Введение к работе
Актуальность проблемы.
Представления о функциях нуклеиновых кислот в течение долгого времени ограничивались исключительно их участием во внутриклеточном матричном синтезе биополимеров. Однако в настоящее время накопились убедительные доказательства того, что РНК и ДНК, обнаруживаемые во внеклеточном пространстве, могут вызывать специфические биологические эффекты, воздействуя на клетки определенного вида непосредственно или в составе нуклеиново -белковых комплексов. Есть основания предполагать, что ДНК и РНК появляются во внеклеточном пространстве не только в процессе гибели клеток и во время развития таких патологических состояний, как онкологические и аутоиммунные заболевания, но и в результате нормальных метаболических процессов. Проблема исследования биологических эффектов, вызываемых воздействием внеклеточных нуклеиновых кислот, приобретает большое значение в связи с развитием методов генной инженерии и терапии олигонуклеотидами, когда экзогенные нуклеиновые кислоты искусственно вводятся в организм. В последние годы были достигнуты успехи в использовании олигонуклеотидов и их модифицированных производных для подавления размножения вирусов, и модуляции генной экспрессии в клеточных культурах. Появились сообщения об антивирусной активности олигонуклеотидов в организме животных, начаты клинические испытания. Однако, кроме положительных эффектов были выявлены такие свойства экзогенных нуклеиновых кислот в организме, как токсичность, иммуногенность и способность активировать иммунную систему. В ряде работ показано, что использование модифицированных производных олигонуклеотидов вызывает такие последствия, как гиперплазия лимфоузлов и селезенки, активация натуральных киллеров, повышение уровня выработки цитокинов. Очевидно, что дальнейшее развитие перспективного направления ген - специфической терапии невозможно без подробного изучения механизмов взаимодействия экзогенных нуклеиновых кислот с макромолекулами клеток и тканей организма, поскольку имеется возможность развития побочных патологических эффектов.
Цель работы.
Проведенные ранее исследования показали, что независимо от способа введения меченых олигонуклеотидов в организм животных, они распределяются по органам и тканям через кровоток. Таким образом, олигонуклеотиды могут взаимодействовать с компонентами крови уже в первые минуты после попадания в организм. По - видимому, такое взаимодействие олигонуклеотидов и их производных с биополимерами крови влияет на их дальнейшую судьбу в организме и вызываемые биологические эффекты.
Целью представляемой работы было, во - первых, изу .лть спектр белков крови, взаимодействующих с олигонуклеотидами, выяснить специфичность, аффинность и возможные механизмы взаимодействи сывороточных белков с различными олигонуклеотидами и их модифицированными производными, что необходимо для понимания процессов, связанных с функционированием внеклеточных нуклеиновых кислот in vivo и разработки стратегии использования олигонуклеотидов в терапии.
Второй задачей настоящей работы было изучение взаимодействия олигонуклеотидов с компонентами иммунной системы, а именно, иммуноглобулинами и иммунокомпетентными клетками. Исследование механизмов и возможных последствий взаимодействия олигонуклеотидов с клетками иммунной системы необходимо для решения вопроса о неспецифическом иммуностимулирующем действии, обнаруженном при длительном использовании олигонуклеотидов как в культуре клеток, так и в организме.
Научная новизна и практическая ценность работы.
В настоящей диссертационной работе было впервые проведено исследование белков сыворотки крови, взаимодействующих с олигонуклеотидами. С помощью алкилирующих производных олигонуклеотидов были выявлены сывороточные белки, вступающие в низкоаффинные взаимодействия с олигонуклеотидами, среди них - альбумин и иммуноглобулины классов М и G. Сравнительный анализ взаимодействия различных производных олигонуклеотидов с этими тремя сывороточными белками показал, что константы ассоциации с белками некоторых модифицированных производных, например, холестеринового производного и фосфоротиоатных аналогов олигонуклеотидов, существенно выше, чем для обычных фосфодиэфирных аналогов. Оказалось, что константы ассоциации олигонуклеотидов с белками зависят от длины олигонуклеотида и не зависят от последовательности нуклеотидов. На основе полученных данных можно прогнозировать появление побочных эффектов при использовании олигонуклеотидов и их производных для терапии, причем полученное представление о преимущественно ионном характере олигонуклеотид - белкового взаимодействия, возможно, позволит предотвратить эти эффекты путем использования конкурентов полианионной природы, или изменением длины олигонуклеотида.
Локализованный на молекуле иммуноглобулина участок взаимодействия с олигонуклеотидом представляет интерес и плане изучения структуры и функций иммуноглобулинов. Представление о существовании такого полиаиион -связывающего участка неподалеку от ііснір.і узнавания .антигена на молекуле иммуноглобулина может объяснять природу полиспецифичности, обнаруженной
для многах природных антител, моноклональных антител и аутоамтнтел, в том числе, антител к ДНК. В работе было впервые показано, что олигонуклеотид в составе ковалентного комплекса с иммуноглобулином G связывается с несколькими линиями иммунокомпетентных клеток за счет взаимодействия с Fc - рецепторами. Вероятно, один из путей выведения олигонуклеотидов из кровотока осуществляется через взаимодействие с сывороточными иммуноглобулинами и Fc -рецепторами различных клеток. Учитывая, что Fc - рецепторы имеют широкую распространенность практически на всех типах клеток иммунной системы и фактически осуществляют связь между гуморальным и клеточным звеньями иммунной системы, можно предполагать, что взаимодействие с Fc - рецепторами в комплексе с иммуноглобулинами - это один из возможных механизмов влияния олигонуклеотидов на активацию иммуной системы.
Публикации и апробация работы.
По материалам диссертации опубликовано 3 печатных работы. Материалы диссертации были доложены на Международной конференции "Молекулярная биология на рубеже XXI века", посвященной памяти академика Энгельгарта ( 1994 г.).
Структура и объем работы.
Диссертация изложена на 103 страницах, включающих 14 рисунков, 4 таблицы и список литературы. Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты, обсуждение результатов, выводы.