рецепторов в кратковременной депрессии Ах-тока в командных нейронах H. lucorum на клеточном аналоге привыкания
5. Заключение 89
6. Выводы .91
7. Список литературы
- Клеточный аналог привыкания
- Препаровка париетального ганглия
- Влияние ML-7, ингибитора миозина легких цепей киназы, на депрессию АХ-тока нейронов на клеточном аналоге привыкания
- Влияние MCD, вымывающего холестерол, ингибитора синтеза холе-стерола Ro 48-8071 и антител против актинсвязывающих белков spectrin и merlin на латеральную диффузию Ах-рецепторов при кратковременной депрессии Ах-тока в командных нейронах H. lucorum на клеточном аналоге привыкания
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Изменение числа ионных каналов на поверхности плазмалеммы за счет внутриклеточного транспорта является одним из механизмов регуляции эффективности электровозбудимой мембраны (Borgdorff, Choquet, 2002; Paul 2009). Сбои во внутриклеточном транспорте приводят к нарушению циклирования ионных каналов, что оказывает сильное
влияние на механизмы пластичности нейрона (Kennedy et al. 2006, Santos et al.
2009). Известно, что механизмы пластичности лежат в основе обучения и памяти, а также гомеостатических изменений, происходящих в нейроне (Martin et al. 2002; Vitureira, Goda, 2013). Понимание этих механизмов,
обуславливающих работу нервной системы, – важно для разработки диагностики и лечения нейродегенеративных заболеваний.
Степень разработанности темы. Исследования последних 5 лет на
командных нейронах виноградной улитки H. lucorum показали, что изменение
холиночувствительности сомы нейронов при кратковременной депрессии
ацетилхолинового тока (Ах-тока) зависит от эндо- и экзоцитоза (Махновский и
др. 2010; Махновский и др. 2012; Пивоваров и д. р. 2013; et al. 2015).
Уменьшение мембранных никотиновых ацетилхолиновых рецепторов (Ах-
рецепторов) происходит за счет интернализации вследствие усиления их
эндоцитоза, а восстанавление ответа нейрона связано с превалированием
встраивания над интернализацией Ах-рецепторов. Количество функциональных
Ах-рецепторов на поверхности плазмалеммы также может зависеть от их
латеральной диффузии. Предварительный анализ с применением
математической модели выявил зависимость холиночувствительности нейронов при кратковременной депрессии Ах-тока не только от эндо- и экзоцитоза, но и от их латеральной диффузии (Мурзина, 2013).
Цели и задачи исследования. Основной целью данной диссертационной работы является изучение вклада моторных белков внутриклеточного
транспорта Поставленная цель достигается решением следующих задач:
1). Исследование роли моторных белков микротрубочек кинезина Eg5 и диненина в на клеточном аналоге привыкания.
2). Исследование роли моторного белка актиновых филаментов миозина в кратковременной депрессии холиночувствительности сомы командных нейронов виноградной улитки на клеточном аналоге привыкания.
3). Исследование в условиях обеднения плазматической мембраны холестеролом кратковременной депрессии холиночувствительности сомы командных нейронов виноградной улитки на клеточном аналоге привыкания.
4). Исследование роли актин-связывающих белков спектрина и мерлина в
Научная новизна исследования. В представленной диссертационной
работе впервые изучен вклад Показано участие моторных белков
микротрубочек, актиновых микрофиламентов, липидных рафтов и
актинсвязывающих белков спектрина и мерлина в депрессии
холиночувствительности сомы командных нейронов виноградной улитки.
Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты исследований, представленные в данной диссертационной работе, носят фундаментальный характер, подтверждая, и дополняя современные знания о
механизмах пластичности, известные для нервной системы млекопитающих и других беспозвоночных.
Положения, выносимые на защиту.
1). Моторные белки внутриклеточного транспорта принимают участие в
регуляции числа никотиновых Ах-рецепторов сомы командных нейронов
виноградной улитки при кратковременной депрессии
холиночувствительности соматической мембраны на клеточном аналоге привыкания.
