Введение к работе
Актуальность проблемы Сисртынание кропи представляет собой защитную реакцию организма, накрапленую па прекращение кровотечения при повреждении сосудов. Многие внутренние заболевания сопровождаются нарушениями различных звеньев системы свертывания крови. Новым и перспективным направлением в диагностике и терапии подобных заболевании является диагностическое н терапевтическое применение препаратов геиокоагулнрующих ферментов из ядов змей. В змеиных ядах содержатся ферменты влияющие на различные звенья системы гемостаза: активирующие фибриноген, протромбин, факторы свертывания VIII, X, XII. XIII, Протеин С, индуцирующие фнбршюлнэ и агрегацию тромбоцитов. Подобные ферменты часто обладают специфичностью, отличной о г специфичности факторов свертывания, в результате чего активация системы свертывания происходит необычным путем. При этом образуются производные, нс встречающиеся при активации естественными актива юрами, что делает такие ферменты чрезвычайно ценным инструментом для исследовательской работы и медицинской диагностики. Например, только при помощи гемокоагулируюших ферментов из ядов змей можно получить такие производные, как фибрии-дезІЗВ, Мезотромбші, Претромбіш 1 и др. В настоящее время ряд зарубежных фирм выпускает диагностические и лекарственные препараты на основе гемокоагулируюших ферментов из яда некоторых тропических видов змей под различными коммерческими названиями: "Арвин", "Атрокснн", "Рептилаза", "Дефнбраза", "Экарии", "Сгепвеи" и др. В пашей up.iiie подобные препараты не производятся, а широкий импорт, несмотря па большую потребность, невозможен, ввиду ограниченности валютных средств. К тому же, аналогичные ферменты могут содержатся и в ядах отечественных змей, однако они изучены недостаточно.
В связи с вышеиЗложепым и возникла необходимость в разработке диагностических и лекарственных препаратов на основе гемокоагулируюших ферментов из яда Змей отечесі венной фауны для нсследояаіельскнх и медицинских целей.
Целью данной работы являлось исследование гемокоагулируюших ферментов из ядов отечественных видов змей, а именно, п-специфичных тромбипоподобных ферментов (а-ТИФ) и ферментов - актіїваюро» проіромбина. Были поставлены следующие задачи:
- нсследоваїь яды некоторых отечественных видов змей для тою, чтобы определить лучший источник для выделения коагулирующих ферменте» Й препаративных количествах:
- выделить эти фермент, охарактеризовать их и сравнить с уже существующими коммерческими препаратні;
- разработать па основе выделенных ферментов ряд нових диагностических
тестов.
Научна^ новизна,
Исследованы яды 4-х видов змей рода Щитомордник (Agklstrodon). В ядах щитомордников Обыкновенного (A.halys halys ), Каменистого (A. saxatilis ) и Водяного (A.plsclvorus plscivorus ) обнаружены ранее не описание а-специфичиые тромбинонодобные ферменты (ТПФ), а в яде щитомордника Восточного (A.h.BlomhoJJu'). кроме известного раиее.ио Не охарактеризовапог о а-специфичпого ТПФ, обнаружен также ранее не описаний р-снецифичпый ТПФ.
Разработан метод выделения ТПФ Из яда змей рода Agklstrodon путем аффинной хроматографии На агарозе с иммобилизованным красителем нибакроп голубой КЗОА и выделены В гомогенное состоянии a-специфичные ТПФ из ядов щитомордников Обыкновенного (AAhdlys) И восточного (A-h-BlomhaJJU), названые нами АнцистроИ-Н и А/іцястрон-8, соответственно. Из яда среднеазиатской эфы песчаной или многочешуйчатой (Ec/Us caHtidtus multisquamatus ) выделен ранее не описаний фермент - активатор протромбина, названный нами Экамулином
Исследованы физико-химические и биологические свойства выделенных ферментов, изучены особенности Их строения, субстратная специфичность и кинетика ферментативной активности.
Проведений сравнение выделенных ферментов с известными препаратами гемокоагулирующнх ферментов из яда тропических видов змей. Показано, что Анцистрон-Н является аналогом Арвина (Анкрода) - ТПФ из яда малайского щитомордника, применяющегося за рубежом для дефибрипнрующей терапии. Лпцнстрон-В является аналогом Рептилазы (Атроксина) - диагностического препарата па основе ТПФ из яда южного мокассинового щитомордника Bothrops atrox. Экамулнн, обладая сходным действием на протромбин с Экарином -активатором протромбина из яда афро-азиатской пилочешуйчатой эфы [E.carlnatus ), резко отличается от него По ряду физико-химических свойств.
На основе выделенных ТПФ разработан новый диагностический тест для определения уровня фибриногена в Гепаринизировапной плазме крови. На основе Экому лина создан коагуляциоїший диагностический тест для определения общего уромія протромбина.
Теоретическое и практическое значение работы. Получение результаты расширяют представления о биохимии змеиных ядов. Выделенные и охарактеризованные гемокоагулируюаню ферменты могут быть использованы для создания препаратов для диагностики и коррекции нарушений системы свертывания крови. Данные препараты могут применятся как в стандартных диагностических к терапевтических методиках, разработанных для зарубежных препаратов, так и в iioniJX. предложенных и настоящей работе.
Апробация рабдты. Материалы диссертации были доложены на Всесоюзної! конференции "Методы получения и анализа биохимических реактивов" (Рига, 1987) и па конкурсе Совета молодих ученых Института биохимии им. А.В.Палладипа АН Украины (Киев, 1990).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатных работы.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена па 136 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав обзора литературы, описания материалоп и методов исследования, результатов и обсуждения, изложенных в трех главах, заключения, выводов и списка основной использованной литера і уры (263 источника). Работа Иллюстрирована 21 рисунком и 9 таблицами.