Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1 Проблема обнаружения белков в растворах с низкими концентрациями 12
1.2 Методы исследования белков на уровне отдельных молекул 17
1.3 Возможности АСМ при исследовании отдельных биомакромолекул 31
1.3.1 Контактные и динамические режимы визуализации АСМ 31
1.3.2 Режим силовой спектроскопии 35
1.3.3 Расширение возможностей АСМ при комбинации с другими методами для исследования биомакромолекул 42
1.4 Применение АСМ в медицине 43
1.5 Конструкция АСМ-чипа: предпосылки 50
1.5.1 Материалы для изготовления чипов 50
1.5.2 Принцип фишинга целевых белков 54
1.5.3 Формат АСМ-чипов 56
Глава 2. Материалы, методы и разработанные методики фишинга 60
2.1 Атомно-силовые микроскопы 60
2.1.1 Принцип получения АСМ-изображений в режиме топографии 64
2.1.2 Обработка результатов АСМ-сканирования в режиме топографии 65
2.1.3 АСМ-измерения в режиме PicoTREC 67
2.2 Вспомогательное лабораторное оборудование 68
2.3 Краткая характеристика белков, используемых в качестве целевых при АСМ-фишинге 69
2.4 Антитела, аптамеры, реактивы 71
2.5 Методика сорбции белков на свежесколотую слюду 75
2.6 Реализованные схемы фишинга 77
2.7 Дизайн АСМ-чипов 80
2.7.1 АСМ-чипы на основе слюды для фишинга в объеме анализируемого раствора 80
2.7.2 Методика формирования на поверхности АСМ-чипа массива из сенсорных зон 81
2.7.3 АСМ-чипы на основе ВОПГ для фишинга в проточном режиме 84
2.7.4 Определение размера сенсорной зоны на поверхности 85
2.8 Методики активации поверхности и иммобилизации биомолекул лигандов 87
2.8.1 Методика ковалентной иммобилизации белков на поверхность чипа с применением кросс-линкеров EDC и NHS 87
2.8.2 Методика активации поверхности с помощью сукцинимидного кросс-линкера и последующей иммобилизации молекул лиганда на поверхность чипа 89
2.8.3 Модификация иммобилизованных антител 92
2.8.4 Модификация кантилевера с помощью gp120 для АСМ-измерения в режиме PicoTREC 93
2.9 Методики фишинга 94
2.9.1 Неспецифический необратимый (химический) фишинг 94
2.9.2 Неспецифический обратимый фишинг 95
2.9.3 Биоспецифический обратимый и необратимый фишинг 97
Глава 3. Результаты и обсуждение 100
3.1 Результаты предварительных и контрольных экспериментов 100
3.1.1 Результаты процедуры силанизации 100
3.1.2 Контроль чистоты используемых растворов 106
3.1.3 Визуализация белков на поверхности свежесколотой слюды 107
3.1.4 Результаты определения площади сенсорной зоны на поверхности АСМ-чипа и расчетная оценка чувствительности анализа 115
3.2 Результаты фишинга неспецифического необратимого (химического) 120
3.2.1 Химический фишинг авидина 120
3.2.2 Химический фишинг пероксидазы хрена (ПХ) 124
3.2.3 Химический фишинг: заключение 128
3.3 Результаты фишинга неспецифического обратимого 130
3.3.1 Результаты контрольных экспериментов 130
3.3.2 Результаты фишинга ЧСА 131
3.3.3 Результаты фишинга цитохрома b5 134
3.3.4 Результаты измерения заряда в ячейке для фишинга после ввода растворов 137
3.3.5 Фишинг неспецифический обратимый: обсуждение и заключение 139
3.4 Результаты биоспецифического обратимого фишинга НСVcoreAg при использовании АСМ-чипа с иммобилизованными антителами 144
3.4.1 Результаты иммобилизации антител на поверхность чипа 144
3.4.2 Результаты биоспецифического обратимого и необратимого фишинга НСVcoreAg при использовании АСМ-чипа с иммобилизованными антителами 145
3.4.3 Биоспецифический фишинг НСVcoreAg при использовании АСМ-чипа с иммобилизованными антителами: обсуждение и заключение 153
3.5 Результаты биоспецифического фишинга gp120 154
3.5.1 АСМ-визуализация после процедуры иммобилизации аптамера против gp120 в полуконтактном режиме 155
3.5.2 АСМ-визуализация иммобилизованного аптамера против gp120 в режиме PicoTREC 157
