Влияние желчных кислот на Ca+-зависимую проницаемость внутренней мембраны митохондрий печени крыс Хорошавина Екатерина Игоревна

Введение к работе

Актуальность проблемы. Желчные кислоты представляют собой семейство
амфифильных молекул, имеющих в своем составе гидрофильную

карбоксильную группу и гидрофобное стероидное ядро с различным
количеством гидроксильных групп. Все многообразие желчных кислот,
имеющих свободную (неэтерифицированную) карбоксильную группу,

обусловлено только различным количеством и особенностями расположения гидроксильных групп стероидного ядра (рисунок 1).

Рисунок 1. Структура желчных кислот: литохолевая кислота (ЛХК), дезоксихолевая кислота (ДХК), хенодезоксихолевая кислота (ХДХК), урсодезоксихолевая (УДХК) и холевая кислота (ХК). Общая для всех желчных кислот гидроксильная группа – в -положении. Под рисунком в таблице указаны заместители и их положение ( или ) по отношению к плоскости стероидного ядра.

Литохолевая (ЛХК), дезоксихолевая (ДХК) и хенодезоксихолевая (ХДХК) кислоты являются гидрофобными и практически нерастворимыми в воде, в то время как урсодезоксихолевая (УДХК) и холевая (ХК) значительно более гидрофильны и растворимы в воде (Armstrong and Carey, 1982; Hofmann and Roda, 1984; Roda et al., 1994).

Гидрофобные желчные кислоты, как первичная ХДХК, так и вторичные ЛХК и ДХК, обладают выраженной цитотоксичностью (Woolbright et al., 2014; Zeng et al., 2016). При этом ЛХК избирательно вызывает гибель клеток некоторых злокачественных новообразований (Gafar et al., 2016; Luu et al., 2018). В отличие от других желчных кислот гидрофильная УДХК применяется как лекарственное средство при лечении болезней печени и некоторых других заболеваний (Purohit and Cappell, 2015; Mortiboys et al., 2013; 2015).

Ранее в опытах на изолированных митохондриях печени было показано, что в присутствии Ca²⁺ желчные кислоты способны индуцировать открытие митохондриальной поры, и этот эффект устраняется циклоспорином А (ЦсА), известным ингибитором такой поры (Rolo et al., 2000, 2001). Предполагается, что этот феномен лежит в основе токсического действия желчных кислот. Следует отметить, что эффекты желчных кислот, связанные с индукцией поры

в изолированных митохондриях, были установлены при условии, что в среде инкубации присутствует неорганический фосфат (Ф_н) (Rolo et al., 2000, 2001). Как известно, Ф_н повышает чувствительность митохондрий к Са²⁺ как к индуктору поры и в то же время усиливает эффект ЦсА как блокатора поры (Varanyuwatana and Halestrap, 2012). В связи с этим не ясно, способны ли сами желчные кислоты индуцировать открытие митохондриальной поры или же их действие связано с модуляцией эффектов Ф_н. Кроме того, не известно, способны ли желчные кислоты индуцировать ЦсА нечувствительную неспецифическую проницаемость внутренней мембраны митохондрий, как это свойственно другим амфифильным соединениям – моно- и дикарбоновым жирным кислотам (Mironova et al., 2004; Dubinin et al., 2014), а также модулировать другие системы Ca²⁺-зависимой проницаемости внутренней мембраны органелл. Так ранее было показано, что многие желчные кислоты способны переносить Ca²⁺ через искусственные и природные мембраны, т.е. проявлять свойства кальциевых ионофоров (Abramson and Shamoo, 1979; Anwer et al., 1989). Неизвестно, способны ли они оказывать подобное действие и на мембраны митохондрий. Кроме того, в целом остается невыясненной связь между эффектами различных желчных кислот на митохондрии и их молекулярной структурой.

Цель работы - исследовать действие желчных кислот как модуляторов Са²⁺-зависимой проницаемости внутренней мембраны митохондрий печени при различных экспериментальных условиях. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Рассмотреть эффекты различных желчных кислот: литохолевой,
дезоксихолевой, хенодезоксихолевой, холевой и урсодезоксихолевой как
индукторов Са²⁺-зависимой ЦсА-чувствительной неспецифической
пермеабилизации внутренней мембраны митохондрий печени в отсутствие Ф_н.

2. Оценить влияние желчных кислот на трансмембранный транспорт Ca²⁺ в
энергизованных митохондриях печени.