2). Латеральная диффузия принимает участие в регуляции числа никотиновых
Ах-рецепторов командных нейронов виноградной улитки при
кратковременной депрессии холиночувствительности соматической мембраны на клеточном аналоге привыкания. Степень достоверности и апробация результатов. Результаты работы
были представлены на международных конференциях: «
» 2014 Нижний Новгород, Россия; «IV
съезд физиологов СНГ» 2014 Сочи, Дагомыс; «» 2015 Балатон, «ХI региональная конференция международного общества нейробиологии беспозвоночных простые нервные системы» 2016 Звенигород, Россия Венгрия; «10th FENS FORUM» 2016, Копенгаген, Дания.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, из них 3 статьи в рецензируемых международных и отечественных журналах, входящих в перечень ВАК РФ, и 3 тезисов докладов международных конференций.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, методики, результатов исследования, обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 107 страницах, содержит 18 рисунков и 3 таблицы. Список литературы включает 140 источников, из них 131 на иностранном языке.
Клеточный аналог привыкания
Моторные белки играют ключевую роль во внутриклеточном транспорте, участвуя в переносе органелл, мембранных белков, ионных каналов, предшественников синаптических везикул, эндосом, мРНК, сигнальных молекул и элементов цитоскелета из одного компартмента клетки в другой (Hirokawa 1998, Vale et al. 2000). По направлению транспорт подразделяют на антероградный, от центра сомы клетки к нервным окончаниям, и ретроградный, от нервных окончаний к центру сомы. Антероградный транспорт осуществляется моторными белками надсемейства кинезинов, ретроградный – динеинов. В обе стороны движение моторных белков происходит вдоль микротрубочек, ориентированных продольно нервным окончаниям (Shea et al. 2001).
По скорости транспорт подразделяют на быстрый и медленный. В нейронах млекопитающих выделяют, по меньшей мере, два диапазона скоростей быстрого антероградного транспорта: 100-400 мм в день и 20-70 мм в день, в обоих случаях переносятся органеллы (Vallee et al.1991). Что касается ретроградного аксонального транспорта, то с помощью радиоактивного мечения было показано, что его скорость варьирует от 130 до 230 мм в день (Bisby et al. 1977, Mitsumoto et al. 1990). Показано, что сигналы, которые клетка получает извне, опосредованы нейротрофинами. Они поддерживают жизнеспособность клеток, стимулируя рост и развитие нейронов. Именно, в результате ретроградного транспорта нейротрофины доставляются к соме клетки, где они запускают сигнальные каскады (DiStefano et al. 1992).
В медленном аксональном транспорте выделяют две компоненты: «A» и «Б». Компонентой «А» обозначают транспорт микротрубочек и нейрофиламентов, происходящий со скоростью 0.1–1 мм в день. Компонентой «Б» - транспорт растворимых белков, клатрина, мономеров актина, гликолитических ферментов и Cu-Zn супероксиддисмутаз, происходящий со скоростью 5–10 мм в день (Shah et al. 2002).
Согласно теории «стоп энд гоу» (stop-and-go), выдвинутой Brown (2000), моторные белки суперсемейства кинезинов и динеинов, помимо участия в быстром аксональном транспорте, также участвуют в медленном аксональном транспорте нейрофиламентов («A») (Brown, 2000). Таким образом, несмотря на то, что по скорости выделяют несколько видов аксонального транспорта, тем не менее, в них принимают участие одни и те же моторные белки. Микротрубочки, нейрофиламенты и актиновые филаменты являются компонентами цитоскелета. Микротрубочки состоят из гетероди-меров белка - и -тубулина, которые, поляризуясь с участием энергии гидролиза ГТФ, образуют полые цилиндры диаметром 25 нм (Desai et al. 1997). Направление транспорта задается полярностью микротрубочек. На «плюс» конце происходит сборка гетеродимеров тубулина, на «минус» - разборка. В аксонах и дистальных дендритах микротрубочки всегда направлены «плюс» концом к окончаниям нервных волокон, «минус» - к телу клетки, в то время как в проксимальных дендритах полярность - смешанная. (Hirokawa et al. 2010).