3.5.3 Биоспецифический фишинг gp 120: АСМ-чип с иммобилизованными аптамерами 158
3.5.4 АСМ-визуализация антител против gp120 в полуконтактном режиме 159
3.5.5 Биоспецифический фишинг gp 120: АСМ-чип с иммобилизованными антителами 159
3.5.6 Оценка контрастности изображения молекул белка gp120, выловленного на АСМ-чип с иммобилизованными аптамерами и АСМ-чип с иммобилизованными антителами 160
3.5.7 Биоспецифический фишинг gp 120: заключение 161
3.6 Результаты биоспецифического фишинга НСVcoreAg при использовании АСМ-чипа с иммобилизованными аптамерами 163
3.6.1 АСМ-чипы с одним типом аптамеров для обнаружения рекомбинантного HCVcoreAg в буферном растворе 163
3.6.2 Биоспецифический фишинг HCVcoreAg при использовании АСМ-чипа с одним типом аптамеров: результаты контрольных экспериментов 167
3.6.3 Биоспецифический фишинг HCVcoreAg при использовании АСМ-чипа с одним типом аптамеров: обсуждение 170
3.6.4 Разработка критериев оценки АСМ-данных при использовании чипов с иммобилизованными аптамерами 171
3.6.5 АСМ-чипы с тремя типами аптамеров для обнаружения рекомбинантного HCVcoreAg в буферном растворе: определение чувствительности анализа 174
3.7 АСМ-чипы с иммобилизованными аптамерами для обнаружения HCVcoreAg в сыворотке крови человека 183
3.7.1 Обнаружение HCVcoreAg в сыворотке: результаты 183
3.7.2 Обнаружение HCVcoreAg в сыворотке: обсуждение и заключение 191
3.8 Анализ и обобщение полученных результатов 193
Заключение 198
Выводы 199
Список сокращений и условных обозначений 201
Библиография 202
Благодарности 214
- Методы исследования белков на уровне отдельных молекул
- Атомно-силовые микроскопы
- Результаты биоспецифического обратимого и необратимого фишинга НСVcoreAg при использовании АСМ-чипа с иммобилизованными антителами
- Анализ и обобщение полученных результатов
Методы исследования белков на уровне отдельных молекул
Установление механизмов межмолекулярных взаимодействий и их количественная характеристика имеет большое значение для описания разнообразных биологических процессов [23,24]. За последние десятилетия развились новые методы, позволяющие манипулировать и изучать отдельные биомолекулы, а также изучать взаимодействие отдельных молекул. Возможность мониторинга биологических процессов на уровне отдельных биомолекул, т.е. на фундаментальном уровне чувствительности, приводит к лучшему пониманию молекулярных механизмов. Могут быть исключены усреднение, распределение и флуктуация молекулярных свойств по ансамблю молекул. Таким образом, по сравнению с обычными ансамблевыми методами исследования эксперименты с одной молекулой позволяют исследовать свойства неоднородных систем [24].
В учебном пособии Сердюка И. [9] подчеркивается, что «о существовании макромолекул мы узнаем только благодаря методам, с помощью которых их можно наблюдать […]. Не существует единого метода, обеспечивающего всю необходимую информацию о макромолекулах и их взаимодействии». Также следует учитывать, что биомакромолекулы являются функционирующими единицами только в подходящих растворителях, и в исследование биосистем должно быть включено изучение окружающих биомолекулу водных растворов. В этой же работе предлагается иллюстрация, отражающая возможности некоторых биофизических методов (Рис. 2). Как видно из Рис. 2, несмотря на очень высокое разрешение методов ЯМР и кристаллографии (0,1-1 нм), требуется достаточное большое количество биологического материала (109-1015 усредненных биомолекул) для проведения исследований.
В целом, методы исследования отдельных биомолекул могут быть разделены на три группы:
- методы, которые позволяют визуализировать отдельные молекулы;
- методы, которые позволяют манипулировать отдельными молекулами; -методы, регистрирующие сигнал от отдельной молекулы.
