Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. Эпидемиология, факторы риска и патогенез неалкогольной жировой болезни печени 14
1.1. Современный взгляд на эпидемиологию неалкогольной жировой болезни печени 14
1.2. Факторы риска неалкогольной жировой болезни печени 15
1.3. Патогенез неалкогольной жировой болезни печени 17
1.4. Роль микроэлементов в патогенезе заболеваний печени 19
Глава 2. Материалы и методы исследования 24
2.1. Характеристика экспериментальных животных и условий их содержания 24
2.2. Химические и биохимические методы анализа 27
2.3. Морфометрические методы 30
2.4. Гистологические методы 32
2.5. Статистический анализ полученных результатов 32
Глава 3. Собственные исследования 34
3.1. Влияние высокожировой диеты на организм лабораторных животных 34
3.1.1. Влияние высокожировой диеты на анатомо-физиологические показатели 34
3.1.2. Влияние высокожировой диеты на биохимические показатели сыворотки лабораторных животных 35
3.1.3. Влияние высокожировой диеты на состояние процессов свободнорадикального окисления в организме животных 37
3.1.4. Влияние высокожировой диеты на содержание микроэлементов в организме животных 38
3.1.5. Влияние высокожировой диеты на морфологию ткани печени 40
3.2. Влияние высокожировой высокоуглеводной диеты организм лабораторных животных 43
3.2.1 Влияние высокожировой высокоуглеводной диеты на анатомо физиологические параметры лабораторных животных 43
3.2.2 Влияние высокожировой высокоуглеводной диеты на биохимические показатели сыворотки крыс 45
3.2.3. Влияние высокожировой высокоуглеводной диеты на состояние процессов свободнорадикального окисления в организме животных 47
3.2.4. Влияние высокожировой высокоуглеводной диеты на морфологию ткани печени 48
3.2.5. Влияние высокожировой высокоуглеводной диеты на содержание микроэлементов в организме животных 49
3.2.6. Взаимосвязь морфометрических показателей животных с неалкогольной жировой болезнью печени и содержания микроэлементов в тканях 55
3.2.7 Корреляция между содержанием микроэлементов в тканях и биохимическими параметрами 63
Заключение 73
Выводы 80
Список сокращений 82
Список литературы 83
- Роль микроэлементов в патогенезе заболеваний печени
- Влияние высокожировой диеты на морфологию ткани печени
- Взаимосвязь морфометрических показателей животных с неалкогольной жировой болезнью печени и содержания микроэлементов в тканях
- Корреляция между содержанием микроэлементов в тканях и биохимическими параметрами
Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности
Неалкогольная жировая болезнь печени (НЖБП) представляет собой спектр заболеваний,
характеризующихся накоплением липидов в клетках печени при отсутствии в анамнезе
принятия алкоголя. НЖБП считается печеночным проявлением метаболического синдрома
(Marchesini, G., Bugianesi, E., Forlani, G. et al. Nonalcoholic fatty liver, steatohepatitis, and the
metabolic syndrome. Hepatology. 2003. Vol.37. №.4. P. 917-923), связана с
инсулинорезистентностью, обусловленной как липотоксичностью, так и дисбалансом про- и противовоспалительных цитокинов и адипокинов (Tilg, H., Moschen, A. R. Inflammatory mechanisms in the regulation of insulin resistance. Mol. Med. 2008. Vol.14. №3-4. P. 222-231).
Распространенность НЖБП в популяции составляет, по различным данным, около 20-30% в странах Европы и США (LaBrecque, D.R. Abbas, Z., Anania, F. et al. World Gastroenterology Organisation global guidelines: Nonalcoholic fatty liver disease and nonalcoholic steatohepatitis. Journal of clinical gastroenterology. 2014. Vol.48. №.6. P. 467-473). По данным скрининга, распространенность данной патологии в России составила 27% на 2007 г., а в 2014 г. - 37,1% (Никитин, И.Г. Скрининговая программа по выявлению распространенности неалкогольной жировой болезни печени и определению факторов риска развития заболевания. И.Г. Никитин Российские медицинские вести. 2010. Т.1. С. 41-61; Ивашкин, В.Т., Маевская, М.В., Павлов, Ч.С. и др. Диагностика и лечение неалкогольной жировой болезни печени. М.: Российское общество по изучению печени (РОПИП). 2015. 29 с.).
Частота развития НЖБП и ожирения увеличивается в последние годы не только у взрослых, но и в детском возрасте. Факторами риска при этом выступают низкая физическая активность, нарушения питания, ожирение, генетическая предрасположенность (Vajro, P., Lenta, S., Socha, P. et al. Diagnosis of nonalcoholic fatty liver disease in children and adolescents: position paper of the ESPGHAN Hepatology Committee. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 2012. Т.54. №.5. С. 700-713). Данный факт показывает значимость исследования механизмов развития НЖБП во всех возрастных категориях.
Нарушение функции печени ведет к перераспределению и изменению содержания микроэлементов в различных тканях организма. Сопутствующие нарушения обмена эссенциальных микроэлементов, таких как медь (Leary, S.C., Winge, D.R. The Janus face of copper: its expanding roles in biology and the pathophysiology of disease. EMBO reports. 2007. Vol.8. №.3. P. 224-227), селен (Navarro-Alarcon, M., Lpez-Martnez, M.C. Essentiality of selenium in the human body: relationship with different diseases. Sci. Total Environ. 2000. Vol.249. №.1. P. 347-371) и железо (Ahmed, U., Latham, P.S., Oates, P.S. Interactions between hepatic iron and lipid metabolism with possible relevance to steatohepatitis. World J Gastroenterol. 2012. Vol.18. №.34. P. 4651-4658) играют существенную роль в патогенезе заболеваний печени. Недостаточность меди тесно связана с метаболическим синдромом и НЖБП (Song, M., Schuschke, D.A., Zhou, Z. et al. High fructose feeding induces copper deficiency in Sprague–Dawley rats: a novel mechanism for obesity related fatty liver. J. Hepatol. 2012. Vol.56. P. 433–440). Учитывая взаимосвязь между НЖБП и метаболическим синдромом, а также возможную роль ртути (Tinkov, A.A., Ajsuvakova, O.P., Skalnaya, M.G. et al. Mercury and metabolic syndrome: a review of experimental and clinical observations. Biometals. 2015. Vol.28. №.2. P. 231-254), железа (Leiva, E., Mujica, V., Seplveda, P. et al. High levels of iron status and oxidative stress in patients with metabolic syndrome. Biol. Trace Elem. Res. 2013. Vol.151. №.1. P. 1-8), хрома, ванадия (Tinkov, A.A., Popova, E.V., Polyakova, V.S. et al. Adipose tissue chromium and vanadium disbalance in high-fat fed Wistar rats. J. Trace Elem. Med. Biol. 2015. Vol.29. P. 176-181) и цинка (Seo, J.A., Song, S.W., Han, K. et al. The associations between serum zinc levels and metabolic syndrome in the Korean population: findings from the 2010 Korean National Health and Nutrition Examination Survey. PloS one. 2014. Vol.9. №.8. Р. e105990.) в развитии последнего, справедливо предположить, что дисбаланс данных металлов может иметь значение в развитии НЖБП.
Цель исследования
Установить взаимосвязи между изменениями параметров обмена микроэлементов, липидного обмена и свободнорадикального окисления при экспериментальной неалкогольной жировой болезни печени.
Задачи исследования
-
На экспериментальной модели неалкогольной жировой болезни печени, основанной на высокожировой диете, у молодых крыс Wistar изучить изменения липидного обмена, свободнорадикального окисления и степень инсулинорезистентности.
-
Определить содержание микроэлементов в ткани печени, сыворотке крови и шерсти, провести морфологическую оценку цитоархитектоники печени у молодых крыс Wistar на экспериментальной модели неалкогольной жировой болезни печени, основанной на высокожировой диете.
-
На экспериментальной модели неалкогольной жировой болезни печени, основанной на высокожировой высокоуглеводной диете, у взрослых крыс Wistar изучить изменения липидного обмена, свободнорадикального окисления и степень инсулинорезистентности.
-
Определить содержание микроэлементов в сыворотке крови, печени и шерсти, провести морфологическую оценку цитоархитектоники печени у взрослых крыс Wistar на экспериментальной модели неалкогольной жировой болезни печени, основанной на высокожировой высокоуглеводной диете.
-
Оценить взаимосвязи между уровнями микроэлементов в исследуемых биосубстратах и показателями липидного обмена, инсулинорезистентности, а также морфометрическими параметрами животных при гистологически подтвержденной экспериментальной неалкогольной жировой болезни печени.
Методология и методы исследования
Для изучения гомеостаза микроэлементов и интенсивности метаболических нарушений при НЖБП использовались две экспериментальные модели: I - с использованием высокожировой диеты; II - c использованием высокожировой высокоуглеводной диеты. Критериями развития ожирения и НЖБП у лабораторных животных являлись анатомо-физиологические параметры, цитометрические показатели гепатоцитов, наличие стеатоза и некроза гепатоцитов.
Критериями метаболических изменений, характерных для НЖБП и ожирения у экспериментальных животных являлись показатели инсулинорезистентности, интенсивность свободнорадикального окисления в сыворотке и ткани печени, а также состояние липидтранспортной системы сыворотки крови. Определение содержания микроэлементов в печени, шерсти и сыворотке крови произвeдено методом масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой.
Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора
Достоверность полученных экспериментальных данных, а также обоснованность выводов основана на достаточном количестве наблюдений и использовании современных лабораторных методов исследования, методов статистического анализа полученного материала с помощью программного пакета Statistiсa 10 for Windows (модуль one-way ANOVA (однофакторный дисперсионный анализ)).
Результаты исследования доложены и обсуждены на научно-практических конференциях всероссийского и международного уровня: IV Международная научно-практическая конференция «Биоэлементы» (Россия, Оренбург, 2016); The 6th International Selenium Conference (Se 2016) «Selenium in Biology, Chemistry and Medicine» (China, Guangzhou-Shenzhen, 2016); «16th International Symposium of Trace Elements in Man and Animals» (Россия, Санкт-Петербург, 2017); научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы биохимии и лабораторной диагностики» (Россия, Ижевск, 2017).