Актиновые микрофиламенты образуются в результате полимеризации белка актина с участием энергии гидролиза АТФ. Они представляют собой тонкие нити, формирующие густую сеть в подмембранном пространстве. Тонкие нити актина так же имеют полярность, как и микротрубочки: растущие концы направлены в сторону плазматической мембраны, разбирающиеся – в центр клетки. (Pollard et al. 2003).
Движение по актиновым филаментам выполняется моторными белками миозинами (Langford et al. 2002). Моторные белки семейства миозинов участвуют в транспорте везикул в подмембранном пространстве, а также в инвагинации мембраны в процессе формирования везикулы и ее последующей отщеплении от плазматической мембраны (Apodaca, 2001).
Рассмотрим на примере кинезина-1 строение молекулы кинезинов. Отличительной особенностью молекулы надсемейства KIFs является глобулярный домен в 360 аминокислотных остатков. Этот консервативный домен, который также еще называют «головкой» или моторным доменом, одновременно содержит каталитический центр, в котором гидро-лизуется АТФ и сайт связывания с микротрубочками. К «головке» крепится «ножка», представляющая собой переплетение двух биспирально закрученных тяжелых цепей – вся эта структура носит название кинезин тяжелые цепи (KHC). С-конец «ножки», оканчивается веерообразной структурой, соединяющейся с легкими цепями (KLC). Этот участок носит название «хвост». «Головка» отвечает за передвижение, в то время как «ножка-хвост» – за образование связей с транспортируемыми молекулами: белками, липидами или нуклеиновыми кислотами.
Между «головкой» и «ножкой» выделяют еще одни фрагмент – «шейка». Этот участок несет в себе характерные черты семейства. Показано, что для некоторых семейств этот участок отвечает за направление движения и регуляцию активности (Diefenbach et al. 1998, Miki et al. 2005). Например, молекулярный механизм, регулирующий образование димера кинезина-3 из мономеров KHC локализован на участке «шейка». В случае KIF13A и KIF13B критическим участком является остаток про-лина, располагающийся между «шейкой» и первым сегментом «ножки» (Soppina et al. 2014). В работе Soppina и коллег (2014) установлена связь между димеризацией кинезина-3 и его высокой процессивностью движения со средней скоростью пробега в 10 мкм
Препаровка париетального ганглия
В случае тормозных синапсов комплекс якорные белки-рецептор также может регулироваться на уровне актинового цитоскелета. Якорный белок гефрин через цитоплазматический участок взаимодействует с актиновым ци-тоскелетом и микротрубочками. Соответственно, нарушение одного из элементов клеточного цитоскелета по-разному влияет на распределение глициновых рецепторов. Деполимеризация микротрубочек индуцирует распространение в латеральном направлении обогащенных глициновыми рецепторами микродоменов, уменьшая параллельно уровень белка гефрина. Напротив, деполимеризация актиновых филаментов способствует образованию маленьких кластеров, обогащенных белком гефрином. Что касается ГАМК-рецепторов, то для них не было показано гефрин-цитоскелет взаимодействие (Choquet et Triller, 2003).
Латеральная мобильность рецепторов также является одним из механизмов гомеостатической пластичности. Известно, что синапсы спинного мозга – смешанные, содержат глициновые и ГАМК-рецепторы. Леви с коллегами было показано, что увеличение НМДА индуцированной латеральной диффузии глициновых рецепторов коррелирует с увеличением числа кластеризованных глициновых рецепторов и амплитуды ингибиторного тока. Изменения диффузных свойств глициновых рецепторов происходили быстрее, чем изменение числа синаптических глициновых рецепторов, а также белка гефрина. Вдобавок, НМДА-зависимая регуляция латеральной диффузии требовала увеличение концентрации внутриклеточного кальция за счет кальциевых депо. Таким образом, в случае смешанных синапсов спинного мозга этот механизм обеспечивает быструюрадигомеостатическую регуляцию в ответ на высвобождения НМДА из пресинаптического окончания (Lvi et al. 2008).