К первому классу относятся методы визуализации излучения одиночных флуорофоров, которые позволяют исследовать движение и взаимодействие биомолекул, взаимодействие биомолекул с компонентами клетки. Исследование с использованием флуорофоров незаменимы при изучении живых клеток и тканей, важной особенностью которых является низкий контраст внутренних структур. Таким образом, основные преимущества флуоресцентной микроскопии: возможность прижизненного изучения объектов и наблюдения процессов в реальном времени; возможность специфического мечения тканей, клеток, органелл и отдельных молекул; доступное на данный момент разнообразие флуоресцентных красителей и белков позволяет изучать одновременно несколько мишеней [25].
Одним из наиболее высокочувствительных методов флуоресцентной микроскопии является биолюминесцентная томография [26]. Биолюминесценция является результатом экзотермической химической реакции в живых организмах, когда освобождающаяся энергия выделяется в форме света. Люцифераза светляка (Photinus pyralis) – наиболее распространенный фермент для биолюминесцентной визуализации in vivo. Использование фермента, имеющего высокую специфичность к своему субстрату, и отсутствие фонового излучения в живых тканях делают биолюминесцентный способ визуализации высокочувствительным – 10–15–10–17 М. Основной недостаток метода – низкое пространственное разрешение 3-5 мм [26].
В процессе технологического совершенствования методов флуоресцентной визуализации разработаны инструментальные методы, позволяющие с высоким разрешением различать несколько флуоресцентных меток одновременно и на большой глубине в тканях. Визуализация в пространственном контексте (imaging) может быть использована для исследования движения флуоресцентномеченной биомолекулы в клетке, сквозь мембрану и прочее. Один из способов определить точное положение флуоресцирующих молекул в некоторой точке — целенаправленно перевести флуорофоры вокруг этой точки в темновое состояние [27]. Данный подход реализован в группе методов RESOLFT (REversible Saturable OpticaL Fluorescence Transitions), объединяющей несколько сходных концепций [27]. Принципиально другой подход основан на последовательной стохастической активации флуорофоров. Если за каждый раунд активации небольшое число флуорофоров переходит в флуоресцентное состояние, и при этом интенсивность света подобрана таким образом, что активированные флуорофоры находятся на расстоянии примерно 200 нм, то положение каждого флуорофора можно определить с точностью до 1 нм. Идея случайной последовательной активации флуорофоров лежит в основе методов STORM (STochastic Optical Reconstruction Microscopy), PALM (PhotoActivated Localization Microscopy), и FPALM (Fluorescence PhotoActivation Localization Microscopy) [23].
Для достижения высокой чувствительности в схемах с флуоресцентной цифровой детекцией белков обычно проводятся измерения в конфигурации полного внутреннего отражения. Для реализации схем флуоресцентной детекции нефлуоресцирующих молекул обычно используют 2 подхода. Первый подход основан на сшивании флуоресцирующих меток с молекулами аналита. Второй подход основан на добавлении к регистрируемому белку антител с флуоресцирующей меткой.
В работе [28] методом флуоресцентной микроскопии в конфигурации полного внутреннего отражения (TIRFM, total internal reflection fluorescence microscopy) в проводилась детекция С-реактивного белка человека (CRP) в растворах очищенного рекомбинантного СRP и в сыворотке крови с использованием моноклональных анти CRP в качестве первичных и биотинилированных поликлональных анти-СRP в качестве вторичных антител. В качестве флуоресцентной метки использовался конъюгат стрептавидина с AlexaFluor 488. Первичные антитела были иммобилизованы на поверхности силанизированного стекла в виде сформированного методом АСМ-DPN (нанолитография с использованием зонда АСМ) или SPT-DPN массива пятен диаметром 360 – 400 нм. Детекция белка-мишени производилась в диапазоне концентраций от 10-15 до 5 10-20 М. При этом объем пробы составлял 25 – 100 мкл. Время инкубации составляло 2,5 ч при перемешивании. В этой работе предел обнаружения CRP составил 5 10-20 М в растворе очищенного белка и 8,9 10-19 М в сыворотке крови. Авторы показали, что при концентрации аналита 5 10-20 М в каждой флуоресцирующей точке находилась одна молекула белка мишени [28].