Личное участие автора состоит в проведении литературного поиска и обобщении
полученных данных по теме диссертационного исследования. Эксперимент был выполнен с
использованием 76 крыс Wistar. Cовместно с сотрудниками кафедры биохимии и
патологической анатомии ФГБОУ ВО ОрГМУ Минздрава России, АНО «Центр биотической
медицины г. Москва и проблемной научно-исследовательской лаборатории по изучению
механизмов естественного иммунитета ФГБОУ ВО ОрГМУ Минздрава России соискателем
получены первичные данные. Статистическая обработка полученных результатов,
формулировка задач исследования, положений, выносимых на защиту, выводов, а также написание текста диссертации выполнены соискателем самостоятельно.
Основная идея, планирование научной работы, включая формулировку рабочей гипотезы, определение методологии и общей концепции диссертационного исследования проводились совместно с научным руководителем, д.м.н., Аглетдиновым Э.Ф. (каф. патофизиологии ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России, Уфа), при консультативной помощи д.б.н., профессора Карганова М.Ю (лаборатория полисистемных исследований ФГБНУ НИИОПП, Москва), д.м.н., профессора Радыша И.В. (зав. кафедрой управления сестринской деятельностью Медицинский институт ФГАОУ ВО РУДН, Москва). Содержание животных, находившихся в эксперименте, а также освоение биохимических методов производилось совместно с д.м.н, профессором Никоноровым А. А. (зав. кафедрой биологической химии ФГБОУ ВО ОрГМУ Минздрава России) и ассистентом кафедры биологической химии ФГБОУ ВО ОрГМУ Минздрава России, к.м.н. Тиньковым А.А. Морфологический раздел работы выполнен совместно с д.м.н., профессором Поляковой В.С. (зав. кафедрой патологической анатомии ФГБОУ ВО ОрГМУ Минздрава России). Освоение методик и определение содержания металлов методом масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой производилось при консультативной помощи д.м.н., профессора Скального А.В. и сотрудников АНО «Центр биотической медицины г. Москва, а также Никоноровой Е.А. (ассистент кафедры медицинской элементологии Медицинский институт ФГАОУ ВО РУДН, Москва) и Скальной А.А. (студентка, ФГБОУ ВО Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва). Иммуноферментный анализ содержания инсулина в сыворотке выполнен совместно с к.м.н. доцентом Поповой Е.В. (кафедра биологической химии ФГБОУ ВО ОрГМУ Минздрава России).
Положения, выносимые на защиту
-
Воздействие высокожировой диеты не приводит к формированию гистологических и биохимических признаков НЖБП у молодых крыс, но сопровождается развитием ожирения, повышением активности АЛТ, гиперлептинемией и разнонаправленными изменением содержания микроэлементов в печени, сыворотке крови и шерсти;
-
Воздействие высокожировой высокоуглеводной диеты у взрослых животных приводит к формированию гистологических и биохимических признаков НЖБП на фоне снижения уровня общих тиоловых соединений в печени;
-
Формирование НЖБП у экспериментальных животных сопровождается выраженными разнонаправленными изменениями абсолютного и относительного содержания как эссенциальных, так и токсических микроэлементов, связанными с изученными морфометрическими и биохимическими параметрами;
Научная новизна
-
Впервые показано, что повышенная калорийность питания у молодых растущих животных сопровождается развитием гепатоспецифической ферментемией, повышенной продукцией провоспалительных цитокинов, гипертрофией жировой ткани и изменением микроэлементного баланса в сыворотке крови, печени и шерсти, но не приводит к индукции свободнорадикального окисления в сыворотке крови и ткани печени и формированию неалкогольной жировой болезни печени.
-
Установлено, что высокожировая высокоуглеводная диета у взрослых животных приводит к морфологическим изменениям гепатоцитов, характерных для неалкогольной
жировой болезни печени, а также к развитию атерогенной дислипопротеинемии и инсулинорезистентности, а также индукции свободнорадикального окисления в ткани печени.
-
Впервые установлено, что неалкогольная жировая болезнь печени сопровождается изменениями содержания эссенциальных и токсических микроэлементов в ткани печени, сыворотке крови и шерсти лабораторных животных.
-
Впервые показана взаимосвязь между гомеостазом микроэлементов и метаболическими нарушениями при неалкогольной жировой болезни печени. Выявлены ключевые микроэлементы, дисбаланс которых может приводить к формированию неалкогольной жировой болезни печени. Впервые выявлена прямая и отрицательная корреляция изменения содержания Se, Zn, I, V, Mn, Li, Sr с анатомо-морфологическими параметрами и биохимическими показателями липидного и углеводного обмена при неалкогольной жировой болезни печени.
Теоретическая и практическая значимость работы
Получены новые данные, свидетельствующие о нарушении обмена микроэлементов при неалкогольной жировой болезни печени. Рассматривается патогенетическая значимость наблюдаемых при высококалорийной диете дисмикроэлементозов в формировании морфологических и биохимических признаков неалкогольной жировой болезни печени.