Из вышесказанного следует, что эндо- и экзоцитоз и латеральная мобильность ионных каналов являются фундаментальными механизмами, лежащими в основе изменения числа рецепторов на поверхности плазматической мембраны. А регуляция числа рецепторов – важна не только в случае механизмов синаптической пластичности, но и в случае гомеостатической пластичности. Что значительно расширяет рамки актуальности этих процессов в физиологии отдельного нейрона.
Ионные каналы синтезируются в эндоплазматической сети, затем проходят посттрансляционную модификацию в аппарате Гольджи, после чего, либо доставляются в везикулах по микротрубочкам, а затем по ак-тиновым филаментам на поверхность плазматической мембраны сомы нейрона, либо с участием тех же самых элементов клеточного цитоске-дета транспортируются в нервные окончания.
После того, как ионные каналы оказываются в толще плазматической мембраны, они за счет механизмов латеральной диффузии способны диффундировать в ней к месту назначения. Интересно отметить, например, что процессы эндо- и экзоцитоза рецепторов осуществляются в основном в околосинаптической зоне, куда/откуда рецепторы диффундируют из синаптической зоны.
В процессах эндо- и экзоцитоза принимают участие много разных белков. Стоит упомянуть хотя бы белки SNARE комплекса, без которых невозможно было бы слияние везикулы с поверхностью синаптической мембраны. Но также немаловажную роль в доставке везикул к месту назначения в процессе рециклирования ионных каналов, в особенности, рецепторов, играют моторные белки.
Несмотря на то, что на сегодняшний день у нас мало прямых данных, говорящих о роли кинезина, динеина и миозина в синаптической пластичности, тем не менее, их роль в нейрональном транспорте, в качестве единственных моторных белков цитоскелета, косвенно подтверждает их участие в механизмах синаптической пластичности.
Кинезин и динеин, связываются с белками пре- и постсинаптиче-ской плотности, для которых показано участие в механизмах синаптиче-ской пластичности (Yao et al. 2004; Zhu et al. 2005). Есть прямые данные, показывающие корреляцию между ингибированием кинезина Eg5 мона-стролом и исчезновением долговременной потенциации (Ari et al. 2004). Индукция долговременной фасилитации в Aplysia требует повышенного уровня экспрессии кинезина легких цепей в пре- и постсинаптических окончаниях (Puthanveettil et al. 2008). Какое определенное место моторные белки занимают в регуляции биохимических каскадов механизмов пре- и постсинаптической пластичности – это еще предстоит выяснить.
Миозин II участвует в динамической реорганизации актинового цитоскелета в дендритических шипиках во время формирования потен-циации (Hirokawa et al. 2010). Mиозин VI принимает участие в транспорте везикул по актиновым микрофиламентам, а также в инвагинации мембраны в процессе эндоцитоза рецепторов (Apodaca, 2001). Следовательно, он вносит вклад в механизмы синаптической пластичности посредством своего участия в рециклировании ионных каналов и перестройке актинового цитоскета.
Латеральная мобильность обусловлена нарушением жесткой структуры липидных рафтов, образующих кластеры в плазматической мембране и подмембранного актинового цитоскела, фиксирующего белковые мембранные комплексы. Это может осуществляться разными путями. Один из таких путей – увеличение вязкости мембраны (Allen et al. 2007). Другой – разборка актинового цитоскелета (Zhou et al., 2000). Этот процесс может происходит под действием разных блокаторов против белков, участвующих в полимеризации актинового цитоскелета и его стабилизации. Например, изменение концентрации внутриклеточного кальция, либо блокады определенных представителей группы актин-связывающих белков, например, спектрин и мерлин, через которых мембранные белки непосредственно крепятся к филаментам актинового цитоскелета (Wechsler et Teichberg, 1998; McClatchey et al. 2005). Таким образом, эндо- и экзоцитоз не может осуществляться непосредственно в некоторых компартментах плазматической мембраны, что требует участия латеральной мобильности.
