Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературных источников 11
1.1 Концепция раковых стволовых клеток (РСК) 11
1.1.1 Современные представления о возникновении и прогрессии опухолей: теория клональной эволюции и теория раковой стволовой клетки. 11
1.1.2 Основные отличия РСК от дифференцированных раковых клеток
1.1.2.1 Особенности роста in vivo и in vitro 16
1.1.2.2 Экспрессия специфических поверхностных и внутриклеточных маркеров. 20
1.1.2.3 Эксклюзия флуоресцентных красителей . 29
1.2 РСК при колоректальном раке человека 33
1.2.1 Колоректальный рак: классификация, этиология, патогенез 33
1.2.2 Доказательства существования РСК при колоректальном раке человека 38
1.2.3 Молекулярные отличия РСК и дифференцированных раковых клеток при колоректальном раке человека 41
1.3 Новые подходы прогнозирования течения и терапии онкологических заболеваний на основе результатов исследования РСК 44
1.3.1 Корреляция численности РСК и клинического исхода заболевания 44
1.3.2 Сигнальные пути, характерные для РСК 45
1.3.3 Сигнальные пути РСК в качестве мишеней для терапии 46
ГЛАВА 2. Материалы и методы 51
2.1. Опухолевый материал 51
2.1.1. Получение опухолевого материала 51
2.1.2. Приготовление суспензии опухолевых клеток 51
2.1.3. Определение жизнеспособности клеточной культуры при помощи МТТ-теста 52
2.2. Клеточные линии 53
2.2.1. Культивирование клеточных линий 53
2.2.2. Анализ контаминации клеток микоплазмой 53
2.3 Проточная цитометрия: подготовка проб и проведение анализа 54
2.3.1. Подготовка проб к анализу поверхностных маркеров клеток 54
2.3.2. Анализ поверхностных маркеров клеток 55
2.3.3. Окрашивание клеток витальным красителем DyeCycle Violet (DCV) 56
2.3.4. Окрашивание клеток витальным красителем Rhodamine 123 (Rh 123) 56
2.3.5. Цитометрический анализ эксклюзии витального красителя DCV 57
2.3.6. Цитометрический анализ эксклюзии витального красителя Rh 123 58
2.4 Клеточная сортировка 58
2.4.1. Подготовка проб для клеточной сортировки 58
2.4.2. Проведение клеточной сортировки 58
2.5 Протеомный анализ 59
2.5.1 Экстракция белка из образцов клеток 59
2.5.2 Гидролитическое расщепление белков с помощью концентрирующих фильтров 59
2.5.3 Хроматографическое разделение пептидов 61
2.5.4 Масс-спектрометрическая регистрация пептидов c помощью высокоразрешающего прибора Orbitrap Velos 61
2.5.5 Идентификация масс-спектрометрических данных в программном обеспечении Mascot 62
2.5.6 Относительный количественный анализ в программном обеспечении Progenesis LC/MS 62
2.5.7 Анализ данных сравнительного протеомного анализа 63
2.6 Статистический анализ данных 63
ГЛАВА 3. Результаты исследования 64
3.1 Анализ гетерогенности клеточного состава опухолевой ткани пациентов с колоректальной аденокарциномой 64
3.2 Исследование экспрессии маркера СD133, ассоциированного с раковыми стволовыми клетками, в образцах опухолевой ткани пациентов с колоректальной аденокарциномой. 71
3.3 Выявление раковых стволовых клеток на основе анализа эксклюзии витальных красителей - метод «боковой популяции» 79
3.4 Анализ экспрессии CD133 на клетках «боковой популяции» 88
3.5 Сравнительный анализ экспрессии поверхностных молекул на РСК колоректальной аденокарциномы и на дифференцированных раковых клетках 92
3.6 Сравнительный протеомный анализ субпопуляций раковых клеток с высоким и низким уровнем экспрессии CD133 из опухолевых образцов от пациентов с колоректальной аденокарциномой. 99
3.7 Cравнительный протеомный анализ субпопуляций раковых клеток с высоким и низким уровнем экспрессии CD133 в клеточной линии колоректальной аденокарциномы человека Сасо-2 110
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 119
4.1 Численность CD133-позитивных РСК варьирует в образцах колоректальной аденокарциномы, полученных от пациентов 119
4.2 Процент CD133-позитивных клеток в «боковой популяции» не повышен относительно общей популяции раковых клеток. 120
