Введение к работе
Актуальность проблемы. В последние годы достигнут значительный успех в изучении и характеристике опухолевых маркеров, так как благодаря развитию техники биохимического анализа появилась возможность проведения быстрой очистки и характеристики сложных молекул. Проблема поиска и изучения опухолевых маркеров связана, во-первых, с изучением особенностей раковых клеток с целью выявления опухолеспецифических антигенов и, во-вторых, с исследованием содержания опухолеспецифических белков в биологических жидкостях для диагностики злокачественных заболеваний, контроля эффективности их лечения и прогноза течения болезни. Среди них наиболее известны и используются в клинике следующие маркеры: раковоэмбриональный антиген (РЭА), углеводный антиген СА 19-9, опухолеассоциированный гликопротеин - 72 (ОАГ-72) для диагностики рака желудка; СА 125, ОАГ - 72 и маркер муцина 0VX 1 для диагностики рака яичников, гликопротеин СА 15-3 и РЭА для диагностики рака молочной железы; гликопротеин СА 19-9 для диагностики рака поджелудочной железы; простатаспецифический антиген (ПСА) для диагностики рака простаты; фрагмент цитокератина 19 CYFEA 21-1 и РЭА определяются при различных типах рака легкого, а нейроспецифическая енолаза (НСЕ) позволяет диагностировать мелкоклеточную карциному легкого, РЭА повышен при раке прямой и толстой кишки, альфа-фетопротеин (АФП)-для диагностики гепа-тоцеллюлярного рака печени, опухолей терминально-клеточного происхождения и эмбриональных карцином. Недостатком известных маркеров является тот факт, что, во - первых, все они в малых количествах (нг/мл) содержатся в здоровых тканях или биологических жидкостях, во - вторых, ни один из них не является универсальным для всех или хотя бы для большинства видов опухолей. Поэтому одной из актуальных задач ранней
диагностики злокачественных новообразований остается поиск опухолевых маркеров, универсальных для всех или хотя бы большого числа различных опухолей. Такой маркер может быть обнаружен среди белков, связанных с интенсивной пролиферацией клеток - рецепторов факторов роста и онкофе-тальных белков. В частности, известно, что экспрессия рецепторов трансферрина (ТФР) и альфа-фетопротеина (АФПР) резко увеличивается в интенсивно пролиферирующих клетках, к которым относятся эмбриональные и опухолевые клетки (Gatter К., 1983; Niitsu Y., 1987; Geuskens М., 1991; Naval G., 1985).
В последние годы появились работы, позволяющие полагать, что по уровню содержания таких рецепторов в биологических жидкостях организма возможна диагностика опухолевых заболеваний (Мого R.,1993). для создания иммунодиагностических тест-систем для проведения скрининговых исследований содержания ТФР и АФПР в сыворотке крови и других биологических жидкостях больных при различных заболеваниях необходимо получение препаративных количеств этих белков в высокоочищенном состоянии. Поэтому разработка методов их выделения и очистки, а также их характеристика являются самостоятельными и весьма актуальными задачами.
Цель работы состояла в выделении и очистке рецепторов АФП и ТФ из тканей человека. В соответствии с этим в план работы входило: 1.Отработка наиболее оптимальных условий очистки; 2.Выбор и отработка критериев степени чистоты и активности получаемых препаратов;
3.Изучение свойств очищенных препаратов АФПР и ТФР Научная новизна и практическая ценность. Выделены препараты рецепторов АФП и ТФ. Отработаны методы их очистки. Процесс очистки оптимизирован, достигнут высокий выход при высокой степени чистоты белков. Выход ТФР при использовании разработанного метода в пять раз превыша-
ет таковой при использовании методов, описанных в литературе. Изучены такие свойства рецептора ТФ как молекулярная масса, субъединичный состав, константа диссоциации. Проводится работа по получению монокло-нальных антител к ТФР. На ик основе разрабатывается диагностический набор для определения ТФР в сыворотке крови при железодефицитных анемиях и других типах патологии крови.
Выделен, очищен до гомогенного состояния и охарактеризован рецептор АФП. Показано, что АФПР является мембранным белком с молекулярной массой приблизительно 320-380 кДа и имеет несколько субъединиц: 62, 67, 130 и 200 кДа.
На основании иммунологического анализа методом иммуноблоттинга в составе рецептора АФП показано наличие двух АФП-подобных структур, предложена гипотетическая схема строения рецептора.
Разработанные методы и полученные результаты могут быть использованы как для создания тест - систем ранней диагностики онкологических заболеваний, так и для дальнейших исследований особенностей опухолевых процессов на уровне белков клеточной мембраны.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ.
Апробация работы. Материалы работы были доложены на XXII конфе-ренциин IS0BM, September, 18-22, 1994, Groningen, The Netherlands;
International symposium on biology and clinical usefulness of tumor markers, February 8-11, 1995, Barcelona, Spain;
на европейском конгрессе по клинической химии, Tampere, Finland, 2-7 July, 1995;
на XXIII конференции IS0BM, September 10-13, 1995, Montreal, Canada;
на XVI конгрессе по клинической химии, London UK, 8-12 July, 1996.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из вве
дения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов иссле
дований и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего