Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1 Анализ методов высокочувствительного обнаружения белков 14
1.1.1 Непрямые методы обнаружения белков 16
1.1.2 Прямые методы обнаружения белков 21
1.2 Нанопроволочные структуры как сенсорные элементы биохимических электронных детекторов 28
1.3 Методы функционализации нанопроволочных сенсорных элементов 33
1.4 Концентрационная чувствительность биосенсоров на базе нанопроволочных сенсоров 49
1.5 Состояние и перспективы развития нанопроволочных биосенсоров в России 54
Глава 2. Материалы и методы
2.1 Реактивы и биологические объекты 58
2.2 Нанопроволочный биосенсор 60
2.3 Функционализация поверхности нанопроволочных сенсорных элементов для биоспецифической детекции белков 62
2.4 Визуализация молекулярных зондов с помощью атомно-силовой микроскопии 65
2.5 Методика приготовления образцов 66
2.6 Регистрация биомолекул с помощью нанопроволочного биосенсора 67
Глава 3. Результаты и их обсуждение
3.1 Результаты функционализации поверхности нанопроволочного чипа 73
3.2 Влияние ширины нанопроволок на стабильность регистрируемого сигнала в буферном растворе 82
3.3 Регистрация белков с использованием КНИ-НП-чипов n-типа проводимости 84
3.4 Регистрация белков с использованием КНИ-НП-чипов р-типа проводимости 100
Выводы 109
Заключение 111
Финансирование 113
Благодарности 113
Литература 114
- Непрямые методы обнаружения белков
- Состояние и перспективы развития нанопроволочных биосенсоров в России
- Результаты функционализации поверхности нанопроволочного чипа
- Регистрация белков с использованием КНИ-НП-чипов р-типа проводимости
Непрямые методы обнаружения белков
В этих методах регистрация выловленных молекул аналита осуществляется при помощи обычных детекторов с использованием промежуточных схем усиления сигнала от выловленных молекул, таких как использование реакции ферментативного катализа с наработкой продукта с характерным спектром поглащения использование других меток, например меченых наночастиц с большей поверхностью и т.д.
Одними из наиболее распространенных непрямых методов являются методы цифрового ИФА с использованием микрочастиц и иммуноанализа с использованием плазмонного резонанса на золотых частицах в растворе, которые обладают фемтомолярной чувствительностью.
Цифровой иммуноферментный анализ с использованием микрочастиц
Современными серологическими молекулярными методами диагностики являются иммуноферментный анализ (ИФА) и полимеразная цепная реакция (ПЦР). ИФА – универсальный метод определения реакции взаимодействия антиген – антитело [42]. Выявления антигенов и антител, основанный на определении комплекса «антиген-антитело» за счет введения в один из компонентов реакции ферментативной метки с последующей ее детекцией с помощью соответствующего субстрата, изменяющего свою окраску. Чувствительность ИФА определяется способностью одной молекулы фермента катализировать превращение большого числа молекул субстрата и позволяет регистрировать малые количества антигена (нанограммы) в пробе [42].
Метод иммуноферментного анализа (ИФА) широко используется в протеомном анализе. Чувствительность стандартного метода ИФА с использованием микрочастиц 10-12 М [43]. Это концентрационное ограничение обусловлено тем, что в случае стандартного ИФА флуоресцирующие молекулы, генерируемые каждой молекулой фермента, диффундируют в объем исследуемого раствора (обычно 0,1 – 1 мл), и для получения флуоресцентного сигнала выше фонового шума необходимо высвобождение 105 ферментных меток. Однако было показано, что чувствительность метода ИФА может быть существенно повышена в случае применения детекторов, позволяющих регистрировать отдельные флуоресцирующие молекулы. Так, научной группой Todd [44] для этого использовался детектор в режиме счета фотонов. В этой работе был реализован иммуноанализ с использованием магнитных микрочастиц для вылавливания белка. Авторы зарегистрировали белок тропонин I в плазме крови при его концентрации менее 10-15 М в 150 мкл пробы и времени инкубации 1 мин с использованием проточной микрокапиллярной системы и детектора в режиме счета фотонов. Авторы объясняют высокую чувствительность разработанного метода тем, что сконструированная ими система позволила отсечь фоновый шум, а также тем, что неспецифическое связывание с поверхностью микрочастиц было минимизировано.