В работе [29] также на основе флуоресцентного метода проводилась детекция фактора некроза опухоли человека (TNF-cc) в растворах и клинических образцах слюны. Первичные антитела были иммобилизованы на поверхности силанизированного стекла в виде сформированного методом АСМ-DPN массива пятен диаметра 179 нм. Объем анализируемой пробы составлял 50 мкл при времени инкубации 1 ч при перемешивании. В этой работе предел обнаружения TNF-a составил 6 10"19 М.
Атомно-силовые микроскопы
В работе использованы следующие АСМ:
(1) АСМ на базе ИНТЕГРА (НТ-МДТ, Зеленоград, Россия),
(2) АСМ Титаниум (НТ-МДТ, Зеленоград, Россия);
(3) АСМ Dimension 3100 (VEECO (Bruker), США);
(4) АСМ Agilent 5500 (Agilent, США).
АСМ (1-3) были использованы для измерений в режиме топографии поверхности (см. ниже), АСМ (4) был использован в режиме PicoTREC (см. ниже).
Зондовая нанолаборатория (ЗНЛ) ИНТЕГРА в зависимости от конфигурации позволяет вести измерения в различных режимах (атомно-силовая микроскопия и ее модификации, сканирующая туннельная микроскопия, сканирующая ближнепольная оптическая микроскопия и др.). В работе использовалась конфигурация для атомно-силовой микроскопии со схемой сканирования образцом, при которой зонд АСМ закреплен в сканирующей головке, а перемещение образца относительно зонда при сканировании осуществляется сканером, находящемся в основании прибора. ЗНЛ ИНТЕГРА, снабжена встроенным шаговым двигателем для точного автоматического подвода образца к зонду АСМ. В ЗНЛ ИНТЕГРА для обеспечения перемещения зонда относительно образца при сканировании с необходимой точностью используются сканеры из материала, обладающего пьезоэффектом (пьезокерамика). В приборах фирмы НТ-МДТ применяется наиболее популярное решение – трубчатый пьезокерамический сканер. Сканер ЗНЛ ИНТЕГРА имеет максимальную площадь сканирования 90 90 мкм и диапазон Z 3 мкм. Точность измерения по высоте составляет 0,1 нм.
При работе ЗНЛ ИНТЕГРА в качестве системы защиты от внешних вибраций использовался антивибрационный стол с активной системой компенсации механических вибраций и (при необходимости) защитный колпак для экранирования акустических шумов.
Для позиционирования зонда АСМ над заданной сенсорной зоной чипа в ЗНЛ ИНТЕГРА использовался автоматизированное основание несерийного производства.
Автоматизированный X, Y позиционер с датчиками Renishaw (Рис. 3) устанавливается на сменное основание вместо стандартного позиционера, с ручным позиционированием образца, и крепится к подвижному цилиндру сменного основания. В позиционер устанавливается сканер, на котором закрепляется образец.
Позиционирование образца, установленного на каретке 1 (Рис. 3), в плоскости XY осуществляется с помощью шаговых двигателей 3 и подпружиненных упоров 2.
Двигатели снабжены концевыми выключателями, которые останавливают передвижение образца при достижении максимальной величины перемещения.
Во время работы шаговые двигатели нагреваются. Для защиты от перегрева двигатели с помощью хладопроводов 5 присоединяются к радиатору 8 винтами 6. Радиатор располагается с нижней стороны сменной панели 7 базового блока.
Позиционер подсоединяется к разъему (стандартному разъему SM) на базовом блоке с помощью разъема 4. К ответной части переходного разъема подключаются другие устройства с шаговыми двигателями, в случае их использования.
Автоматизированное основание для базы ИНТЕГРА, имеет возможность автоматизированного перемещения образца (или сканера с образцом) по заданным координатам в пределах требуемых полей перемещения образца (или сканера с образцом).
Перемещение осуществляется шаговыми двигателями, расположенными на специальных выносных рейках. Валы двигателей приводят в движение специально разработанную каретку на линейных направляющих. Направляющие обеспечивают перемещение каретки в плоскости X-Y, с минимальными люфтами. Возвратное перемещение каретки обеспечивается возвратно-пружинным механизмом. На каретке возможно крепление как отдельного образца, так и нижнего СЗМ сканера с закрепленным образцом.
Подключение автоматизированного модуля происходит через базу ИНТЕГРА, с учетом особенностей конструкции.
Управление перемещением происходит программным способом, в программе управления СЗМ. В соответствующей вкладке задаются координаты исследуемого места. После этого образец перемещается по заданным координатам.
Контроль перемещения осуществляется линейными датчиками перемещения RENISHAW с заданной прецизионностью. Датчики расположены рядом с двигателями, таким образом, чтобы, не мешая работе шаговых двигателей, считывать перемещение по заданным координатам со специальной микрометрической линейки.
Универсальные столики крепления образцов (Рис. 4) позволяют однозначно крепить образцы в трех типах устройств: роботов-раскапывателей BIOForce, NanoArrayer, PerkinElmer Piezzorray и АСМ (ИНТЕГРА).
Позиционирование образца в столике обеспечивается конструкцией столика, с точностью достаточной для однозначного положения измеряемых объектов в области исследования.
Две конструкции столиков предназначены для крепления в базе ИНТЕГРА и на покровных стеклах для робота-раскапывателя. Образцы в обеих конструкциях располагаются однозначно, что обеспечивает легкость нахождения требуемых участков сканирования (при изначальной привязке по координатам)
В АСМ Титаниум реализована схема сканирования образцом. Тип сканера: пьезотрубка с датчиками перемещения; сканирование образцом. Максимальный диапазон сканирования XYZ: 100 100 10 или 2 2 0,2 мкм в режиме пониженного напряжения. Датчики перемещения: доступны для всех осей XYZ.
Для АСМ Титаниума характерна высокая степень автоматизации процессов.
Система позиционирования зонд-образец на моторизованном по XYZ основании. Диапазон перемещения: 5х5 мм по XY; 10 мм по Z. Система навигации включает запоминание места сканирования; навигацию с помощью мыши по видеоизображению; автоматизированное сканирование по нескольким участкам образца. Система оптического контроля включает: моторизованную систему фокусировки, увеличения и перемещения по XY; система калибровки положения образца и лазерного луча по оптическому изображению. Оптическое разрешение: 2 мкм. Поле зрения: до 22 мм (1 MPx); до 77 мм с функцией панорамного оптического сканирования (50 MPx).
Для сканирования массива сенсорных зон использовалась встроенная опция MultiScan, позволяющая автоматически осуществлять последовательное сканирование областей до 55 мм с возможностью сшивки перекрывающихся сканов.
В АСМ Veeco Dimension 3100 реализована схема сканирования зондом, при которой перемещение зонда относительно исследуемого образца осуществляется при помощи пьезокерамического сканера, смонтированного в блоке с держателем зонда. АСМ Veeco Dimension 3100 оснащен шаговым электродвигателем для точного автоматического подвода зонда к исследуемому образцу. Вращающийся столик с держателем образцов оснащен шаговым двигателем для автоматического перемещения образца. Максимальный диаметр образца 15 см. Для перемещения зонда относительно образца при сканировании в АСМ Veeco Dimension 3100 используется трубчатый пьезокерамический сканер, обеспечивающий перемещение зонда в диапазоне 6 мкм по вертикальной оси и максимальную площадь сканирования 90х90 мкм. Точность измерения по высоте составляет 0,1 нм. При работе АСМ Veeco Dimension в качестве системы защиты от внешних шумов используется антивибрационный стол с активной системой виброзащиты и экранированный защитный кожух
Результаты биоспецифического обратимого и необратимого фишинга НСVcoreAg при использовании АСМ-чипа с иммобилизованными антителами
Подробно методика изготовления чипов описана в разделах 2.7.1, 2.8.1, 2.8.3. Коротко, для биоспецифического фишинга из 1 мл анализируемого раствора использовались АСМ-чипы с двумя зонами – с иммобилизованными антителами против HCVcoreAg (рабочая зона) и без молекул-лигандов (контрольная зона).
В случае необратимого фишинга, а также в случае обратимого фишинга из 50 мл, использовались АСМ-чипы также с двумя зонами – с иммобилизованными антителами против HCVcoreAg (рабочая зона) и с иммобилизованными антителами против HBsAg (контрольная зона).
