Введение к работе
Актуальность проблемы. Механизмы передачи информации в живых
системах основаны на едином принципе. Взаимодействие сигнала с рецептором приводит к конформационнои перестройке и изменение функции мембранных белков-посредников, а результатом этого является биохимическая модификация молекул-эффекторов, через которые формируется ответ биологической системы. GTP связывающим белкам (G-белкам) в этой цепи принадлежит роль посредников в осуществлении контактов между рецепторами и эффекторными системами
Известно несколько.типов G-белков различающихся функционально и
достаточно хорошо изученных. GTP-евяэывающив белки имеют олпг
омерную структуру типа а/Эу. Список членов семейства быстро
увеличивается и на данный момент в нем различают двенадцать
вариантов а-субъединиц, четыре варианта 0-субъединиц и не менее
трех вариантов у-субъединиц. Высокая степень гомологии
а-субъединиц, в основном, определяющих функциональную индиви дуальность G-белков, требует разработки высокочувствительных и специфичных методов их определения в клетках и тканях, к которым относятся иммунохимические методы.
G -белок, составляющий около 2% всех белков плазматических мембран мозга, также относится к семейству GTP-связывающих белков. Функции этого белка в настоящее время четко не определены. В частности, одни исследователи считают, что G -белок принимает
участие в регуляции К -каналов в клетках ЦНС, другие показывают на
„ 2+ его участие в регуляции потенциал-зависимых Са -каналов.
В последнее время в литературе появились данные о том, что
G -белок может взаимодействовать с цитоскелетом, что играет
определенную роль в регуляции трансмембранной передачи гормо
нального сигнала за счет ограничения подвижности белка, Однако этот
процесс не изучен.
Таким образо», использованиег иммунохимическнх подходов на
основе моноклональных антител (МКА), позволяющих идентифицировать
G -белок в нервной ткани, и значительно расширить исследовательские
о возможности, а также изучение способности G-белка взаимо
действовать с элементами цитоскелета, углубляющее представления о
функционированиии G -белка, представляются своевременными и
актуальными.
Цель работы заключалась в изучении взаимодействия Є0-белка
с цитоскелетом с использованием иммунохимическнх методов.
В работе предусматривалось решение следующих задач:
-
отработка Метода выделения высокоочищенного препарата выбелка,
-
изучение свойств, и эпитопной специфичности ИКА tf а-субъединице GQ- белка (G^).
-
изучение участка связывания О с комплексом fit при помощи МКА,
-
исследование взаимодействия 6 -белка с элементами цитоскелета.
5. выявление * белков плазматических мембран мозга, способных
взаимодействовать с а-субъединицей 6 -белка,
. Научная новизна работы. В ходе настоящей работы были
подобраны условия для выделения G -белка за 4 хромотографические
стадии. Изучены свойства МКА, полученных к . G из мозга быка.
Показано, что полученные клоны гибридом секретирупт МКА,
взаимодействующие с различными антигенными участками Goa- МКА клона
1D2 взаимодействуют с N-концевой областью G . Антигенные участки
для МКА клонов 3D9, 1Н6 и 2ЕЗ располагаются в С- концевой области
молекулы. С помощью МКА клона 1Н6 выявлен участок О , принимающий
участие во взаимодействии с комплексом 0г, расположенный в
С-концевой области G
Изучены механизмы, принимающие участие в регуляции
взаимодействия G с цитоскелетом. При исследовании взаимодействия очищенной G с элементами цитоскелета клеток линии MDBK было
установлено, что свободная а-субьединица может непосредственно взаимодействовать с цитоскелетом. Эффективность взаимодействия G с цитоскелетом зависит от типа гуанилового нуклеотида, связанного с а-субъединицей. GDP-Э-З значительно увеличивал сродство G к цитоскелету по сравнению с негидролизуемым аналогом GTP - GppNHp. Ингибирование адсорбции G . наблпдаемое в присутствии АТР, связано с изменением свойств цитоскелета. Негидролизуемый аналог АТР, АррННр, подобным действием не обладал, что указывает на участие в этом процессе фосфотрансфераэных реакций. Действие АТР может быть в значительной мере обращено путем активации протеинкиназы С форболмиристатацетатом.
Практическое значение работы. Описан метод выделения в -белка, позволяющий получить высокоочшценный препарат белка за 4 хромотографические стадии. Получены культуры гибридомных клеток, продуцирующих МКА к разным эпитопам G . Проведены исследования по изучению взаимодействия G с цитоскелетом. Полученные в работе данные расширяют представления о функционировании G -белка.
Апробация работы. Результаты работы доложены на коллоквиуме проблемной лаборатории "Химии ферментов" биологического факультета МГУ и на совместном коллоквиуме департамента биотехнологии и лаборатории "Иммунобиотехнологии" Всероссийского Научного Центра Молекулярной Диагностики и Лечения.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 работы. '
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения и обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 105 страниц машинописного текста, 4 таблицы и 21 рисунка. Список литературы включает 156 источников.