Полученные результаты позволяют обосновать необходимость разработки новых методов лабораторной диагностики, основанных на определении микроэлементов баланса в группах риска развития неалкогольной жировой болезни печени с целью ранней диагностики, его своевременной коррекции в учреждениях практического здравоохранения, а также мониторинга, с целью снижения заболеваемости и повышения продолжительности и качества жизни у данной категории пациентов.
Внедрение результатов исследования в практику
Результаты исследования внедрены в учебный процесс кафедры биологической химии ФГБОУ ВО «Оренбургский государственный медицинский университет» Минздрава России, кафедры биологической химии с курсом клинической лабораторной диагностики ФДПО ФГБОУ ВО «Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Минздрава России и кафедры биологической химии ФГБОУ ВО «Южно-уральский государственный медицинский университет» Минздрава России.
Публикации
Соискатель имеет 23 опубликованных работы, из них по теме диссертации опубликовано 9 научных работ общим объёмом 2,67 печатных листа, в том числе 4 статьи в научных журналах и изданиях, которые включены в перечень рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций, а также 3 работы в зарубежных научных изданиях, входящих в международную реферативную базу данных (SCOPUS и Web of Science), 2 работы опубликованы в материалах всероссийских и международных конференций и симпозиумов.
Объем и структура диссертации
Роль микроэлементов в патогенезе заболеваний печени
В настоящее время известно о важной роли микроэлементов в организме человека. Они являются кофакторами ферментов, специфическими регуляторами различных метаболических путей, синтеза ДНК и РНК и т.д [14, 85]. Цинк, хром и ванадий принимают участие в обмене глюкозы [223]. Магний играет значимую роль в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний и метаболического синдрома [16, 44]. Следовательно, логично упомянуть о роли МЭ в патогенезе различных патологических состояний и, в том числе, заболеваний печени.
Нарушения обмена эссенциальных МЭ играют существенную роль в развитии заболеваний печени. Наиболее изученным в данном вопросе является железо. Стоит отметить, что исследования метаболизма данного металла при НЖБП показали неоднозначные результаты. Так, некоторыми исследователями было выявлено снижение содержания металла в гепатоцитах [52], в то время как данные других работ показали накопление железа в печени животных [67, 209]. Избыточное накопление железа при этом тесно связано с НЖБП и инсулинорезистентностью, вследствие развития воспаления и окислительного стресса. Механизм повреждающего действия железа обусловлен его способностью к генерации АФК в реакциях Фентона и Хабера-Вайса: Fe3+ + O2 Fe2+ + O2 (реакция Хабера-Вайса) Fe2++H2O2 Fe3++OH - + OH (реакция Фентона) [127, 211, 212].
Образующийся при этом гидроксильный радикал является одним из наиболее реакционноспособных АФК и реагирует с макромолекулами, приводя к их повреждению [4, 9, 212]. Более того, и избыточное накопление, и недостаток железа может быть причиной нарушения липидного обмена и, соответственно, патологического накопления липидов в ткани печени [20].
Помимо железа, медь также является переходным металлом и играет важную роль в организме человека [45, 132]. Так, медь входит в состав церулоплазмина, цитохромоксидазы, Cu-Zn-СОД, тирозиназы и т.д. [14, 82]. В то же самое время, нарушения обмена меди связано со многими патологическими процессами [120]. В большинстве исследований показано снижение содержания данного МЭ в организме при различных заболеваниях. Так, имеющиеся данные свидетельствуют, что недостаточность меди тесно связана с метаболическим синдромом и НЖБП [141]. Также Feldman и соавт. были выявлены явные нарушения обмена меди и железа у детей, страдающих ожирением и НЖБП [80]. Church и соавт. обнаружили снижение содержания меди в печени у оb/ob мышей даже в обезжиренных образцах ткани, что свидетельствует об истинном уменьшении концентрации МЭ, а не за счет вытеснения липидами белков и связанных с ними металлов [53]. Механизм фруктозо-индуцированной НЖБП был связан с нарушением экспрессии дуоденального транспортера меди-1 (Ctr1), что приводило к снижению всасывания металла в кишечнике [185].
Дефицит селена тесно связан с различными заболеваниями печени из-за его выраженных антиоксидантных свойств. Известно, что селен входит в состав многих селенопротеинов, например, глутатионпероксидазы, являющейся важным ферментом антиоксидантной защиты [83, 171]. Помимо этого, данные предыдущих исследований показали эссенциальную роль Se в метаболизме тиреоидных гормонов (является кофактором йодтирониндейодиназы) и его защитную роль при воспалении [167]. Необходимое суточное поступление Se определяется индивидуальными особенностями организма [145]. Показана его двойственная роль в развитии нейродегенеративных заболеваний [218] и нарушение его обмена в случае заболеваний печени [146], онкологических заболеваний [87, 130, 222], сахарном диабете [146], сердечно-сосудистой патологии [140, 146]. Было показано достоверное снижение уровня селена в волосах пациентов с НЖБП [155]. В то же самое время, данные исследования в Китае показали, что избыточное поступление данного МЭ связано с увеличением частоты встречаемости НЖБП в популяции [230]. Также имеются данные, то высокие дозы Se могут приводить к нарушениям метаболизма, включающим в себя дислипидэмию, ИР и СД 2 типа [189, 217].
Марганец необходим для нормальной мозговой деятельности, т.к. он является кофактором ферментов, вовлеченных в синтез и метаболизм нейротрансмиттеров [71, 198]. Он является компонентом Mn-СОД, являющейся митохондриальным антиоксидантным ферментом, а также пируваткарбоксилазы и аргиназы [25]. Показан положительный эффект рекомбинантной Mn-СОД при экспериментальной ишемии и реперфузионном повреждении печени крыс и человека [35]. Пируваткарбоксилаза является ферментом, принимающем участие в метаболизме глюкозы и необходимом для биосинтеза оксалоацетата (ЩУК), важного участника ЦТК [25]. Соответственно, можно предположить, что уменьшение содержания Mn в гепатоцитах может приводить к энергодефициту.
Принимая во внимание роль инсулинорезистентности в развитии НЖБП и метаболического синдрома, такие МЭ как цинк, хром или ванадий, обладающие инсулиномиметическими свойствами, также могут оказывать влияние на развитие данной патологии [223]. Показано, что диета с дефицитом хрома вызывает ИР в периферических тканях и повышение секреции инсулина -клетками поджелудочной железы у крыс [191, 192]. Применение соединений хрома (III) в качестве пищевой добавки способно повышать чувствительность к инсулину у пациентов с СД 2 типа [115, 142, 219], а также снижать степень ИР и уровень окислительного стресса в печени у ob/ob мышей [186]. Однако не стоит забывать о возможной токсичности данного МЭ, которая зависит от его валентности. Трехвалентный хром обладает низкой токсичностью, в то время как шестивалентный может вызывать точечные мутации ДНК, хромосомные аберрации, окислительную модификацию белков [62], а также ассоциирован с таким патологическим состоянием, как рак легких [54].
Биологическая роль ванадия в организме противоречива и изучена недостаточно. Различные соединения ванадия давно известны и широко исследуются in vivo и in vitro, как значимое звено в контроле течения СД 2 типа и коррекции ИР [38, 179, 227, 204]. Фармакологически значимые дозировки (от 10 до 100 раз выше суточной нормы) влияют на обмен ХС и ТАГ, а также стимулируют окисление глюкозы и синтез гликогена в печени [94]. В то же самое время, имеются множественные данные о цитотоксичности соединений ванадия [143]. Показана их способность снижать активность различных АТФаз [175], протеинкиназ [203], фосфатаз [208] и рибонуклеаз [119].
Цинк входит в состав множества белков и ферментов, таких как оксидоредуктазы, гидролазы, трансферазы и т.п., а также активного центра Сu-Zn-СОД [136, 162]. При этом антиоксидантные свойства цинка могут быть реализованы за счет, во-первых, защиты сульфгидрильных групп белков от окисления; во-вторых, путем снижения продукции АФК переходными металлами [36, 161] посредством индукции металлотионеина [162, 163]. Помимо антиоксидантной функции, цинк играет важную роль в метаболизме глюкозы путем регуляции различных сигнальных путей и, также, как хром и ванадий, обладает инсулиномиметическими свойствами [148]. Причем, данное свойство может быть реализовано различными путями, как: 1) снижение активности тирозиновой протеинфосфатазы (protein tyrosine phosphatase 1B (PTP 1B)), ключевого регулятора фосфорилирования рецепторов к инсулину [95], за счет этого Zn активирует внутриклеточный сигнальный каскад фосфотидилинозитол-3-киназ (PI 3-kinase) и опосредует действие инсулина; 2) стимулировании синтеза инсулина [69]; 3) ингибирования сериновых/треонитовых протеинфосфатаз белка S6, принимающего участие в обмене глюкозы и пролиферации клеток [172], 4) за счет прямой активации mTOR (mammalian target of rapamycin) сигнального каскада [130] или 5) за счет ингибирования киназы-3 гликогенсинтазы [104]. Также, введение комплексов цинка у экспериментальных животных увеличивало поступление глюкозы в адипоциты и, соответственно, снижало уровень глюкозы крови [48].
Также логично предположить, что загрязнение окружающей среды, как и в случае с ожирением [99] и метаболическим синдромом [101], играет важную роль в развитии НЖБП. Причем, ключевая роль в формировании данной патологии принадлежит тяжелым металлам, которые являются одними из ключевых загрязняющих среду агентов. Патогенетическая роль тяжелых металлов в данном случае может быть обусловлена их провоспалительными и прооксидантными свойствами [211]. Так, данные исследований показывают, что воздействие кадмия [102], мышьяка [200] и некоторых других тяжелых металлов, таких как свинец и ртуть [43] тесно связано с НЖБП. Было показано, что у рабочих нефтехимической промышленности частота выявления НАСГ выше, чем у контрольных групп населения [55].
Также, учитывая взаимосвязь между НЖБП и метаболическим синдромом, а также возможную роль ртути [207], железа [122], хрома, ванадия [206] и цинка [190] в развитии последнего, справедливо предположить, что дисбаланс данных металлов может иметь значение в развитии НЖБП.