В методе цифрового ИФА с использованием микрочастиц, разработанном научной группой Rissin [30], был достигнут предел чувствительности 10-16 M при использовании объема пробы менее 1 мл. В методе цифрового ИФА реализован принцип иммуноанализа, в котором первичные антитела иммобилизованы на поверхность микрочастиц [45]. Количество микрочастиц, вводимых в пробу, при этом должно превышать количество молекул аналита. После вылавливания аналита из раствора пробы микрочастицы с выловленными молекулами обрабатывались растворами вторичных антител и флуорофора. Далее микрочастицы подаются в матрицу с ячейками так, что каждая микрочастица попадала в отдельную ячейку объемом 50 фемтолитров, в которой и проводилась ферментативная реакция для регистрации и подсчета отдельных флуоресцирующих микрочастиц. Метод цифрового ИФА позволяет регистрировать белки, как в растворах аналита, так и в образцах биологического происхождения.
Также высокой чувствительности на уровне 10-18 М для стрептавидина, меченого -галактозидазой, удалось достигнуть научной группой Rissin [30]. Использование метода цифрового ИФА позволило зарегистрировать простатический специфический антиген (ПСА) при концентрации 10-15 М [45], а также фактор некроза опухоли - и интерлейкин-6 в 200 мкл плазвы крови в концентрациях 10-16 М [46].
Повышение производительности и снижение времени инкубации достигаются в методе ИФА за счет использования большого количества активных микрочастиц ( 105-106) в малом (100 мкл-1 мл) объем пробы.
Иммуноанализ с использованием плазмонного резонанса на золотых наночастицах в растворе
Использование метода плазмонного резонанса на золотых наночастицах в коллоидном растворе описана в работе [47]. В работе [48] предложена схема усиления сигнала за счет преципитации серебряных наночастиц в коллоидном растворе золотых нанорезонаторов. В этой работе белок ПСА вылавливали на поверхность золотых нанорезонаторов размером 60±8 нм, модифицированных поликлональными антителами против ПСА. Выловленные из сыворотки крови молекулы ПСА детектировали при помощи вторичных моноклональных анти -ПСА и вторичных антител, меченых глюкозооксидазой. Глюкозооксидаза вызывала образование в пробе Н2О2 и восстановление введенных в систему ионов серебра до металлического серебра, которое оседало на поверхности золотых нанорезонаторов. Это вызывало смещение максимума спектра поглощения в синюю область, что и регистрировалось детектором. В этой работе была достигнута концентрационная чувствительность на уровне 10-20 M для ПСА при использовании 1 мл пробы и времени инкубации пробы 2 ч.
В другой работе вылавливание целевого белка ПСА и капсид антигена ВИЧ – р24 из биоматериала проводили на поверхность лунок стандарного планшета, функционализированную моноклональными антителами против белков-мишеней [47]. В качестве вторичных антител использовали поликлональные антитела, к которым добавляли анти-антитела, меченые каталазой. После завершения реакции антген/антитело/вторичное антитело в планшеты вводили смесь растворов перекиси водорода, морфолиноэтансульфоновой кислоты и трихлорида золота для проведения колориметрической реакции. В случае отсутсвия в пробе белка-мишени раствор имел малиновую окраску из-за образования коллоидного раствора золотых наночастиц. В присутствии целевого белка происходило изменение цвета раствора с малинового на голубой, вследствие образования агрегатов золотых наночастиц при ускорении разложения перекиси водорода каталазой. Для белков ПСА и р24 в образцах сыворотки крови объемом 100 мкл была достигнута минимальная концентрация 410-20 М, при этом время инкубации пробы составило 1 ч.
Метод Иммуно-ПЦР
Иммуно-ПЦР (англ. immuno-PCR) является сверхчувствительным методом, который сочетает высокую специфичность метода иммуноферментного анализа и высокую чувствительность полимеразной цепной реакции. Для многократного усиления сигнала в методе иммуно-ПЦР используются ДНК фрагменты в качестве метки. Амплификация ДНК-метки позволило повысить чувствительность ИФА на несколько порядков [49].