АСМ-чип инкубировался в анализируемых растворах антигена HCVcoreAg объемом 1 мл или 50 мл в течение 1 часа. Далее следовала отмывка чипа. Исследуемый диапазон концентраций составил от 10"9 до 10"11 М в случае обратимого связывания, и от 10"13 до 10"17 М в случае необратимого фишинга. На данном этапе работ использовался HCVcoreAg (ВекторБест, Россия), Mг=17кДа.
В случае необратимого фишинга иммобилизованные на поверхности антитела дополнительно модифицировались фотоактивным кросс-линкером и инкубация проводилась при УФ-облучении раствора. Подробно методики проведения фишинга описаны в разделе 2.9.3.
Оценка результатов эксперимента проводилась на основе расчета величины а -доли объектов с высотой более 2 нм среди всех визуализированных объектов на поверхности после проведения инкубации. Этот параметр используется для оценки увеличения вклада в правое крыло распределения визуализированных объектов после проведения фишинга. Высота комплекса выше, чем высота его компонентов, поэтому в случае комплексообразования должно наблюдаться увеличение правого крыла функции распределения частиц по высотам p(h), а также сдвиг максимума этой функции. Уровень 2 нм выбран на основе анализа распределения p(h) иммобилизованных антител на поверхности рабочей зоны: 95% объектов имеют высоту до 2 нм (см.раздел 3.4.1)
Примеры полученных данных приведены на Рис. 37 и Рис. 38, а также в Таб.19. В Таб.19 приведены результаты одной экспериментальной серии «Биоспецифический обратимый фишинг» и одной - «Биоспецифический необратимый фишинг». Как видно из таблицы, на поверхности рабочий зоны после инкубации регистрируется примерно постоянное количество объектов от 12796 до 15490, среднее значение N400=14495±743. В других экспериментальных сериях N400 также составляло 14 500 объектов. Полученная величина согласуется с количеством иммобилизованных антител N4oo,aV 15 000 и свидетельствует о том, что ковалентно иммобилизованные антитела хорошо «заякорены» на поверхности, и в процессе фишинга (инкубации и последующей отмывки) не десорбируются с поверхности чипа. Совпадение значений N4oo, полученных в серии «обратимый» и «необратимый», свидетельствует о том, модификация антител кросс-линкером (используемая для изготовления чипов в серии «необратимый») не влияет на плотность иммобилизации антител.
Биоспецифический обратимый фишинг HCVcoreAg
На Рис. 37(А) представлены данные контрольного эксперимента: пример изображения поверхности рабочей зоны с иммобилизованными антителами (анти-HCVcoreAg) после инкубации чипа в буферном растворе, не содержащем целевой антиген. Как видно из рисунка на поверхности визуализируются компактные объекты с высотами до 2,0 нм, которые соответствуют иммобилизованным антителам (см. раздел 3.4.1). Доля объектов с высотой более 2,0 нм в этом эксперименте составила а=16% (см. Таб.19). Плотность распределения для антител, визуализированных в этом эксперименте, приведена на Рис. 37(Г, черная линия).
На Рис. 37 (Б) приведены примеры изображения поверхности после инкубации в 1 мл 10"9 М растворе антигена. Как видно из рисунка, после инкубации на поверхности были зарегистрированы объекты с высотой до 6 нм. Функция p(h), соответствующая этим объектам приведена на Рис. 37 (Г, синяя линия). Величина ОС(рабочая зона) составила 91%.
После инкубации АСМ-чипа в 1 мл 10"8 М и 10"10 М растворе на поверхности также были зарегистрированы объекты с высотами более 2 нм (изображения не представлены). Однако при уменьшении концентрации до 10"11 М таких объектов регистрировалось значительно меньше Рис. 37 (Г, 1 мл), и их доля составила ссфабочая зона) = 24%. Как видно из Таб.19, во всех случаях анализа ссфабочая зона) более величины 16%, полученной в контрольном эксперименте. Поэтому можно утверждать, что в процессе инкубации, т.е. в процессе биоспецифического обратимого фишинга на поверхности чипа в рабочей зоне сформировались комплексы антитело/антиген (анти-HCVcoreAg/HCVcoreAg).
В случае анализа 1 мл 10"12 М раствора ссфабочая зона) = 12%, следовательно, выделить сигнал от комплексов не представляется возможным.