4.3 РСК из опухолевых образцов от пациентов с колоректальной аденокарциномой характеризуются повышенным уровнем экспрессии белков, связанных с возникновением и прогрессированием злокачественных опухолей . 123
4.4 Профили белков РСК клеточной линии колоректальной аденокарциномы человека Сасо-2 и опухолевых образцов от пациентов с колоректальной аденокарциномой имеют существенные отличия. 126
Заключение 129
Выводы 131
Список сокращений 132
Список литературы 133
- Эксклюзия флуоресцентных красителей
- Определение жизнеспособности клеточной культуры при помощи МТТ-теста
- Хроматографическое разделение пептидов
- РСК из опухолевых образцов от пациентов с колоректальной аденокарциномой характеризуются повышенным уровнем экспрессии белков, связанных с возникновением и прогрессированием злокачественных опухолей
Эксклюзия флуоресцентных красителей
В настоящее время не вызывает сомнений, что опухоль состоит из различных субпопуляций клеток, которые имеют различные пролиферативные и дифференцировочные свойства, фенотип, способность к метастазированию, чувствительность к терапевтическим препаратам [1,6]. Клеточные механизмы, лежащие в основе этой опухолевой гетерогенности, являются в настоящее время объектом интенсивных исследований в области биологии рака. На данный момент предложены две теории для обоснования гетерогенности и внутренних различий опухолей: теория клональной эволюции и теория раковой стволовой клетки (РСК) [7].
Наиболее распространенная и устоявшаяся теория клональной эволюции постулирует, что возникновение опухоли происходит, когда множественные мутации происходят в случайной единичной клетке, придавая ей селективную способность к росту по сравнению с близлежащими нормальными клетками. Согласно данной теории, раковые клетки в опухоли с течением времени претерпевают различные мутации, а последовательный естественный отбор наиболее приспособленных и агрессивных клонов приводит к прогрессированию опухоли. По мере того, как опухоль прогрессирует, генетическая нестабильность и неконтролируемая пролиферация обеспечивают образование новых клонов клеток с дополнительными мутациями и, следовательно, новыми характеристиками, что и приводит к гетерогенности опухоли. В течение этого процесса любая раковая клетка может потенциально стать инвазивной и вызвать метастазирование или стать устойчивой к терапии и вызвать рецидивирование онкологического заболевания [8]. Однако к настоящему моменту уже накопилось значительное количество доказательств того, что способностью формировать опухоль обладает лишь небольшая субпопуляция раковых клеток. Так, в 1971 году Park C.H. и его коллеги обратили внимание, что в культуре миеломных клеток наблюдаются значительные различия в способности к пролиферации. А именно, когда клетки миеломы мыши, полученные из асцитной жидкости мышей, отделяли от нормальных гемопоэтических клеток и тестировали in vitro на способность к образованию колоний, только одна из 100-10000 раковых клеток была способна формировать колонии. Такие клетки назвали «опухолевые стволовые клетки» [9]. Этот результат согласовался с данными другого более раннего эксперимента, в котором при трансплантации лимфомных клеток мыши in vivo, только 1-4% клеток могли формировать колонии в селезенке [10]. В конце 1970-х годов Salmon S.E. и Hamburger A.W. при исследовании опухолевых клеток человека, выделенных из костного мозга и асцитной жидкости пациентов с различными гематологическими и солидными злокачественными заболеваниями, показали, что только маленькая часть клеток является клоногенной в культуре in vitro. Они показали, что лишь одна из 1000-100000 клеток множественной миеломы, неходжкинской лимфомы и хронической лимфоцитарной лейкемии, и одна из 500-5000 клеток рака легких, рака яичников, меланомы и нейробластомы формировали колонии в мягком агаре [11].