Влияние ML-7, ингибитора миозина легких цепей киназы, на депрессию АХ-тока нейронов на клеточном аналоге привыкания
Eg5 ингибитор V и Eg5 ингибитор III в концентрации 15 цМ и 10 цМ соответственно подавляли среднюю скорость депрессии Ах-тока до выхода на плато с 4.55 ± 0.87 %/мин до 1.51 ± 0.40 %/мин и с 4.55 ± 0.87 %/мин до 3.23 ± 0.84 Рис и Рис соответственно. Кривая с Eg5 ингибитор V так же, как и кривая с Eg5 ингибитор III, обе достигали плато через 12 минут по сравнению с контрольной кривой, достигающей его за 6 миную после начала аппликации с интервалом в 3 минуты. Кривая с Eg5 ингибитор V практически повторяет кривую с Eg5 ингибитор III, что говорит о высокой достоверности эффекта и его динамики на кривую привыкания (Рис 14).
Согласно модели (Пивоваров и др., 2013) блокирование моторного белка кинезина должно приводить к увеличению константы скорости к3 и, следовательно, к торможению процесса экзоцитоза, что должно сказываться на увеличение скорости депрессии Ах-тока. Но видим, что данные полученные с ингибиторами Eg5 - противоположны этому предположению.
Объяснение этому факту стоит искать в функциях, которые выполняет кинезин Eg5 в клетке. Несмотря на то, что он традиционно считается кинези-ном митотического веретена (Blangy et al. 1995), в последние годы появилось несколько работ, показывающих его роль во внутриклеточном транспорте и участие в механизмах синаптической пластичности (Ari et al. 2004; Wakana et al. 2013).
Интересно отметить, что отличительной особенностью серий с ингибиторами Eg5 является быстрое достижение ими плато, за 12 минут, по сравнению, например, с динамикой кривых ингибиторов миозина легких цепей ки-назы ML-7 и MLCK-IP-18 (Рис. 7, Рис. 8, соответственно), которые достигают его за 18 минут. Такое быстрый выход на контрольный уровень депрессии Ах-тока говорит о имеющимся компенсаторном механизме. И, действительно, принимая во внимание современные данные по белкам семейства кинези-нов, в одной клетки одновременно существуют разные представители семейства кинезинов, делящие между собой функции антероградного транспорта. Кроме этого, функции между представителями разных подсемейств кинези-нов могут перекрываться, как, например, в случае конвенционального кине-зина, чьи многочисленные функции кажутся избыточными (Hirokawa, Noda, 2008). Таким образом, помимо кинезина Eg5 во внутриклеточном транспорте также принимают участие другие представители семейства кинезинов, видимо, поэтому мы не видим теоретически ожидаемого эффекта.
Что касается механизма действия Eg5, то Wakana et al. было установлено, что кинезин Eg5 участвует в транспорте специфических везикул, названных CARTS из транс-сети Гольджи к поверхности плазматической мембраны (Wakana et al. 2013). Из этого следует, что блокирование Eg5 оказывает влияние не на константу скорости k3, отображающую скорость интернализации Ах-рецепторов, а на константу скорости k4. Интересно отметить, что на 9-ой минуте у обоих кривых ингибиторов кинезина Eg5 наблюдается статистически достоверное различие значений амплитуды ответа по сравнению с контролем (Рис. 4 и Рис. 5). Такое поведение кривой депрессии Ах-тока связано, вероятно, с тем, что, блокируя поступление вновь синтезированных рецепторов на поверхность плазматической мембраны, нарушается равновесие между пулами Rb R2, и R3j что приводит соответственно к другим значением констант скоростей.
В связи с этим полученные нами данные являются еще одним подтверждением, того, что функции кинезина Eg5 - шире, чем это было принято считать ранее.