В работе [50] авторы детектировали формирование специфических комплексов антиген/антитело с помощью ПЦР и ДНК-метки. Для анализа продуктов ПЦР использовали гель-электрофорез. При исследовании методики в качестве детектирующего объекта был выбран бычий сывороточный альбумин (БСА). Вместо детектирующего антитела с ферментом использовали комплекс: биотинилированная линейная плазмида (pUC 19), химерная молекула стрептавидина и белка А. Выделенный с поверхности клеточной стенки золотистого стафилококка белок А обладает высокой специфичностью к иммуноглобулинам (IgG1, IgG2 и IgG4) человека. Результаты проведенных испытаний показали высокую чувствительность обнаружения антигена – до 580 молекул БСА в пробе. Таким образом, чувствительность разработанного метода в 105 раз больше в сравнении с твердофазным ИФА [50].
Позже Ruzicka и соавторы в своей работе заменили химерную молекулу стрептавидина и белка А на белок авидин [51]. Авторы, используя данную методику, провели количественное определение углеводных опухолеспецифичных маркеров в крови. Путем детекции поверхностного антигена нескольких типов раковых клеток – ганглиозида GM3, авторы добились чувствительности подхода на уровне 10 клеток в образце крови [52]. Zhou и соавторы предложили модифицированный формат иммуно-ПЦР, так называемый универсальный иммуно-ПЦР [53]. Этот метод заключается в том, что к биотинилированному комплексу антиген/антитело последовательно присоединяется стрептавидин и биотинилированная ДНК-метка. К преимуществам универсального иммуно-ПЦР можно отнести: а) возможность проведения прямого и сэндвич-анализа, б) низкий уровень перекрестных неспецифичных иммуно-реакций, в) производительность анализа.
Состояние и перспективы развития нанопроволочных биосенсоров в России
В последние годы в России разработка биосенсоров и биочипов стала одним из популярных технологических направлений биомедицины, а в частности в секторе лабораторной диагностики. На сегодняшний день наиболее популярны глюкометры, используемые для контроля уровня глюкозы в крови, разработанных на базе таких биосенсоров. В настоящее время активно разрабатываются биосенсоры для выявления белков–маркеров инфекционных заболеваний и белков, ассоциированных с развитием онкологических патологий. Некоторые отечественные разработки уже коммерциализируются и находят международное признание. Так, на базе лаборатории электрохимических методов химического факультета МГУ был создан детектор для регистрации глюкозы и лактата (ООО «Русенс»). В Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН (ИМБ РАН) разработали тест-систему «ТБ-БИОЧИП», позволяющую выявлять туберкулез. Такие микрочипы нашли широкое применение в десятках российских центров.
Что касается биосенсоров на безе нанопроволочных структур, то большое количество исследований посвящено изучению физико-химических параметров нанопроволочных сенсоров [132-134]. Однако работы, посвященные обнаружению белковых молекул в образцах биологического происхождения единичны.
В данной работе использовали КНИ-структуры, которые являются наиболее перспективными для разработки биосенсорных систем.
Так, на сегодняшний день в России уже разработаны уникальные технологии изготовления чипов к нанопроволочному биосенсору, содержащие нанопроволочные структуры на основе слоев «кремний-на-изоляторе» (КНИ), не уступающие по аналичитеских характеристикам мировым аналогам (КНИ-НП-чипы). Главным преимуществом нанопроволок на основе структур КНИ (в сравнении с нанопроволоками из иных материалов и отдельно выращенных цилиндрических нанопроволок), является совместимость методов их изготовления с КМОП-технологией (КМОП – комплементарная структура металл-оксид-полупроводник; стандартная технология промышленного изготовления микросхем). Это определяет потенциал использования такого чипа и, соответственно, нанопролочного биосенсора, в качестве универсальной платформы для широкомасштабного производства портативных высокочувствительных диагностических систем, доступных для персонализированного применения [135-137].
Производство КНИ-НП-чипов организовано в Институте физики полупроводников им. А. В. Ржанова СО РАН, Новосибирск (ИФП СО РАН). КНИ-НП-чипы используются некоторыми. отечественными научными кллективами Так, научной группой д.ф-м.н. Крупенина В. А. (МГУ) был разработан метод для регистрации изменения временной зависимости тока при различных рН буферных растворов с использованием КНИ-нанопроволочных структур [138].