Из этих экспериментов можно было сделать два различных вывода: либо большинство опухолевых клеток не обладало колониеобразующей способностью, и только небольшая субпопуляция являлась клоногенной, либо все опухолевые клетки обладали потенциалом к колониеобразованию, но только часть клеток получала преимущество в связи с более подходящими для них условиями эксперимента. Лишь в 90-е годы в связи с разработкой метода исследования способности раковых клеток к клонообразованию in vivo, а также развитием и широким распространением метода проточной цитометрии и сортировки клеток стало возможным разделить различные субпопуляции опухолевых клеток и показать, что одна субпопуляция обладает сильным клоногенным потенциалом, а все другие клетки лишены клоногенности. В 1994 году группой ученых под руководством Dick J.E. при исследовании острого миелолейкоза было показано, что субпопуляция клеток, которая могла вызывать лейкемию при трансплантации в иммунодефицитных мышей линии SCID, составляла 0,01-1% от общей популяции клеток, и имела фенотип CD34+CD38–, идентичный фенотипу гемопоэтических стволовых клеток (ГСК). Эти клетки были единственными клетками, способными переносить острый миелолейкоз от пациентов к мышам линии SCID в подавляющем большинстве случаев. Это исключало возможность того, что все клетки острого миелолейкоза обладали низкой исходной клоногенной способностью, и показало, что лишь маленькая субпопуляция клеток обладает способностью пролиферировать и переносить заболевание [12]. Последующие исследования, основанные на серийных трансплантациях в иммунодефицитных мышей клеток лейкемии от пациентов с острой миелоидной лейкемией [13], множественной миеломой [14] или хронической миелоидной лейкемией [15], еще раз подтвердили тот факт, что только небольшая часть клеток способна инициировать соответствующие лейкозы и поддерживать их у мышей-реципиентов.
Вскоре аналогичные данные были получены и для солидных опухолей. В 2003 году группа исследователей, изучавших рак молочной железы, идентифицировали и выделили у восьми из девяти пациенток клетки с фенотипом CD44+CD24–/lowLineage–. Всего лишь около 100 клеток с этим фенотипом были способны образовывать опухоли у мышей линии NOD-SCID, в то время как десятки тысяч клеток с альтернативным фенотипом не формировали опухоли. Они произвели серийное пассирование онкогенных субпопуляций, и каждый раз клетки этой субпопуляции порождали новые опухоли, содержащие новые CD44+CD24–/lowLineage– онкогенные клетки, а также фенотипически разнообразные смешанные популяции неонкогенных клеток, присутствовавших в исходной опухоли [16]. В том же году другая группа исследователей сообщила об идентификации и выделении опухолеобразующих клеток из опухолей головного мозга человека, которые обладали способностью к самообновлению и дифференцировке. Они заметили, что опухолеобразующие клетки головного мозга, выделенные из самых агрессивных форм медуллобластомы, обладают повышенным потенциалом к самообновлению популяции по сравнению с другими. Эти клетки были выделены в составе клеточной фракции, которая экспрессировала поверхностный клеточный маркер стволовых клеток CD133 [17]. К настоящему времени накопилось достаточно убедительных доказательств существования особой субпопуляции онкогенных клеток в солидных опухолях поджелудочной железы [18], толстого кишечника [19], печени [20], предстательной железы [21], яичников [22], в меланоме [23].
Эти данные в совокупности с данными других более поздних экспериментов послужили основой для формулирования альтернативной теории возникновения и прогрессии опухолей, а именно теории раковой стволовой клетки (РСК). В соответствии с ней определенная субпопуляция клеток опухоли, состоящая из РСК, запускает образование, прогрессию и рецидивирование опухоли. Эти клетки обладают способностью к самовоспроизведению и дифференцировке, подобно нормальным стволовым клеткам. Их самовоспроизведение и дифференцировка приводят к образованию всех клеточных типов опухоли, таким образом, формируя ее гетерогенность. При этом другие клетки опухоли не обладают неограниченной способностью к самовоспроизведению и не могут продуцировать все клеточные типы опухоли. Также, согласно теории РСК, метастазирование опухоли является результатом диссеминации РСК по организму, а рецидивирование онкологического заболевания вызвано их устойчивостью к терапии. Предполагается, что РСК происходят от клеток, обладающих способностью пролиферировать, то есть от нормальных стволовых клеток или от прогениторных клеток органа. Существуют несколько причин полагать, что это так. Во-первых, основное количество мутаций возникает при репликации ДНК. Если повреждение ДНК произошло в одной цепи, мутация может закрепиться лишь при делении клетки. Во-вторых, стволовые и прогениторные клетки обладают активированными механизмами самовоспроизведения, и поддержание этой активации может быть проще, чем их включение de novo в более дифференцированных клетках. Другими словами, меньше мутаций потребуется, чтобы поддерживать самовоспроизведение, чем для того, чтобы его активизировать [24].