Ингибитор EHNA в концентрации 50 \хМ увеличивал время выхода на плато кривой депрессии Ах-тока до 18-ой минуты по сравнению с контрольной кривой, достигающей его за 6 миную, за счет уменьшения средней скорости депрессии Ах-тока до выхода на плато с 4.55 ± 0.87 %/мин до 1.46 ± 0.37 %/мин. Согласно вышеозначенной модели, блокирование динеина EHNA, участвующего в ретроградном транспорте (Asai, Коопсе, 2001), должно уменьшать значение константы скорости эндоцитоза к2, следовательно, замедляя депрессию амплитуды ответа Ах-тока (Мурзина 2013). В этом случает полученные экспериментальные данные частично согласуются с теоретическим изысканиями (Рис. 6): блокирование динеина уменьшало начальную скорость депрессии Ах-тока, - но, в конечном счете, как мы видим, кривая с EHNA выходит на контрольный уровень плата. Этому можно дать такое объяснение. Молекулы ингибитора, диффундируют через плазматическую мембрану, связываются с белками динеинами, находящимися в подмембран-ном пространстве. Белки динеины в подмембранном пространстве блокируются, что приводит к их диссоциации от микротрубочек, и, соответственно, к замедлению эндоцитоза. Со временем, «вакантные места» на микротрубочках в подмембранном пространстве занимаются свободными динеинами, не тронутыми ингибитором, что и приводит, в результате, к достижению кривой с EHNA контрольного уровня депрессии Ах-тока.
В исследованиях на мотонейронах взрослых крыс была показана тесная связь между киназой легких цепей миозина и рециклированием везикул в за висимости от частоты стимуляции (Maeno-Hikichi et al., 2011). В полученных результатах с использованием двух блокаторов киназы легких цепей миозина ML-7 и MLCK-IP-18 в концентрации 10 цМ и 10 цМ соответственно, мы показали, что средняя скорость депрессии Ах-тока до выхода на плато уменьшается с 4.97 ± 0.87 %/мин до 1.25 ± 0.18 %/мин и с 4.55 ± 0.87 %/мин до 1.59 ± 0.20 %/мин, соответственно (Рис. 7 и Рис. 8). Профили кривых депрессии Ах-тока для ML-7 и MLCK-IP-1 - совпадают, что говорит о высокой достоверности эффекта и его динамики на кривую привыкания (Рис. 15).
Напрямую взаимодействие никотиновых Ах-рецепторов с представителями семейства миозинов показано не было. Но из данных литературы известно, например, что киназа легких цепей миозина взаимодействует с миозином II, который, в свою очередь, напрямую связывается с С-терминалями субъединиц двух NMDA рецепторов. Физиологическое значение комплекса миозина II и NMDA рецепторов заключается в том, что он является ключевым звеном схождения двух сигнальных путей, один из которых опосредован киназой легких цепей миозина (Amparan et al, 2005). Миозин Vb и Rablla увеличивают аккумуляцию перинуклеарных эндосом мускариновых Ах-рецепторов (Volpicelli et al., 2002).
Как и в случае кривой с EHNA, кривые с ML-7 и MLCK-IP-18 также достигают контрольного уровня депрессии Ах-тока, только быстрее: уже на 15 минуте они достигают плато (Рис. 15). Вероятно, как и в случае белка ди-неина, это обусловлено, тем, что не все моторные белки миозины блокируются и со временем кривая достигает контрольного уровня плато.
Влияние MCD, вымывающего холестерол, ингибитора синтеза холе-стерола Ro 48-8071 и антител против актинсвязывающих белков spectrin и merlin на латеральную диффузию Ах-рецепторов при кратковременной депрессии Ах-тока в командных нейронах H. lucorum на клеточном аналоге привыкания
Следовательно, можно сделать вывод, что вымывание холестерола, обусловленное ингибированием синтеза холестерола Ro 48-8071, оказывает такой же эффект на динамику кривой кратковременной депрессии Ах-тока, как и MCD, с той лишь разницей, что кривая с MCD выходит на уровень плато за время аппликации, а кривая с Ro 48-8071 не выходит на уровень плато за время аппликации.
Антитела против актин-связывающего белка спектрина в разведении 1:100 незначительно увеличивали начальную скорость депрессии Ах-тока с 8.36 ± 1.98 %/мин до 8.69± 1.58 %/мин. Кривая не достигала уровня плато (Рис. 11).
Антитела против актин-связывающего белка мерлина в разведении 1:50 увеличивали начальную скорость депрессии Ах-тока с 8.36 ± 1.98 %/мин до 10.44±1.24 %/мин. Кривая не достигала уровня плато (Рис. 12).
Сравнение кривых с Ab-spectrin и Ab-merlin между собой не показало статистически достоверных различий (различие на 21-ой минуте - статистически недостоверно Р = 0,245).
