Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1 Природные и синтетические полимеры как объекты и инструменты в биологических исследованиях 13
1.1.1 Применение амфифильных полимеров в качестве эффекторов биологических компонентов 13
1.1.2 Создание аналогов биомакромолекул и тканей на основе полимеров 18
1.2 Полимерные системы доставки препаратов нуклеиновых кислот 24
1.2.1 Характеристика геннотерапевтических препаратов 24
1.2.2 Характеристика полимерных переносчиков 31
1.2.2.1 Природные и полусинтетические поликатионы 31
1.2.2.2 Синтетические поликатионы 35
1.2.2.3 Полимеры на основе аминокислот 40
1.2.2.3.1 Полиаспарагиновая кислота и ее производные 44
1.3 Механизмы транспорта макромолекул в клетки млекопитающих 50
1.4 Биосовместимые свойства синтетических полимеров in vitro и in vivo 58
1.5 Заключение по обзору литературы 67
Глава 2. Материалы и методы 69
2.1 Получение и физико-химическая характеристика полимеров 69
2.1.1 Синтез модифицированных ПЭИ 69
2.1.2. Синтез катионных производных ПАСП 69
2.1.3 Физико-химическая характеристика полимеров 70
2.2 Исследование взаимодействия поликатионов с плазмидной ДНК 71
2.2.1 Выделение и характеристика плазмидной ДНК 71
2.2.2 Электрофоретический анализ комплексов плазмидной ДНК 72
2.2.3 Оценка устойчивости плазмидной ДНК в составе полиплексов к действию ДНКазы I 73
2.2.4 Анализ комплексов методом динамического рассеяния света 73
2.3 In vitro исследование поликатионов 74
2.3.1 Выделение и культивирование клеток человека 74
2.3.2 Изучение цитотоксических эффектов поликатионов 75
2.3.3 Оценка мембраноповреждающего действия поликатионов 76
2.3.4 Трансфекция клеток НЕК293 с использованием поликатионов 76
2.3.5 Анализ эффективности трансфекции клеток 77
2.4 In vivo исследование поликатионов 77
2.4.1 In vivo исследование трансфекционной активности DMAP100 77
2.4.2 Гистологический анализ обработанных тканей 78
2.5 Математическая обработка данных 78
Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение 80
3.1 Структура и свойства модифицированных ПЭИ 80
3.1.1 Структура ПЭИ с разной степенью оксипропилирования 80
3.1.2 Гемолитическая и цитотоксическая активность модифицированных ПЭИ 83
3.1.3 Взаимодействие модифицированных ПЭИ с плазмидной ДНК 87
3.1.4 Трансфекционная активность модифицированных ПЭИ 92
3.2 Структура и свойства катионных производных ПАСП 95
3.2.1 Характеристика производных ПАСП с различными заместителями 95
3.2.2 Влияние структуры катионных ПАА на цитотоксическую и гемолитическую активность 100
3.2.3 Связывание и конденсация плазмидной ДНК катионными ПАА 105
3.2.4 Проверка устойчивости плазмидной ДНК в составе полиплексов к действию ДНКазы I 109
3.2.5 Трансфекционная активность катионных ПАА 111
3.3 Получение и исследование биодоступности катионного ПАА с оптимизированной структурой 114
3.3.1 Характеристика ПАА на основе производного диаминопропана 114
3.3.2 Трансфекционная активность DMAP100 и роль агрегационной устойчивости полиплексов 117
3.3.3 Эффекты DМAP100 и его комплексов с pC4W-GL3 при подкожной инъекции мышам 122
Заключение 126
Выводы 128
Список сокращений и условных обозначений 130
Список литературы 132
Благодарности 158
- Создание аналогов биомакромолекул и тканей на основе полимеров
- Биосовместимые свойства синтетических полимеров in vitro и in vivo
- Взаимодействие модифицированных ПЭИ с плазмидной ДНК
- Трансфекционная активность DMAP100 и роль агрегационной устойчивости полиплексов
Создание аналогов биомакромолекул и тканей на основе полимеров
Синтетические биополимеры, в частности синтетические пептиды и НК, находят широкое применение в молекулярной биологии, медицине и биохимии в качестве моделей биомакромолекул, биоактивных и биораспознающих компонентов. Искусственно получаемые аналоги биомакромолекул являются важными инструментами в биологических исследованиях, а также потенциальными лекарственными препаратами (Morimoto et al., 2008). Подобные аналоги являются копией природной макромолекулы, например, пептида или небольшого белка, или ее отдельного биологически значимого участка (биоактивного, биораспознающего). Большинство создаваемых аналогов биомакромолекул представлены соединениями полипептидной природы, т.к. пептиды и белки характеризуются особенным структурным и функциональным разнообразием. Другими важными представителями являются полинуклеотиды, которые обеспечивают передачу наследственной информации в клетке, биосинтез кодируемого ими функционального белка или регулируют экспрессию гена (Hughes, Ellington, 2017).