Определение жизнеспособности клеточной культуры при помощи МТТ-теста
Хотя концепция возникновения колоректального рака в результате последовательных мутаций, происходящих во время клональной экспансии единичной стволовой клетки стала широко признанной [121], существование РСК кишечника до недавнего времени не было доказано экспериментально. В одном из первых исследований, посвященных выявлению РСК кишечника, для идентификации опухолеобразующих клеток применили маркер CD133 [34]. Клетки с фенотипом CD133+ были отсортированы из суспензии опухолевых клеток, полученной из послеоперационных образцов и путем инъекций в иммунодефицитных мышей был продемонстрирован их опухолеобразующий потенциал. Также было показано, что CD133+ клетки, численность которых насчитывала около 2,5% от общего числа опухолевых клеток, были лишены маркера дифференцировки эпителиальных клеток кишечника цитокератина 20 (СК20), в то время как экспрессировали молекулу эпитеалиальной адгезии EpCAM [34]. В другом исследовании O`Brien и соавт. выделили CD133+ клетки из семи образцов первичного очага и десяти образцов метастазов колоректального рака. Затем CD133+ клетки инъецировали в почечную капсулу иммунодефицитных мышей линии NOD-SCID. Посредством метода серийных разведений они подсчитали, что одна опухоль-инициирующая клетка приходилась на 5,7104 всех опухолевых клеток, тогда как во фракции CD133+ клеток одна опухоль-инициирующая клетка приходилась на 262 клетки, т.е. происходило обогащение более чем в 200 раз. CD133+ клетки давали начало опухолям в мышах, тогда как CD133– клеточная популяция была неспособна образовывать опухоли даже после серийной трансплантации в мышах. При этом опухоль-инициирующие клетки были способны поддерживать свою популяцию, а также дифференцироваться и восстанавливать гетерогенность опухоли, что было продемонстрировано наличием CD133+ и CD133– в тех же соотношениях, что и в исходной опухоли [19]. В обоих исследованиях была продемонстрирована экспрессия CD133 также и в нормальной ткани кишечника, хотя с более низкой частотой, так что можно предположить, что опухолеобразующие клетки в образцах рака могли образоваться в результате онкогенной трансформации нормальных стволовых кеток кишечника. Кроме того, в отличие от CD133– клеток CD133+ клетки рака кишечника экспоненциально росли более чем один год in vitro в виде недифференцированных опухолевых сфер в бессывороточной среде, поддерживая способность к трансплантации и воспроизведению таких же морфологических и антигенных паттернов исходной опухоли. При изъятии из среды факторов роста CD133+ сферы постепенно дифференцировались, приобретая морфологию адгезивных клеток, и экспрессировали маркеры дифференцировки, такие как СК20. В то же время экспрессия CD133 исчезала во время дифференцировки, так же как и способность образовывать рак в иммунодефицитных мышах [34].