Моделирование показало, что воздействие Ab-spectrin и Ab-merlin, как MCD и Ro 48-8071 приводит к однонаправленным изменениям: увеличению коэффициента латеральной диффузии (кг) рецепторов и уменьшению их скоростей эндоцитоза (к2) и экзоцитоза (к3) по сравнению со значением коэффициентов модели для контрольной кривой (Рис. 13).
В то же время характер поведения экспериментальных кривых разли чен: уменьшение скорости спада кривой и неизменный стационарной уровень депрессии при воздействии в случае MCD и Ro 48-8071 (Рис. 16), и практически неизмененная начальная скорость спада кривой и более глубокий уровень депрессии при воздействии Ab-spectrin и Ab-merlin (Рис. 17).
Для того, чтобы соотнести экспериментальные и расчетные результаты, необходимо понять, как влияет изменение скоростей транспортировки рецепторов по мембране и внутри клетки на величину стационарного уровня кривой и скорость ее спада. Это можно сделать на основании вычислений упрощенной модели, предложенной Мурзиной Г. Б. для определения межсти-мульного интервала, начиная с которого близко к единице парное отношение амплитуды входящего трансмембранного АХ-тока нейронов в ответ на второй (тестирующий) стимул по отношению к амплитуде АХ-тока в ответ на первый (кондиционирующий) стимул при парных аппликациях АХ от величины интервала между стимулами в паре (Мурзина и д. р. 2016).
Согласно этим вычислениям величина стационарного уровня кривой депрессии определяется отношением констант скоростей экзоцитоза (k3) и эндоцитоза (k2) рецепторов. В случае воздействия MCD и Ro 48-8071 скорости экзо- и эндоцитоза рецепторов уменьшаются в 3.8 и 3 раза соответственно. Наличие латеральной диффузии рецепторов (неучтенной в упрощенной модели) будет приводить к увеличению числа рецепторов на мембране в месте их стока, т.е. диффузию можно рассматривать как процесс, действующий так же, как и экзоцитоз. Это будет соответствовать тому, что изменение скорости экзоцитоза рецепторов будет в меньшей степени. Вследствие этого с течением времени отношение скоростей будет таким же, как и для контрольной кривой, т.е. уровень депрессии не изменится. Скорость спада кривой, т.е. время достижения ею стационарного уровня, согласно расчетам (Мурзина и д.р. 2016) и параметрам модели (согласно которым скорость эндоцитоза больше скорости экзоцитоза рецепторов (Мурзина 2013)) определяется, преимущественно, скоростью эндоцитоза рецепторов. Поскольку она меньше, чем для контрольной кривой, то время достижения стационарного уровня увеличивается и, следовательно, скорость спада кривой уменьшается.
В случае воздействия Ab-spectrin и Ab-merlin скорости экзо- и эндоци-тоза рецепторов уменьшаются в 3.5 и 2.2 раза соответственно. Увеличение коэффициента латеральной диффузии рецепторов (в меньшей степени, чем при воздействии MCD и Ro 48-8071) недостаточно для уравнивания отношения скоростей экзо- и эндоцитоза рецепторов. Поскольку скорость экзоци-тоза рецепторов уменьшится в большей степени, чем эндоцитоза, то их отношение будет меньшим, чем для контрольной кривой, т.е. депрессия увеличится. Скорость спада кривой, как и при воздействии MCD и Ro 48-8071, определяется преимущественно скоростью эндоцитоза рецепторов. Поскольку она меньше, чем для контрольной кривой, то время достижения стационарного уровня также увеличивается и, следовательно, скорость спада кривой будет меньше. На экспериментальной кривой такое изменение неразличимо вследствие того, что оно меньше, чем у кривой при воздействии MCD, и поскольку, стационарный уровень ниже, чем у контрольной кривой, то для его обнаружения в интервале времени до 6 минут (расчетное значение постоянной времени выхода на стационарный уровень) необходимо увеличить количество экспериментальных точек и масштаб построения графика. Однако количество экспериментальных точек увеличить невозможно вследствие используемого в экспериментах межстимульного интервала 3 минуты (Мурзи-на, персональное сообщение, 2016).