3. Исследовать особенности действия на митохондрии печени
урсодезоксихолевой кислоты как наиболее гидрофильной желчной кислоты,
обладающей терапевтическим потенциалом.

4. Выяснить способность указанных желчных кислот индуцировать выход Ca²⁺
из матрикса деэнергизованных митохондрий печени в отсутствии повреждения
внутренней мембраны.

5. Оценить роль выхода Ca²⁺ из матрикса митохондрий печени,
индуцированного желчными кислотами, в снижении эффективности их
действия как индукторов Ca²⁺-зависимой проницаемости в митохондриях.

Научная новизна. Впервые установлено, что действие гидрофобных желчных кислот: литохолевой, дезоксихолевой, хенодезоксихолевой и гидрофильной холевой кислоты как индукторов Са²⁺-зависимой ЦсА-чувствительной митохондриальной поры не связано с модуляцией эффектов Ф_н. Выяснено, что обладающая терапевтическим потенциалом урсодезоксихолевая кислота, в отличие от этих желчных кислот, способна индуцировать в митохондриях печени Са²⁺-зависимую ЦсА-нечувствительную проницаемость внутренней мембраны. Такая индуцируемая урсодезоксихолевой кислотой проницаемость митохондрий наблюдается только в присутствии в среде инкубации хлорида калия и блокируется Ф_н. Впервые показано, что изучаемые желчные кислоты способны индуцировать выход Ca²⁺ из матрикса деэнергизованных митохондрий печени, который не связан с повреждением желчными кислотами внутренней мембраны митохондрий, так как сопровождается генерацией – формированием диффузионного потенциала. Выяснено, что индуцированный желчными кислотами (хенодезоксихолевой и урсодезоксихолевой) выход Ca²⁺ из матрикса митохондрий печени при подавлении активности кальциевого унипорта рутениевым красным приводит к снижению эффективности их действия как индукторов Ca²⁺-зависимой проницаемости в митохондриях.

Научно-практическая значимость. Полученные при выполнении диссертационной работы научные результаты имеют, прежде всего, фундаментальное значение для биологической науки. Они расширяют и углубляют представление о механизмах функционирования и регуляции транспортных систем митохондрий в норме и в условиях патологий. Результаты диссертационного исследования могут быть использованы в фундаментальных исследованиях в области биохимии, биоэнергетики, биофизики, клеточной патофизиологии и экспериментальной медицины, поскольку в настоящее время убедительно доказано участие систем транспорта Ca²⁺, K⁺ и других ионов в широком ряде патофизиологических процессов, например, ишемические явления, диабет, нейродегенеративные патологии и другие. Кроме того, известно, что уровень желчных кислот в клетках печени значительно повышается при холестатических заболеваниях этого органа.

Положения, выносимые на защиту:

1. Действие желчных кислот: литохолевой, дезоксихолевой, хенодезоксихолевой и холевой как индукторов Ca²⁺-зависимой ЦсА-чувствительной поры в митохондриях печени не связано с модуляцией эффектов Ф_н.

2. Обладающая терапевтическим потенциалом урсодезоксихолевая кислота способна инициировать во внутренней мембране митохондрий печени Ca²⁺-

зависимую пермеабилизацию по ЦсА-нечувствительному типу, которая связана с активацией транспорта К⁺ в матрикс.

3. В условиях деэнергизации митохондрий печени желчные кислоты способны индуцировать выход Ca²⁺ из матрикса органелл, что может рассматриваться как один из факторов, снижающих эффективность их действия как индукторов Ca²⁺-зависимой пермеабилизации внутренней мембраны митохондрий.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были
доложены на 40-м Конгрессе федерации европейских биохимических обществ
(Берлин, 2015 г.); на международной конференции «Рецепция и

внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2017 г.); на 17-ой и 18-ой международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино, 2013, 2014 г.); V международной научной конференции «Принципы и способы сохранения биоразнообразия» (Йошкар-Ола, 2013 г.); 69-ой и 70-ой Всероссийской школе-конференции молодых ученых «Биосистемы: организация, поведение, управление» (Нижний Новгород, 2016, 2017).

Финансовая поддержка работы. Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ (№14-04-00688-а; 16-34-00435-мол_а) и гранта Марийского государственного университета (2015-006б).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 4 статьи в ведущих научных журналах, рекомендованных ВАК, и 8 тезисов докладов всероссийских и международных научных конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения,
обзора литературы, описания методов исследования, результатов исследования
и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы.
Работа изложена на 101 странице, включая список литературы,