Введение к работе
Актуальность проблемы. Оксидативные повреждения ДНК являются наиболее важными причинами мутаций и могут играть решающую роль в процессах старения и возникновении раковых заболеваний людей. За репарацию большей части таких повреждений ДНК клетки отвечает фермент - 8-оксогуанин(формамидопиримидин)-ДНК-гликозилаза (OG-ДГ). Гликозилаза обладает широкой субстратной специфичностью, выщепляя окисленные пуриновые основания ДНК. При этом основными субстратами для нее являются 8-оксогуанин и 5-формамидопиримидины ДНК. Кроме того, OG-ДГ из Е. coli обладает ассоциированной апурин/апиримидин-лиазной и 5'-концевой дезоксирибозофосфатазной активностями, что является уникальным свойством фермента этого класса. К настоящему времени обнаружена 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазная активность также в клетках эукариот и человека. OG-ДГ из E.coli биохимически достаточно хорошо охарактеризована. Однако, несмотря на значительный прогресс в ее изучении, информация о взаимодействии гликозилазы с ДНК-субстратом и специфическими звеньями, в литературе практически отсутствует. В связи с этим изучение взаимодействия OG-ДГ с ДНК является чрезвычайно актуальным и необходимым для более глубокого понимания механизмов узнавания гликозилазой ДНК-субстрата и ее роли в репарации нарушений ДНК, возникающих при действии активных форм кислорода. Цель работы. Целью работы было изучение закономерностей взаимодействия OG-ДГ с ДНК. В работе решались следующие задачи: 1) разработка метода получения гомогенных препаратов OG-ДГ из Е. coli; 2) исследование активности OG-ДГ по отношению к одно- и двухцепочечным олигонуклеотидам; 3) изучение влияния расположения и окружения модифицированных нуклеотидных звеньев в олигонуклеотидах различного состава и их комплексов на активность OG-ДГ; 4) определение протяженности участков ДНК, защищаемых ферментом от нуклеазного расщепления; 5) изучение специфических и неспецифических, сильных и слабых взаимодействий OG-ДГ с ДНК на количественном уровне с помощью анализа ингибирования, исследуемого фермента олигонуклеотидами различного состава и длины; 6) оценка относительного вклада неспецифических взаимодействий OG-ДГ с ДНК в обеспечение специфичности действия фермента.
Научная новизна и практическая ценность работы. Работа представляет собой первое, на количественном уровне, систематическое исследование механизмов узнавания OG-ДГ ДНК, дезоксирибоолигонуклеотидов (ON) и их производных, содержащих 8-оксогуанин (8-oxoG) в различных положениях цепи. Разработан эффективный и легко
воспроизводимый метод получения электрофоретически гомогенных препаратов OG-ДГ из клеток суперпродуцирующего штамма Е. coli. Впервые показана возможность расщепления ферментом одноцепочечных ON, содержащих 8-oxoG. Выявлена закономерность изменения величин Кт и Fmax в реакции, катализируемой гликозилазой, в зависимости от положения 8-oxoG в составе одно- и двухцепочечных ON. Впервые показано, что: а) введение в дуплекс двух соседних 8-oxoG в большей степени замедляет катализ выщепления обоих оснований, чем влияет на эффективность комплексообразования; б) расщепление субстратов OG-ДГ происходит только в том случае, когда модифицированное основание удалено по крайней мере на 2-звена от 3'-конца ON. Показано, что только в случае ON, содержащих 8-oxoG в первом положении с 5'-конца, для расщепления олигонуклеотида необходимо наличие 5'-концевого фосфата. Оценена протяженность участка ДНК, защищаемого OG-ДГ от нуклеазного расщепления (10-14 звеньев). Показано, что при переходе от одно- к двухцепочечной ДНК возрастает число звеньев ON, взаимодействующих с гликозилазой. Установлено, что АР-лиазный центр OG-ДГ расположен на расстоянии не более 3 нуклеотидных звеньев от 5'-конца 10-14 звенного фрагмента ДНК, находящегося в пределах белковой глобулы фермента. Впервые определены величины К\ (Дб53), характеризующие эффективность комплексообразования OG-ДГ с ON различного состава и длины. Проведен анализ роли оснований и межнуклеотидных фосфатных групп ON в их связывании с OG-ДГ. Показано, что специфичность функционирования гликозилазы обеспечивается не на стадии комплексообразования, а на стадии катализа за счет увеличения (на несколько порядков) величины константы скорости реакции в случае ON, содержащих 8-oxoG.
Результаты работы являются чрезвычайно важными для понимания механизмов репарации и белково-нуклеиновых взаимодействий.
Объем работы. Диссертация изложена на 133 страницах, включая 20 рисунков и 5 таблиц. Список цитированной литературы включает 189 работ. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, результатов работы и их обсуждения, выводов.
Публикация и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ. Основные результаты работы докладывались на Научно-практической конференции врачей "Актуальные проблемы развития и совершенствования военной медицины в Сибирском военном округе" (Новосибирск, 1995), Международном симпозиуме "Recombination: mechanism and biological consequences" (Avignon, 1995), Двухсторонних симпозиумах "Regulation of Gene Expression" Франция-Россия (Новосибирск, 1995; Montpellier-
He, 1997), Международной конференции "Современные концепции эволюционной генетики" (Новосибирск, 1997), Международной конференции (Volga River, June 9-14,1997).