Следует отметить, что в случае фишинга из 10"8 М раствора, комплексов зарегистрировано меньше (ссфабочая зона) =27%), чем в случае фишинга из 10"9 М раствора (ссфабочая зона) =91%). Можно предположить, что низкая эффективность комплексообразования на поверхности связана с агрегацией белка в более высококонцентрированном растворе. Возможность агрегации антигена обсуждалась в разделе 3.1.3, при рассмотрении результатов сорбции белков на поверхность свежесколотой слюды.
На следующем этапе был проведен биоспецифический фишинг из 50 мл 10"11 М раствора, т.е. из раствора с наименьшей концентрацией, при которой белок был зарегистрирован в 1 мл раствора. В этом эксперименте использовался чип, содержащий помимо иммобилизованных анти-HCVcoreAg в рабочей зоне, также неспецифичные антитела (анти-HBsAg), иммобилизованные на поверхности контрольной зоны. Цель использования такого чипа - определение величины а(Контролъная зона), отражающей неспецифическое связывания целевого белка HCVcoreAg или примесей в растворе с антителами того же класса, что и используемые в качестве молекул-лигандов анти-HCVcoreAg.
Пример полученного изображения рабочей зоны после инкубации в 50 мл 10"11 М раствора приведен на Рис. 37 (В). Результаты обработки данных приведены на Рис. 37 (Г, зеленая линия) и в Таб.19. Как видно из рисунка и таблицы, с увеличением объема анализируемого раствора увеличилась эффективность комплексообразования и величина ОСфабочая зона) возросла до 49%.
Результаты обработки данных сканирования поверхности контрольной зоны приведены на рис. Рис. 37 (Г, оранжевая линия) и в Таб.19. Как видно из рисунка и таблицы, на поверхности также зарегистрированы объекты, которые можно отнести либо к неспецифическим комплексам анти-HBsAg/HCVcoreAg, либо неспецифическим примесям, сорбированным на поверхность с иммобилизованными антителами. Однако доля этих объектов астральная зона) = 20%, что более чем в 2 раза ниже, чем ссфабочая зона) = 49% соответствующая рабочей зоне с иммобилизованными анти-HCVcoreAg на этом же чипе.
Анализ и обобщение полученных результатов
Высокая чувствительность аналитической системы на основе АСМ-фишинга обусловлена эффективным концентрированием белка и высокой чувствительностью регистрирующей системы на уровне отдельных молекул белка.
Для оценки эффективности концентрирования белка в процессе необратимого фишинга может быть введен фактор концентрирования (F). При условии, что все молекулы (Nv), присутствующие в объеме (У), могут быть выловлены и ковалентно связаны с поверхностью сенсорной зоны чипа площадью Sarea (при этом концентрация молекул белка на поверхности наночипа будет равна СУ) он может быть представлен как
Из уравнения 4 следует, что, F может достигать величины порядка 108 при следующих условиях: высота слоя выловленных молекул h=5 нм, что соответствует диаметру молекулы белка; объем раствора аналита V=1 мл; площадь поверхности сенсорной зоны АСМ-чипа Sarea =1 мм2. Это означает, что в случае необратимого фишинга из 1 мл раствора аналита с концентрацией 1017 М концентрирование молекул с F=108 приведет к увеличению объемной концентрации 10-17 М до приповерхностной концентрации 10-9 М, что значительно облегчит детекцию белков.
Чувствительность детектора оказывает большое влияние на чувствительность аналитической системы, предназначенной для обнаружения белков. Для схемы необратимого фишинга чувствительность DL аналитических систем определяется соотношением [8,14]: что является обратным числом Авогадро. Высокая чувствительность регистрации может быть достигнута при использовании зонда АСМ, имеющего размер порядка размера биологической макромолекулы (1-10 нм).
Из приведенных уравнений (4) и (5) следует:
(1) Чувствительность фишинга может быть повышена при увеличении объема раствора аналита как вследствие увеличения общего числа молекул, доступных для вылавливания, так и вследствие увеличения F;
(2) Чувствительность фишинга возрастает при уменьшении площади поверхности чипа .
В Таб. 29 приведены минимальные значения концентрации буферных растворов, при которых целевые белки были зарегистрированы в данной работе при использовании того или иного типа фишинга. Эти величины были обозначены как DLexp- экспериментальные пределы детекции.
