Введение к работе
Актуальность проблемы. Обратная транскриптаза (ОТ) вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) - ключевой фермент репликации ретровирусов, основной объект воздействия противовирусных средств, азидотимидина и др. Она осуществляет превращение одноцепочечной РНК генома вируса в двуцепочечную ДНК, которая затем интегрируется в геном клетки-хозяина. Поскольку синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), вызываемый ВИЧ, является одним из наиболее опасных заболеваний человека, ферменты вируса в настоящее время интенсивно исследуются как с точки зрения механизмов их функционирования, так и с цепью поиска новых специфических ингибиторов- потенциальных мощных антивирусных средств. Проблема лекарственной устойчивости вируса, связанная с возникновением мутантных форм ОТ при длительном лечении ази-дотимидином, стимулирует дальнейший поиск специфических отличий ретрови-русных и эукариотических ДНК полимераз и новых эффективных лекарственных средств. Уникальной особенностью ОТ ВИЧ является использование клеточной TPHKLys для инициации вирусной репликации. В связи с этим изучение взаимодействия ОТ с тРНК представляется чрезвычайно своевременным и необходимым с целью более глубокого понимания механизмов узнавания обратной транскриптазой олигонуклеотидных и тРНК праймеров и конструирования ингибиторов ОТ на их основе.
Цель работы. Целью работы было изучение закономерностей взаимодействия ОТ с тРНК и олигонуклеотидными праймерами, в частности, оценка сродства тРНК к обеим субъединцам фермента с помощью методов флуоресцентного титрования и аффинной модификации производными тРНК, исследование влияния тРНК и ее аналогов, а также хаотропных агентов на скорость реакции полимеризации, катализируемой ОТ; исследование механизма узнавания производных тРНК-Tn/Un и частично некомплементарных праймеров обратной транскриптазой; сравнительный анализ взаимодействия мутантных форм обратной транскриптазы, устойчивых к азидотимидину, и ОТ дикого типа с олигонуклеотидными праймерами.
Научная новизна и практическая ценность работы. Работа представляет собой систематическое исследование количественных аспектов взаимодействия обратной транскриптазы ВИЧ-1 с тРНК и ее производными. Впервые показано, что гетеродимер р66/р51 имеет два сайта связывания молекул тРНК, при помощи таких методов, как флуоресцентное титрование и аффинная модификация производными тРНК . Впервые показана активация гетеродимерной формы ОТ под влиянием тРНК и ее производных, а также хаотропных агентов. Предложен механизм активации рбб каталитической
2 субъединицы, опосредованной конфирмационными изменениями фермента в результате связывания тРНКс р51 субъединицей. Впервые показано аномально высокое сродство частично некомплементарных праимеров к обратной тран-скриптазе по сравнению с другими полимеразами про- и эукариот. Впервые показано, что транскриптаза способна эффективно использовать в качестве праимеров аналоги тРНК и некомплементарные поли(А) матрице олигонуклеотиды, содержащие на З'-конце 1-10 dT-звеньев или даже полностью некомплементарные олигонуклеотиды, лишенные З'-концевого основания. Полученные данные свидетельствуют о том, что 5'-концевая часть (dT)„(dC)(dT)m- праимеров образует дополнительные контакты, скорее всего, с тРНК узнающим центром фермента. Это приводит к значительному повышению их сродства к ОТ. Проанализировано влияние мутаций на взаимодействие ОТ, содержащей набор мутаций, связанных с AZT-устойчивостью, с олигонуклеотидными праймерами. Показано, что в присутствии хаотропных агентов, способствующих конформа-ционным перестройкам белка, стадия инициации синтеза ДНК мутантами несколько замедлена по сравнению с ферментами дикого типа. Предполагается, что наблюдаемый эффект хаотропных агентов на мутантные формы ОТ отражает измененную способность к конформационным перестройкам ОТ под действием природных лигандов в присутствии клеточных или вирусных факторов, влияние которых имитируют хаотропные агенты.
Полученные результаты являются базой для конструирования нового класса селективных ингибиторов ОТ на основе частично некомплементарных праимеров, путем введения различных реакционноспособных групп по 5'- и 3'- концу таких олигонуклеотидов. Использование тРНК-аналогов, проявляющих прэй-мерные свойства на поли(А)-матрице, перспективно в качестве модели для изучения фундаментальных аспектов белок-нуклеинового узнавания, а также для анализа механизма лекарственной устойчивости, связанной с ОТ. Объем работы. Диссертация изложена на 146 страницах, включая 29 рисунков и 8 таблиц. Список цитированной литературы включает 173 работы. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, результатов работы и их обсуждения и выводов. Публикация и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы.