Введение к работе
Актуальность проблемы. За два последних десятилетия накопилось много информации о взаимодействии ферментов не только друг с другом, но и с различными структурными элементами клеток. Однако возможное функциональное значение такого рода взаимодействий в большинстве случаев остается неясным. Наиболее подробно было исследовано взаимодействие D-глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназы (ГАФД, КФ 1.2.1.12) с интегральным белковым компонентом мембраны эритроцитов - так называемым белком полосы 3. На основании многочисленных работ группы Стека сложилось четкое представление об ингибирующем действии этого белка на активность ГАФД [Steck and Yu, 1975; Stek et al., 1982], что привело к возникновению ряда гипотез о роли адсорбции ГАФД на мембране эритроцитов в регуляции гликолиза в этих клетках. Однако исследованное недавно взаимодействие ГАФД с белком, формирующим мпкротрубочки - тубулином - заставило по-нному взглянуть на полученные Стеком результаты. Оказалось, что в условиях, близких к использованным в работах Стека, тубулин очень прочно связывается с ГАФД и ингибирует этот фермент. Незначительное же повышение ионной силы полностью снимает ингибирование. хотя взаимодействие между ГАФД и тубулином сохраняется [Muronetz et al. 1994]. Можно было предположить, что ингибирование активности ГАФД (а, возможно, и других N.AD-зависпмых дегидрогенмз) тубулином не имеет физиологического значення, поскольку минимальное повышение ионной силы приводит к его исчезновению. Те же опыты свидетельствовали о возможности функционирования ГАФД в связанном с тубулином (и, вероятно, с мпкротрубочками)состоянии.
Эти наблюдения послужили импульсом для проведения данной работы, в которой мы исследовали взаимодействие ГАФД и лактатдегпдрогеназы (ЛДГ, КФ 1.1.1.27) с другим структурным компонентом клетки - мембранами эритроцитов. Наличие в белке полосы 3 и в тубулине сходных "кислых" фрагментов позволяло предположить единый .механизм взаимодействия \АО-злвпсп.мых дегпдрогепаз с этими двумя структурными элементами клетки. Можно было ожидать, что при повышении ионной силы сохранится взаимодействие дегпдрогепаз с мембранами эритроцитов, а ингибирование их активности устранится. Наблюдение сохранения активности NAD-зависимых дегпдрогепаз в связанном с мембранами и тубулином состоянии могло бы послужить основой для понимания роли адсорбции этих ферментов в регуляции гликолиза.
Целью исследования прежде всего было выявление корреляции между адсорбцией двух NAD-зависимых дегидрогеназ на мембране эритроцитов в разных условиях и изменением их каталитической активности. Другой задачей работы было изучение взаимодействия ЛДГ с тубулином в тех же условиях, в которых ранее изучалось его связывание с ГАФД, а также исследование комплексов двух дегидрогеназ с тубулином методом седиментационного анализа.
Научная новизна. В работе было впервые показано, что при низкой ионной силе лактатдегидрогеназа образует прочные комплексы с днмерной формой тубулина, а также с мембранами эритроцитов, причем активность фермента при этом снижается. Повышение ионной силы приводит к устранению ингибирующего действия тубулина и мембран из-за диссоциации таких комплексов на исходные компоненты. На мембране эритроцитов обнаружены также участки связывания для ЛДГ, не ингибирующие активность фермента и сохраняющиеся как при низкой, так и при высокой ионной силе. Показано также, что ГАФД связывается с мембранами эритроцитов при низкой и высокой ионной силе, однако в последнем случае ее активность не изменяется. Таким образом, можно сделать вывод о том, что в условиях, близких к физиологическим, обе NAD-зависимые дегидрогеназы гликолиза адсорбируются на мембране эритроцитов (вероятно, в разных участках), причем их активность при этом сохраняется.
Практическое значение работы состоит в том, что полученные в ней результаты позволяют выяснить, как влияет адсорбция двух NAD-зависимых дегидрогеназ на структурных элементах клеток на свойства этих ферментов, а, следовательно, и на регуляцию гликолиза. Эти наблюдения могут служить основой для создания концепций о механизмах регуляции метаболизма в эритроцитах. Полученная информация может быть использована при чтении спецкурсов на кафедре биохимии биологического факультета, а также на других кафедрах биохимии университетов и медицинских институтов.
Апробация. Результаты работы были доложены на совместном заседании кафедры биохимии Биологического факультета МГУ и отдела биохимии животной клетки НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ, на международном симпозиуме по интегральной биохимии (Барселона, 1994), на международной конференции "Современные проблемы биохимии и молекулярной биологии. Наследие А.Н.Белозерского" (Москва, 1995), на международной конференции "Биокатализ-95" (Суздаль, 1995), на всероссийской конференции студентов и аспирантов "Ломоносов-95" (Москва, 1995) и на ежегодном съезде германского общества клеточной биологии (Гамбург, 1996).
Публикации. Результаты исследования изложены в 4-х печатных работах.
Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит/д&?страниц машинописного текста, ..е. таблиц и Д./.. рисунков. Список литературы включает/^источников.