Большой резонанс вызвала работа V. Shmelkov и соавторов, в которой было прослежено появление экспрессии CD133 в кишечнике здоровых взрослых мышей и во время онкогенеза. Работа была выполнена на мышах со встроенным геном-репортером lacZ (CD133lacZ/+), в котором экспрессия lacZ запускалась эндогенным промотором CD133. Они обнаружили, что экспрессия CD133 в кишечнике не ограничивается стволовыми клетками; напротив, CD133 повсеместно экспрессируется на дифференцированном кишечном эпителии как у взрослых мышей, так и у людей. Также они продемонстрировали, что CD133 экспрессируется во всем диапазоне клеток рака кишечника, которые экспрессируют молекулу адгезии эпителиальных клеток EpCAM. Сходно с этим, CD133 широко экспрессируется клетками рака кишечника человека из первичного очага, тогда как популяция CD133– состоит в основном из стромальных клеток и клеток, связанных с воспалением. В противоположность этому, в метастазах рака кишечника человека экспрессия CD133 не идентифицировала всю популяцию эпителиальных и онкогенных клеток. И CD133–, и CD133+ субпопуляции из метастатических очагов формировали колоносферы в культурах in vitro и были способны к онкогенезу в NOD-SCID серийных ксенотрансплантационных моделях. Более того, метастатические
CD133– клетки образовывали более агрессивные опухоли и экспрессировали типичные фенотипические маркеры опухоль-образующих клеток, включая CD44 (популяция с фенотипом CD44+CD24–), тогда как фракция CD133+ состояла из CD44lowCD24+ клеток. В совокупности, эти данные предполагают, что экспрессия CD133 не ограничивается стволовыми клетками кишечника и опухоль образующими клетками рака кишечника, и что во время метастатического перехода опухолевые клетки CD133+ могут дать начало более агрессивной субпопуляции CD133– клеток, которые также способны к опухолеобразованию в NOD-SCID мышах [122]. Эти результаты, которые противоречат предшествующим исследованиям, частично могут быть объяснены данными, полученными в работе Kemper и соавторов, в которой они установили, что промоторная активность, экспрессия сплайс-вариантов мРНК, белка и даже поверхностная экспрессия CD133 сохраняются в дифференцированных опухолевых клетках. Однако избирательное гликозилирование белка приводит к его сворачиванию и маскировке специфических эпитопов на поверхности клетки, таким образом, что их нельзя выявить посредством поверхностных антител, однако они выявляются при применении других методов [123].
Существуют разные подходы в отношении того, какие маркеры более надежны при выявлении РСК колоректального рака. Так, Dalerba и соавт. для выделения РСК кишечника применили CD44 и эпителиальный поверхностный антиген EpCAM. Подкожная инъекция популяции клеток CD44+/EpCAMhighмышам линии NOD-SCID с высокой частотой приводила к образованию опухолевых ксенотрансплантатов, тогда как у CD44– /EpCAMlowклеток опухолеобразующая активность отсутствовала. Дальнейшее разделение популяции CD44+/EpCAMhigh с применением маркера мезенхимальных стволовых клеток CD166 увеличивало эффективность опухолевой транпслантации [42].
Хроматографическое разделение пептидов
Статистический анализ был произведен с применением программы IBM SPSS Statistics 20. Для оценки связи между процентом клеток опухоли, экспрессирующих маркер CD133, и количественными клинико-патологическими характеристиками пациентов, такими как возраст пациентов и уровень РЭА в крови, использовали линейный коэффициент корреляции Пирсона. Значимость коэффициента проверялась при заданном уровне значимости 0,05 (Надежность статистических выводов – 95%). Для оценки связи между процентом клеток опухоли, экспрессирующих маркер CD133, и качественными клинико-патологическими характеристиками пациентов, включая пол пациентов, локализацию первичного очага, наличие метастазов, стадию заболевания по классификации TNM, гистологический тип аденокарциномы, применяли коэффициент корреляции Крамера. Значимость связи проверяли при помощи 2-критерия при заданном уровне значимости 0,05. (Надежность статистических выводов – 95%).
В связи с тем, что объектом данного исследования являлась опухолевая ткань от пациентов, особое внимание было уделено оптимизации метода получения суспензии опухолевых клеток из данного материала с сохранением их максимальной жизнеспособности и минимальным изменением экспрессии молекул на поверхности клеточной мембраны. Для получения суспензии в нашей работе применялась механическая дезагрегация ткани с последующей ее ферментативной обработкой. Мы сравнили жизнеспособность клеток суспензии, полученной с применением трех различных ферментов, часто используемых для дезагрегации опухолевой ткани кишечника, – коллагеназы, диспазы и трипсина, время обработки которыми составляло два часа. Процент выделенных живых клеток определяли посредством окрашивания суспензии пропидий иодидом с последующим анализом методом проточной цитометрии. Как видно на рисунке 4, процент мертвых клеток в случае коллагеназы I составил 6%, диспазы II – 4%, трипсина – 7%. Такой низкий процент мертвых клеток в образцах может быть связан с тем, что в ходе подготовки проб для проточной цитометрии опухолевая суспензия проходит процедуры отмывки и фильтрацию, в ходе которых из суспензии удаляются конгломераты мертвых клеток.