Таким образом, дисбаланс и эссенциальных, и токсических МЭ может иметь место в патогенезе заболеваний печени и ассоциированных с ними состояний, таких как ожирение, метаболический синдром, СД 2 типа. При этом, несмотря на наличие исследований, посвященных взаимосвязи гомеостаза отдельных МЭ и НЖБП, имеющиеся данные немногочисленны и противоречивы.
Влияние высокожировой диеты на морфологию ткани печени
В связи с тем, что золотым стандартом диагностики НЖБП является гистологическое исследование биоптата печени [8], для подтверждения диагноза нами было выполнено гистологическое исследование полученных образцов печени. Из данных, представленных на микрофотографии 3.1.5.1, видно, что воздействие кратковременной ВЖД на 21-дневных самцов крыс линии Wistar не приводило к изменениям цитоархитектоники печени. В связи с этим цитометрия не проводилась.
Таким образом, результаты проведенных исследований показали, экспериментальная модель НЖБП в виде ВЖД в раннем возрасте не приводит к существенному набору веса у молодых растущих самцов крыс, хотя, при этом, наблюдаются признаки развития ожирения: увеличение массы жировой ткани и содержания сывороточного лептина, что является характерным для данного патологического процесса [139].
Отсутствие выраженного набора веса у молодых животных при ВЖД также является интересным фактом. В то же самое время, данные некоторых исследований показывают даже понижение массы у ювенильных крыс под действием ВЖД [56]. Учитывая противовоспалительную и инсулин сенсибилизирующую роль адипонектина [15], отсутствие изменений в его содержании может служить объяснением молекулярных механизмов отсутствия инсулинорезистентности, что подтверждается неизменными уровнями инсулина, глюкозы и индекса HOMA-IR.
При этом значительное количество работ, демонстрирующих взаимосвязь ожирения с НЖБП [8, 75, 169], позволяют предположить отсутствие морфологических изменений в печени при данной экспериментальной модели, как недостаточным временем воздействия ВЖД, так и потребностью растущего организма в более высоком энергообеспечении. Однако, наличие незначительного, но достоверного увеличения АЛТ в сыворотке может свидетельствовать о имеющемся нарушении структуры мембран гепатоцитов, что приводит к «утечке» части цитозольных ферментов в кровь [165].
Интересным фактом влияния ВЖД на организм молодых самцов крыс, на фоне отсутствия статистически значимых изменений исследуемых биохимических параметров липидного обмена, показателей ИР и состояния СРО, является формирование выраженного изменения микроэлементного статуса. При этом наиболее значимыми в данном случае были изменения в уровнях Cu, Mn и Se.
Важно отметить, что обнаруженное снижение содержания Cu и Mn в печени согласуется с рядом литературных данных [53, 66, 108]. Однако данные других исследований не показали существенных изменений обмена Mn и Cu при ВЖД [47]. Выявленное снижение содержания Se в шерсти и печени, свидетельствующее о недостаточности данного МЭ, может быть вызвано его повышенной потребностью [204], связанной с развитием окислительного стресса при ожирении [86]. Причем, несмотря на многочисленные данные о снижении содержания Se в сыворотке крови при ожирении [33, 107, 128] данные о его содержании в печени и в волосах противоречивы. Так, некоторыми исследователями показано снижение содержания данного МЭ в волосах [111], в то время как другие выявили его повышение у пациентов с ожирением [78]. При этом ряд исследований не показал влияния диеты с высоким содержанием жира и холестерола на уровень Se в печени [131]. Также, несмотря на то, что в настоящей экспериментальной модели отсутствовала ИР, следует отметить, что по литературным данным, фруктозо-индуцированный МС, ассоциированный с ИР, сопровождается значимым снижением содержания Se в печени [164].
Выявленное в нашем исследовании нарушение обмена цинка согласуется с ранее существующими данными о том, что ВЖД вызывает снижение его концентрации в печени [47, 199]. Также было показано снижение содержание Zn у мышей, генетически предрасположенных к ожирению [126], а также в крови у детей и подростков [65] и взрослых мужчин при ожирении [154]. В то же самое время, данные других исследований не показали изменения содержания цинка в сыворотке крови при ожирении [51].
Важно отметить, что, несмотря на то, что гистологическая картина ткани печени не содержала видимых значимых изменений е цитоархитектоники, наличие ожирения у лабораторных животных, изменения уровня адипокинов, органоспецифической ферментемии и изменений содержания МЭ в ткани печени может свидетельствовать о формировании предпосылок к развитию НЖБП. В связи с этим, на 2 этапе исследования нами была использована более высококалорийная диета (ВЖВУД) и в эксперимент взяты взрослые животные.
Взаимосвязь морфометрических показателей животных с неалкогольной жировой болезнью печени и содержания микроэлементов в тканях
С целью определения взаимосвязи между микроэлементным статусом и морфометрическими показателями животных был проведен корреляционный анализ. Как видно из данных, представленных в таблице 3.2.6.1, абсолютное содержание селена в печени отрицательно коррелировало с весом, длиной, ОГ, ОЖ, массой параметральной (ПМЖТ) и ретроперитонеальной (РПЖТ) жировой ткани и массой печени у животных с НЖБП.
Однако, не было выявлено корреляционных взаимосвязей относительного содержания данного МЭ в печени с исследуемыми параметрами. Каких-либо взаимосвязей между уровнем Se в сыворотке и шерсти и морфометрическими показателями также не было обнаружено.
Абсолютно все морфометрические показатели отрицательно коррелировали с абсолютным содержанием Mn в печени, однако, что более важно, была выявлена достоверная отрицательная корреляция между относительным уровнем исследуемого МЭ в ткани печени с весом животных, массой ПМЖТ и РПЖТ (Таблица 3.2.6.2). Также было выявлено повышение абсолютного содержания Mn в сыворотке с увеличением веса, ОЖ и массы ЖТ у крыс с ВЖВУД. Однако взаимосвязь относительной концентрации Mn с морфометрическими показателями была очень слабой и недостоверной. Как видно из таблицы 3.2.6.2., было обнаружено, что с увеличение веса, длины, ОЖ, массы ЖТ и печени у животных с НЖБП достоверно коррелирует с увеличением содержания Mn в шерсти, что соответствует изменениям, обнаруженным в сыворотке крови экспериментальных животных.
Как видно из данных, представленных в таблице 3.2.6.3, абсолютное содержание ванадия в сыворотке увеличивалось с повышением массы ПМЖТ у животных. При этом после произведенной коррекции с учетом содержания общего белка данная взаимосвязь не была достоверной. Относительное содержание ванадия в сыворотке отрицательно коррелировало с массой печени у животных с НЖБП. Не было обнаружено корреляции содержания V в печени с морфометрическими параметрами. Также было обнаружено, что с увеличением ОГ и массы ЖТ достоверно повышалась концентрация V в шерсти крыс.
Абсолютное содержание цинка отрицательно коррелировало со всеми морфометрическими параметрами, однако после произведенной коррекции с учетом содержания общего белка данные взаимосвязь не была достоверной (Таблица 3.2.6.4.).
При этом было обнаружено, что снижение относительного содержания Zn в сыворотке крови коррелировало с увеличением веса, ОЖ, массы ЖТ и печени у животных с НЖБП. Интересно, что содержание цинка в шерсти животных в целом соответствовало изменениям в сыворотке крови и отрицательно коррелировало с весом, ОГ и массой ЖТ.
Было обнаружено, что абсолютное и относительное содержание йода в сыворотке крови отрицательно коррелирует со всеми морфометрическими параметрами крыс с ВЖВУД (Таблица 3.2.6.5.).
В то время как в печени было выявлено только достоверная отрицательная корреляция с массой ПМЖТ, в то время как после коррекции с учетом содержания общего белка взаимосвязь между относительным содержанием МЭ и морфометрическими параметрами отсутствовала. Уровень I в шерсти животных с НЖБП отрицательно коррелировал с весом, ОГ, массой ЖТ и печени.
Как видно из данных, представленных в таблице 3.2.6.6., была выявлена отрицательная корреляция абсолютного содержания Li в печени с массой ПМЖТ и РПЖТ, в то время как для относительного содержания МЭ в печени была выявлена достоверная отрицательная корреляция только с РП ЖТ. Корреляционный анализ показал, что увеличение веса, ОГ, ОЖ, массы ЖТ и печени у животных с НЖБП сопровождается достоверным снижением абсолютного и относительного содержания Li в сыворотке крови.
Уровень МЭ в шерсти при этом отрицательно коррелировал с массой околоматочной и параовариальной ЖТ.
Проведенный корреляционный анализ показал отсутствие взаимосвязи содержания Sr в ткани печени и морфометрических параметров крыс с ВЖВУД (Таблица 3.2.6.7.).
В то же самое время, было выявлено, что абсолютное содержание МЭ в сыворотке возрастает с увеличением показателей всех исследуемых параметров. При этом относительное содержание Sr в сыворотке положительно коррелирует только с ОЖ и массой ЖТ. Какой-либо значимой взаимосвязи концентрации тяжелого металла в шерсти и морфометрическими параметрами не было обнаружено.
Таким образом, как видно из данных, приведенных в сводной таблице корреляционных взаимосвязей между относительным содержанием МЭ в тканях и морфометрическими показателями животных (Таблица 3.2.6.8.), морфометрические параметры животных с НЖБП коррелируют с изменениями обмена эссенциальных и токсических МЭ.
Корреляция между содержанием микроэлементов в тканях и биохимическими параметрами
С целью определения взаимосвязи между микроэлементным статусом и исследуемыми биохимическими показателями экспериментальных животных был проведен корреляционный анализ.
Как видно из данных, представленных в таблице 3.2.7.1, абсолютное содержание Se в ткани печени отрицательно коррелировало с уровнем глюкозы, ОБ, ТАГ и ОЛ сыворотки крови.
При этом, для относительного содержания МЭ в печени была выявлена достоверная отрицательная корреляция только с уровнем ОБ и ТАГ в сыворотке крови. Было выявлена положительная взаимосвязь концентрации Se в сыворотке крови и ХС-ЛПВП. Помимо этого, наблюдалась отрицательная корреляция относительного содержания МЭ в сыворотке и уровня ОБ, ТАГ, ХС-ЛПНП, инсулина и ОЛ. Однако, после произведенной коррекции с учетом содержания общего белка, было обнаружено, что снижение концентрации Se сопровождалось достоверным повышением только уровня глюкозы, ОБ, ТАГ и ОЛ в сыворотке. При этом была выявлена отрицательная взаимосвязь между Se в шерсти и содержанием ХС-ЛПВП.
Были выявлены корреляционные взаимосвязи между содержанием марганца в тканях и биохимическими параметрами (Таблица 3.2.7.2.). Интересно, что абсолютное содержание Mn в печени снижалось по мере увеличения содержания глюкозы, ТАГ, значений индекса HOMA-IR и ОЛ сыворотки крови, в то время как взаимосвязь относительного содержания МЭ и соответствующих параметров не была статистически значимой. Также было выявлено повышение абсолютной концентрации Mn в сыворотке с увеличением концентрации глюкозы, ОБ, ТАГ, индекса HOMA-IR и ОЛ сыворотки крови. При этом, достоверной взаимосвязи относительного содержания МЭ и исследуемых биохимических параметров также обнаружено не было. Также было выявлено, что увеличение уровня Mn в шерсти сопровождается достоверным повышением глюкозы, ТАГ, ХС, ХС-ЛПНП и индекса HOMA-IR.
Как видно из данных, представленных в таблице 3.2.7.3., была обнаружена отрицательная корреляция абсолютного содержания V с концентрацией ОЛ сыворотки крови, в то время как между относительным содержанием МЭ и биохимическими показателями связи выявлено не было. Также показано, что относительное содержание V в сыворотке отрицательно коррелирует с концентрацией глюкозы, ОБ и ТАГ сыворотки. В то же самое время, какой-либо значимой взаимосвязи концентрации МЭ в шерсти и биохимическими показателями не было обнаружено.
Корреляционный анализ показал, достоверную взаимосвязь снижения абсолютной концентрации Zn в ткани печени и увеличением показателей сывороточной глюкозы, ОБ, ТАГ и индекса HOMA-IR у животных с НЖБП (Таблица 3.2.7.4). В то же самое время, относительное содержание металла положительно коррелировало только с концентрацией альбуминов в сыворотке крови. Не было выявлено достоверной взаимосвязи между абсолютной концентрацией Zn в сыворотке крови и биохимическими показателями. Однако, важно отметить, что относительное содержание МЭ в сыворотке отрицательно коррелировало с концентрацией глюкозы, ОБ, ТАГ и индексом HOMA-IR. Содержание Zn в шерсти характеризовалось отрицательной корреляцией с концентрацией глюкозы, ТАГ, ХС-ЛПВП и ОЛ сыворотки.
Полученные данные, показанные в таблице 3.2.7.5, показывают отсутствие какой-либо взаимосвязи между концентрацией I в ткани печени и исследуемыми биохимическими параметрами. В то же самое время, абсолютное содержание I в сыворотке отрицательно коррелировало с концентрацией глюкозы, ОБ, ТАГ, ХС, ХС-ЛПНП, инсулина и индексом HOMA-IR в сыворотке. Однако, после произведенной коррекции с учетом содержания общего белка, была обнаружена статистически значимая взаимосвязь между снижением концентрации I в сыворотке крыс с ВЖВУД и увеличением уровня глюкозы, ОБ, ТАГ, ХС, ОЛ, инсулина и значений индекса HOMA-IR. Также важно отметить, отрицательную взаимосвязь между содержанием МЭ в шерсти животных с НЖБП и концентрацией глюкозы, ОБ, ТАГ и ОЛ сыворотки крови.
Полученные данные не показали какой-либо взаимосвязи между абсолютным и относительным содержанием лития с исследуемыми биохимическими параметрами (Таблица 3.2.7.6). Абсолютная концентрация Li в сыворотке отрицательно коррелировала с уровнем глюкозы и ОБ сыворотки, однако после произведенной коррекции с учетом содержания общего белка было выявлено, что снижение концентрации МЭ у животных с НЖБП достоверно взаимосвязано с повышением уровня ОБ, ТАГ и ОЛ. При этом снижение содержания Li в шерсти крыс коррелировало с увеличением концентрации ТАГ и ОЛ сыворотки крови.
Как видно из данных, представленных в таблице 3.2.7.7., увеличение абсолютного и относительного содержания Sr в ткани печени коррелировало с индексом HOMA-IR. Также было обнаружено отрицательная корреляция между относительным уровнем тяжелого металла и концентрацией ХС-ЛПВП. При этом, была выявлена достоверная положительная корреляция между абсолютным содержанием Sr в сыворотке и концентрацией глюкозы, ТАГ и индексом HOMA-IR.
При этом важно отметить, что относительное содержание МЭ отрицательно коррелировало только с уровнем ОБ сыворотки крови. В то же самое время, взаимосвязи концентрации Sr в шерсти и биохимическими показателями не было обнаружено.
Таким образом, как видно из данных, приведенных в таблице 3.2.7.8, биохимические показатели животных с НЖБП коррелируют с изменениями обмена эссенциальных и токсических МЭ.