Группой, профессора Пышного Д. В. был предложен новый тип модификации поверхности структур КНИ, где с помощью карбонилдиимидазола или глицидоксипропилтриметоксисилана формировали ультратонкий переходный слой сенсор-зонд для высокоспецифичного обнаружения короткой РНК. В качестве целевых молекул использовали две короткие РНК, которые ассоциированы с развитием онкологических заболеваний. Обнаружение таргетных молекул с использованием КНИ-сенсоров и флуоресцентного анализа был проведен без использования каких-либо методов амплификации. Измерения проводились в режиме реального времени. Исследователи продемонстрировали высокоспецифичный анализ с фемтомолярной чувствительностью [139].
Примеры, демонстрирующие применение нанопроволочных структур на базе КНИ-структур для детекции белка отечественными и зарубежными коллективами единичны. Нанопроволочные биосенсоры также перспективы для детекции низкомолекулярных веществ. Научной группой д.б.н. Иванова Ю.Д. показана возможность обнаружения молекул ДНФ в растворе при низкой концентрации ( 10-14М) с помощью КНИ-НП-чипов [140]. Пористые кремниевые нанопроволоки могут использоваться для оптического обнаружения молекулярного кислорода (O2). Нанопроволоки изготавливаются методом химического травления и легированния пластин кремния бором. Полученные результаты показывают, что такие нанопроволоки являются высокоперспективным наноматериалом для измерения газа при комнатной температуре, и, кроме того, такие слои можно использовать для оптических датчиков [141].
Использование нанопроволочных биосенсоров не ограничивается примерами, описанными выше. Благодаря высокой чувствительности такие биосенсоры находят применение в других областях. Например, комбинация нанопроволочного биосенсора с нанопорой может дать толчок новому направлению в разработке секвенаторов [142]. Такая структура позволит регистрировать олигонуклеотиды на уровне отдельных молекул посредством регистрации импульса тока, возникающего при транспорте молекулы ДНК через нанопору в сочетании с каналом биосенсора. Сигнал возникает из-за локального изменения электрического потенциала, когда отдельные основания ДНК пересекают нанопору.
Другим преимуществом систем на базе КНИ явяляется оргинальная разработке конфигурации – биосенсор и гибкая мембрана, которая занимает неравновесное положение вблизи полевого транзистора. Адсорбция биомолекулы на мембране приводит к смещению мембраны по направлению к сенсорному элементу и экспоненциальному увеличению сигнала. Hahm и соавторы показали, что чувствительность такой детектирующей системы возможно повысить на несколько порядков, осносительно известных в настоящее время биосенсорных систем [119]. Также вероятно, что дальнейшее развитие технологии слоистых материалов (графена, дисульфидов металлов и т. д.), благодаря действующим между слоями ван-дер-ваальсовым силам, обеспечит изготовление новых затворов для полевых транзисторов с использованием наномеханического принципа для повышения чувствительности биосенсора.
Развитие персональных генетических и иммунодиагностических систем будет определяется темпами снижения цен на нанопроволочные биосенсоры, а также темпами повышения их функциональности. С этой точки зрения разработка нанопроволочных биосенсорных систем перспективна, так как возмножно использование в диагностических системах массивов нанопроволочных сенсорных элементов вместо флуоресцентных меток и массового производства интегральных микросхем с электрохимическими биочипами обеспечит снижение цены.
При этом платформа на основе КМОП-технологии, используемая для регистрации сигналов pH с помощью ионно-чувствительных транзисторов, может быть модифицирована для работы с КНИ-НП структурами, производимыми в ИФП СО РАН. Миниатюрные геометрические размеры КНИ-НП сенсоров по сравнению с ионно-чувствительными транзисторами позволяют существенно увеличить общее количество сенсоров на одном чипе.
Таким образом, коммерческое оборудование на основе КНИ-НП биосенсора будет обладать следующими преимуществами для решения задач в протеомных исследованиях: высокая чувствительность, время регистрации – несколько минут, мультиплекность, многоканальность, возможность миниатюризации, низкие затраты на производство и обслуживание, использование аптамеров вместо антител. В случае транскиптомного анализа система КНИ-НП-биосенсора позволит регистрировать нуклеиновые кислоты с фемтомолярной чувствительностью в режиме реального времени без использования процедуры амплификации позволяет проводить быстрый анализ транскриптома и генетическое типирование.