Как показали результаты данной работы, действительно, увеличение объема анализируемого раствора привело к повышению чувствительности анализа. Как, видно из Таб. 29, это показано в случае «Биоспецифического необратимого фишинга» и «Неспецифического необратимого».
С целью уменьшения площади поверхности S увеличения фактора F оправдано использование малой сенсорной зоны. Эффективность такого способа показана в данной работе и в других работах, например [28,29], в которых показана возможность снижения DL для белков до 10"19 - 10"20 М при использовании активированной зоны площадью 0,1 мкм2. Но с другой стороны, использование малой сенсорной зоны ограничивает емкость чипа. Как видно из Таб. 29, емкость чипа с использованными сенсорными зонами площадью Sarea составила порядка 104 - 105 биомолекул.
Для оценки теоретически возможной емкости на основе экспериментальных данных можно использовать величину N4oo,ab. 14 500 - количество антител на площади 400 мкм2 при условии иммобилизации в виде монослоя (см. раздел 3.4.1). Так, если принять, что целевые биомолекулы соответствуют линейным размерам антитела ( 5 нм), то максимальное число биомолекул на поверхности всей сенсорной зоны Sarea =l,S мм2(1766250 мкм2) составило бы: (N400,ab Sarea/Sm) 6,4 107.
Следовательно, теоретически могут быть выловлены и размещены на поверхности сенсорной зоны все биомолекулы, например, из 1 мл 10"13 М раствора. Но, если необходимо выловить большее количество биомолекул, то необходимо увеличивать площадь сенсорной зоны. Максимально возможная Sarea соответствует площади всего чипа ( 1см2 или 100 мм2), в случае использования АСМ-чипа на основе слюды (см. раздел 2.7.1). В таком случае может быть максимально выловлено -3,5 109 биомолекул.
Из представленных соотношений видно, что в случае обратимого связывания DL определяется вторым членом соотношения (7), зависящим от Kd и ограничивается в большинстве случаев значением порядка 10-12 М [8,14]. Соответственно, в случае необратимого фишинга имеем соотношение (5), являющееся частным случаем (7) при Kd=0, что при прочих равных условиях позволяет зарегистрировать белок в более низкой концентрации в случае достаточной чувствительности детектора NAB [8,14].
Как видно из Таб. 29 при биоспецифическом фишинге переход от обратимого связывания к необратимому фишингу позволил снизить DLexp HCVcoreAg с 10-11 М до 10-15 М (при V=1 мл).
В данной работе, для обеспечения «биоспецифичности» анализа использовались антитела, а для перевода «обратимого» связывания в «необратимое» использовалась модификация иммобилизованных антител фотокросс-линкером. Но в практике предпочтительно использование лигандов меньшего размера. Как показано в данной работе, такими лигандами могут быть аптамеры. Повышение эффективности фишинга при использовании молекул-лигандов малого размера можно объяснить следующими факторами. С одной стороны, в случае биоспецифического фишинга с использованием чипа с иммобилизованными антителами плотность (количество на единицу площади поверхности) активных групп на поверхности рабочей зоны чипа ограничена размером иммобилизованных антител ( 5 нм). Поэтому использование лигандов меньшего размеров позволяет повысить плотность активных центров связывания на поверхности. Другим фактором, обусловливающим преимущество аптамеров в качестве лигандов, является повышенная контрастность АСМ-изображения комплекса «аптамер/антиген» по сравнению с «антитело/антиген» (как было показано в разделе 3.5.6). Как видно из Таб. 29, проведение биоспецифического фишинга при сходных условиях с использованием чипов с иммобилизованными аптамерами позволило повысить чувствительность анализа на два порядка и достичь DLexp =10-13 М (при V=1 мл).
В перспективе, для обеспечения «необратимости» возможно использование химически модифицированных аптамеров – «сомамеров» [266,267].
Как видно из Таб. 29 в случае варианта необратимого фишинга - химического фишинга DLexp =10-15 М (при V=1 мл), т.е. также как и в случае «Биоспецифического необратимого фишинга» при том же объеме. Помимо «необратимости» связывания в данном случае, повышению чувствительности также способствует фактор плотности активных центров.