На рисунках по оси абсцисс - интенсивность флуоресценции в усл. ед., по оси ординат -количество событий (клеток). Синей линией обозначен неокрашенный контроль. Также жизнеспособность клеток при использовании различных ферментов была оценена посредством МТТ-теста. Данный метод основан на способности дегидрогеназ митохондрий живых клеток превращать растворимый желтый 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил тетразолия бромид (МТТ) в нерастворимые пурпурно-синие внутриклеточные кристаллы формазана. После растворения формазана с помощью ДМСО оптический сигнал при длине поглощения (540–570 нм) пропорционален количеству живых клеток. При анализе жизнеспособности мы измерили оптический сигнал от одинакового количества клеток, полученных с применением трех различных ферментов. Результаты измерений представлены в таблице 3.
Как видно из результатов МТТ-теста, дегидрогеназная активность опухолевых клеток, выделенных с применением трех различных ферментов, отличалась незначительно. Однако все же наибольшую дегидрогеназную активность имели клетки, полученные с применением диспазы II, поэтому в последующих экспериментах для ферментативной дезагрегации опухолевой ткани мы использовали именно этот фермент.
Так как распространенным вариантом методики дезагрегации ткани является инкубация с раствором ферментов в течение ночи, мы оценили влияние длительной инкубации клеток на экспрессию поверхностных молекул. Как видно из рисунка 5, процент клеток, экспрессировавших маркер CD 133, при инкубации ткани с диспазой II в течение ночи был ниже, чем при инкубации в течение двух часов, и составлял 10% и 20%, соответственно. Это может объясняться неспецифической активностью протеолитического фермента диспазы в отношении поверхностных белков опухолевых клеток, а также возможным изменением экспрессии данного маркера клетками при длительной инкубации.
С учетом полученных данных в дальнейших экспериментах для дезагрегации опухолевой ткани использовали диспазу II, время инкубации с которой составляло не более двух часов.
После оптимизации метода получения суспензии клеток был проведен анализ гетерогенности клеточного состава опухолевой ткани колоректальной аденокарциномы человека. В качестве оцениваемых параметров были выбраны экспрессия молекул, характерных для клеточных популяций, представленных в опухолевой строме, а именно клеток гемопоэтического ряда и опухолевых фибробластов (CD45, CD10) [179,180] и маркеров, характерных для эпителиальных и/или злокачественно трансформированных клеток (EpCAM, CD24, CD44, CD71) [50,181–183].
РСК из опухолевых образцов от пациентов с колоректальной аденокарциномой характеризуются повышенным уровнем экспрессии белков, связанных с возникновением и прогрессированием злокачественных опухолей
CD117 – рецептор фактора стволовых клеток, участвующий в мобилизации клеток костного мозга и стимуляции их выхода в кровяное русло. Рядом исследователей он рассматривается в качестве маркера РСК печени, легких и яичников [22,188]. Экспрессия маркера CD117 наблюдалась в двух из исследованных образцов, и процент CD117-положительных клеток составлял в них 28% и 80% (рис. 27).
В качестве кандидатов на роль дифференциальных маркеров РСК колоректальной аденокарциномы далее мы рассматривали те молекулы, экспрессия которых наблюдалась как минимум в двух из проанализированных образцов. К ним относились молекулы CD29, CD44, CD90 и CD117. Мы сравнили профили экспрессии этих молекул внутри популяции CD133-позитивных РСК колоректальной аденокарциномы и внутри популяции CD133-негативных дифференцированных раковых клеток. Данные представлены в виде гистограмм на рисунке 28.