Результаты функционализации поверхности нанопроволочного чипа
Контроль химической модификации поверхности нанопроволочного чипа
Поскольку чипы к КНИ-НП-биосенсору производятся с открытой поверхностью (c естественным окислом), то при их хранении нанопроволочные структуры невозможно полностью защитить от адсорбции различного рода загрязнений. Основными источниками загрязнений поверхности КНИ-НП-чипа являются органические и неорганические реагенты в том числе: вода, отдельные пылевые частицы, с которыми соприкасаются кристаллы (оборудование, инструмент, оснастка, технологическая тара); технологические среды; одежда операторов и др. С целью освобождения поверхности нанопроволок от возможных загрязнений и удаления естественного окисла проводится предварительная обработка КНИ-НП-чипа. Известно, что условия предварительной очистки значительно влияют на эффективность модификации поверхности [91]. Поэтому для воспроизводимого контролируемого состояния поверхности КНИ-НП-чипа требовалась предварительная обработка, которая не разрушает нанопроволоки и позволяет в дальнейшем детектировать макромолекулы с высокой чувствительностью.
Модификацию поверхности КНИ-НП-чипа проводили для формирования на поверхности нанопроволок органосиланового слоя с терминальными аминогруппами, которые необходимы далее, на этапе сенсибилизации, для ковалентной иммобилизации молекул-зондов. Химическая модификация заключалась в обработке поверхности кремнийорганическим соединением – силаном, поэтому далее использован термин «силанизация». В настоящей работе использовали схему обработки поверхности c помощью АПТЭС в газовой фазе. Условия силанизации поверхности подбирали таким образом, чтобы сформировать монослой силана на поверхности нанопроволок. В результате, сформированный слой АПТЭС имел определнную толщину – 0,9-1,2 нм (рисунок 14) [77].
Контроль эффективности силанизации поверхности КНИ-НП-чипа выполнен с помощью сравнительного анализа вольт-амперных характеристик (ВАХ) до и после процедуры силанизации. На рисунке 15 представлены ВАХ нанопроволочных структур, полученные для НП n-типа (рисунок 15а) и p-типа (рисунок 15б) до и после процедуры силанизации.
Из представленных на рисунке 15 кривых видно, что силанизация поверхности КНИ-НП-чипа n-типа вызывает сдвиг ВАХ нанопроволок вправо относительно несиланизированных нанопроволок, а в случае нанопроволок р-типа – влево.
Из представленных на рисунке 15 кривых видно, что силанизация поверхности КНИ-НП-чипа n-типа вызывает сдвиг ВАХ нанопроволок вправо относительно несиланизированных нанопроволок, а в случае нанопроволок р-типа – влево. Изменение проводимости нанопроволок после химической модификации использовалось как критерий эффективности сенсибилизации. Как правило, после процедуры силанизации наблюдался сдвиг ВАХ на величину 4 В и более, вправо для КНИ-НП-чипа n-типа или влево для КНИ-НП-чипа р-типа. Если такой сдвиг наблюдался, то чип использовался в дальнейших экспериментах.
Зависимость вольт-амперных характеристик силанизированных нанопроволок от рН среды
Известно, что для КНИ-НП-биосенсора должна наблюдаться зависимость тока сток-исток (Ids) от pH среды [39, 76, 148]. Эта зависимость обусловлена модуляцией тока при адсорбции ионов раствора на поверхность нанопроволок. Поэтому, важным этапом работы стало определение работоспособности КНИ-НП-биосенсора с силанизированной поверхностью в зависимости от значений pH буферного раствора. На рисунке 16 представлены вольт-амперные характеристики силанизированного КНИ-НП-чипа n-типа, измеренные в буферных растворах со следующими характеристиками: (1) глициновый буфер 1 мМ, рН 3,6; (2) дистиллированная вода рН 5,9; (3) калий-фосфатный буфер 1 мМ рН 7,4.
Как видно из рисунка 16 повышение значений рН от 5,9 до 7,4 вызывает сдвиг характеристик НП сенсоров вправо (рисунок 17, кривая 3 относительно кривой 2). Уменьшение рН среды от 5,9 до 3,6 вызывает сдвиг характеристик НП сенсоров влево (рисунок 17, кривая 1 относительно кривой 2). Так, сдвиг ВАХ относительно воды (рН 5,9) для глицинового буфера (рН 3,6) составил 10 В влево, а для калий-фосфатного буфера (рН 7,4) – 10 В вправо.
Повышение проводимости силанизированных нанопроволок n-типа с понижением pH коррелирует с данными по зависимости роста дзета-потенциала SiO2 поверхности, модифицированной аминопропилтриэтоксиси-ланом, приведенными в работе научной группы Knopfmacher О. [148].
Контроль сенсибилизации молекулярных зондов на поверхность нанопроволочного чипа
Для обеспечения специфичности детекции целевых биомолекул использовали сенсибилизацию поверхности нанопроволочного чипа с помощью ковалентно иммобилизованных молекулярных зондов. Поэтому на втором этапе функционализации поверхности нанопроволок проводили сенсибилизацию, т.е. пришивку молекулярных зондов. В качестве таких зондов для биоспецифической детекции использовали антитела и аптамеры специфичные против детектируемых белков.
Процедура иммобилизации молекулярных зондов подробно описана в разделе «Материалы и методы». В результате прецизионного нанесения растворов молекулярных зондов были получены капли расположенные, на отдельных нанопроволоках (рисунок 17).
Регистрация белков с использованием КНИ-НП-чипов р-типа проводимости
Чипы с нанопроволочными сенсорами р-типа проводимости с иммобилизованными антителами и аптамерами в качестве молекулярных зондов были использованы для детекции вирусного маркера гепатита С – HCVcoreAg (таблица 2). Также, как и в случае использования КНИ-НП-чипа n-типа для повышения временной стабильности работы КНИ-НП-биосенсора применяли Pt-электрод, погруженный в измерительную кювету с раствором на расстоянии 5 мм от сенсорной поверхности нанопроволок. Ранее мы показали, что нанопроволочные сенсоры шириной 3 мкм показывают стабильные характеристики сигнала в отсутсвии Pt-электрода. Однако в данном исследовании был использован дополнительный Pt-электрод для нейтрализации возможного индуцированного заряда при вводе раствора в измерительную кювету. Такой заряд может влиять на характер белок-белковых взаимодействий [161].
Возможность обнаружения биомолекул была продемонстрирована на примере детекции кор-антигена вируса гепатита С – HCVcoreAg. Частица вируса гепатита С имеет сферическую форму диаметром 30 – 40 нм (род Hepatovirus, семейство Flaviviridae). Первичная последовательность HCVcoreAg наиболее консервативна из всех белков вируса гепатита С, что позволяет рассматривать его как наиболее универсальный белковый маркер [162]. Также, он появляется на 10-15 день после инфицирования, что на 3-5 дней позже РНК вируса гепатита С, т.е. является маркером для ранней диагностики заболевания. В ряде исследований показано, что существует достоверная корреляция между уровнем РНК и HCVcoreAg, коэффициент корреляции составляет 0,73 - 0,98 в зависимости от вирусной нагрузки пациента [163, 164]. В настоящее время HCVcoreAg сложно определять в крови пациентов методом ИФА на ранней стадии, так как его концентрация в крови ссотавляет 10-12 M [165, 166].
Биоспецифическая детекция маркера гепатита С – HCVcoreAg в буферном растворе
Биоспецифическую детекцию HCVcoreAg проводили в кювете КНИ-НП-биосенсора в режиме реального времени при фиксированном напряжении на затворе – (-0,2) В.
Обнаружение HCVcoreAg осуществляли с использованием чипа, содержащим 12 нанопроволок p-типа проводимости шириной 3 мкм. Для селективной детекции HCVcoreAg, нанопроволоки были сенсибилизированы посредством ковалентной иммобилизации аптамерами и антителами против HCVcoreAg с использованием кросс-линкера DТSSP. Для учета неспецифической сорбции HCVcoreAg, пара нанопроволок того же размера (3 мкм) не была сенсибилизирована молекулярными зондами. Данные от этих сенсоров учитывали для расчета разностного сигнала.