Уровни экспрессии маркеров стволовых клеток на CD133-позитивных и CD133-негативных клетках колоректальной аденокарциномы человека. Данные измерений представлены в виде гистограмм, полученных в программе FlowJo v7.6.2. На графиках по оси абсцисс представлена интенсивность флуоресценции соответствующего маркера, по оси ординат – количество клеток, нормированное по отношению к моде. Черным цветом обозначены данные, относящиеся к CD133-негативным дифференцированным раковым клеткам, зеленым – к CD133-позитивным РСК. Цифрами обозначены соответствующие значения медиан уровней флуоресценции, полученные с помощью программы BD FACSDiva Software version 7.
Как видно на рисунке 28, уровни флуоресценции маркеров CD29, CD90, CD117 внутри популяции CD133-позитивных РСК были более чем в 2 раза выше, чем внутри популяции CD133-негативных раковых клеток во всех проанализированных случаях. Уровни флуоресценции маркера CD44 внутри этих двух популяций были приблизительно одинаковыми. На основании этих данных в качестве дополнительных дифференциальных маркеров CD133-позитивных РСК колоректальной аденокарциномы можно рассматривать маркеры CD29, CD90 и CD117.
Сравнительный протеомный анализ субпопуляций раковых клеток с высоким и низким уровнем экспрессии CD133 из опухолевых образцов от пациентов с колоректальной аденокарциномой.
В рамках данного исследования для выявления отличий в экспрессии белков между РСК и дифференцированными раковыми клетками колоректальной аденокарциномы человека мы отсортировали опухолевый материал от 8 пациентов с колоректальной аденокарциномой с фенотипом EpCAMhighCD133high и EpCAMhighCD133low, соответственно (рис. 29).
Для сортировки использовали форсунку с диаметром отверстия 70 мкм при давлении 50 psi. Для увеличения чистоты сортируемых клеточных популяций выбирали режим “Purity”, характеризующийся сниженным выходом, но высокой точностью. При вышеуказанных параметрах процент клеток с заданными во время анализа характеристиками в отсортированных популяциях составлял более 99%. Температуру в рабочей камере прибора устанавливали на +4С. Сортировку клеток проводили в фосфатно-солевом буфере без добавления ЭТС, так как при дальнейшем протеомном анализе содержащийся в ЭТС сывороточный альбумин может приводить к снижению сигнала от белков клеток пробы.
Сортинг клеток, выделенных из образцов опухолей от пациентов с колоректальной аденокарциномой. По оси абсцисс – интенсивность флуоресценции антител к маркеру CD133 в усл.ед., по оси ординат - интенсивность флуоресценции антител к маркеру ЕрСАМ в усл.ед. Сравнительное протеомное профилирование полученных в результате проточной сортировки субпопуляций клеток производили с применением масс спектрометрии высокого разрешения с дальнейшим количественным анализом данных без использования изотопных меток. Для этого пробы белка, полученные в результате экстракции из образцов отсортированных клеток, подвергали гидролизу с использованием мембранных фильтров, отсекающих массы меньше 30 кДа, и для полученных гидролизатов проводили хромато-масс спектрометрический эксперимент на приборе Orbitrap Velos (Thermo Fisher Scientific, Bremen), соединенном с хроматографической системой Agilent 1200 HPLC, в нанопотоковом режиме, используя градиент длиной 240 мин, HCD-тип энергии фрагментации, тип анализатора – орбитальная ионная ловушка, в пяти технических повторах. Полученные в результате анализа файлы обрабатывали с помощью программного обеспечения Progenesis LC-MS. Далее проводили относительный количественный анализ выявленных пептидных ионов на основе измеренных спектров. Белки идентифицировали с использованием информационно-поисковой системы Mascot. Максимальное количество белков, определенных в паре образцов от одного пациента, составило 1447. Среднее количество белков, определяемых в паре образцов от одного пациента, составляло 588. Из всех идентифицированных белков 41 белок представлял собой контаминанты, которые были исключены из последующего анализа. Количество белков, экспрессия которых отличалась более чем в 2 раза между образцами от одного пациента, составляло в среднем 110 белков. В таблицах 7 и 8 представлены результаты сопоставления данных протеомного анализа образцов от 8 пациентов, указывающие на одни и те же отличия в экспрессии белков между двумя исследуемыми популяциями клеток у разных пациентов.