Были проанализированные растворы с концентрацией HCVcoreAg от 2,010-13 М до 2,010-16 М в 1 мМ КФТ с рН 5,1.
На рисунке 28 представлены изменения проводимости нанопроволок, полученные до и после добавления в кювету КНИ-НП-биосенсора анализируемых растворов HCVcoreAg.
Сигналы были зарегистрированы при добавлении раствора HCVcoreAg в измерительную кювету от нанопроволок, как с иммобилизованными антителами (рисунок 28а), так и с иммобилизованными аптамерами (рисунок 28б). Сигнал был зарегистрирован при добавлении белка в диапазоне концентраций от 2,010-13 М до 2,010-16 М.
После замены раствора, содержащего молекулы HCVcoreAg на буферный раствор, существенного изменения уровня сигнала не наблюдали. Это означает, что диссоциация комплексов антитело/белок очень медленная. То есть, для ряда белковых комплексов требуется больше времении на диссоциацию, и следовательно на регенерацию поверхности чипа. Этот фактор обуславливает конфигурацию мультиплексных чипов – на одном чипе целесообразно иммобилизовать зонды с одинаковой скоростью образования и распада компексов.
На рисунке 28 также приведена зависимость сигнала КНИ-НП-биосенсора от концентрации белка HCVcoreAg в растворе, построенная на основе всех данных, полученных в экспериментах по обнаружению HCVcoreAg в буферном растворе.
Минимальная концентрация (Cmin), при которой белок может быть обнаружен с помощью КНИ-НП-биосенсора, составила 2,010-15 М, линейный концентрационный диапазон включает 3 порядка от 2,010-13 М до 2,010-15 М, как в случае использования антител (рисунок 28в), так и в случае использования аптамеров (рисунок 28г) в качестве молекулярных зондов.
Результаты обнаружения белка HCVcoreAg с помощью КНИ-НП-биосенсора были опубликованы в работе [167].
Для комплекса HCVcoreAg/IgG Kd cоставляет порядка 0,810-7 М [168, 169], тогда согласно уравнению 2 число образовашихся на поверхности нанопровлоки комплеков будет равно 0,0004. Константа диссоциации для комплекса HCVcoreAg/аптамер cоставляет 10-6-10-7 М. Это значение Kd можно использовать как ориентировачное, поскольку в состав комплекса входит аптамер с последовательностью отличной от последовательности аптамера, используемого в данной работе. Кроме того, в этом случае, как в случае пары антиАФП/АФП Kd расситывали методом поверхностного плазмонного резонанса, при котором не учитывалось влияние электрического поля на эффективность взаимодействия.
По данным производителя изоэлектрическая точка (pI) HCVcoreAg составляет 8,9, поэтому в условиях эксперимента белок имеет положительный заряд. В случае использования нанопроволок p-типа на затвор КНИ-НП-чипа подается отрицательное напряжение, ориентирующее сложную молекулу белка в пространстве, определенным образом. Так, в кислой среде на поверхность нанопроволоки адсорбируются молекулы HCVcoreAg, которые при взаимодействии с молекулами зондов приводят к изменению уровня сигнала КНИ-НП-биосенсора.
Кроме того, были проведены исследования по обнаружению белка в КФБ (рН 7,4) при аналогичных условиях. При этом воспроизводимось сигнала при анализе растворов аналита не была зарегистрирована.
Биоспецифическая детекция HCVcoreAg в сыворотке крови
Цель исследований на данном этапе работ заключалась в определении возможности обнаружения маркерного белка антигена HCVcoreAg в сыворотке крови больного вирусным гепатитом С. Использованы КНИ-НП-чипы р-типа с «широкими» нанопроволоками (3 мкм), сенсибилизированные аптамерами. Исходный образец сыворотки, разбавленный в 2000 раз в 1 мМ КФТ, добавляли в объеме 5 мкл в кювету биосенсора, содержащую 100 мкл буфера. Регистрация сыворотки была проведена при фиксированном напряжении на затворе, Vds=(-0,2) В, с использованием Pt-электрода. Измерения проводились в течение 25 мин в режиме реального времени.
Результаты обнаружения HCVcoreAg в этой экспериментальной серии приведены на рисунке 29.