С использованием методов биоорганической химии могут быть рутинно получены полипептиды и полинуклеотиды с заданной первичной структурой и проведена их дополнительная модификации. Благодаря современным достижениям в области молекулярной инженерии и программирования активно развиваются подходы к конструированию пептидных мотивов, т.е. минимальных пептидных последовательностей, выполняющих определенную биологическую функцию. Подобные последовательности, которые ранее выделяли из природных белков, в настоящее время могут быть созданы искусственно с использованием систем эволюции in vitro (н-р, пептидные аптамеры). Основываясь на взаимосвязи между структурой мотивов и их теоретически установленной активностью, появилась возможность рационально конструировать белки с заданными свойствами посредством встраивания различных биоактивных мотивов в полипептиды. Подобные искусственно получаемые полифункциональные белки имеют несомненный потенциал для медицинской диагностики и лечения заболеваний, в бионанотехнологии, а также в различных областях фундаментальной науки (Shiba et al., 2010).
Искусственно создаваемые (поли)пептиды являются многообещающей платформой для создания на их основе инновационных лекарственных средств с различными видами биологической активности. Преимуществом пептидных терапевтических препаратов перед органическими молекулами является повышенная безопасность вследствие низких побочных эффектов и уровня накопления в тканях, а также повышенная специфическая активность и избирательность действия. Перед высокомолекулярными препаратами преимуществом пептидов также являются повышенная физико-химическая стабильность и биодоступность (Gupta et al., 2005; Hu et al., 2016).
В зависимости от необходимой молекулярной массы терапевтического пептида используются различные способы их получения: химический синтез, технология рекомбинантной ДНК, бесклеточная система синтеза (биосинтез белка in vitro), трансгенные животные и растения или ферментативный синтез (Vlieghe et al., 2010). Однако в случае производства пептидов размером, приблизительно, от 5 до 50 аминокислотных остатков предпочтительно использовать химический синтез, в частности, технологию твердофазного пептидного синтеза, позволяющую производить пептидные препараты в промышленных масштабах (Mitchell, 2008).
Традиционно поиск терапевтических пептидов проводят, в основном, из трех источников: природных/биоактивных пептидов/белков, продуцируемых растениями и животными (пептидные гормоны или фрагменты более крупных белков); пептидов, выделенных из генетических или рекомбинантных библиотек; химической библиотеки пептидов (Sato et al., 2006). В отличие от рекомбинантной технологии получения производных пептидов более широкое их структурное разнообразие достигается в процессе химического синтеза с использованием как природных/протеиногенных аминокислот, так и неприродных аминокислот, их аналогов и путем создания псевдо-пептидных связей. Большинство находящихся на рынке пептидных продуктов и гомологичных соединений (белки и антитела) являются пептидными гормонами (например, эритропоэтин, инсулин) или производными пептидов, имитирующими действие гормонов. Пептидные молекулы активно исследуются в качестве агонистов или антагонистов мишеней, сопряженных с воспалительными процессами или опухолевой трансформацией, а также в качестве антибиотиков или ингибиторов ферментов. В обзоре Vlieghe с соавторами обобщена информация о синтетических терапевтических пептидах, которые коммерчески доступны в качестве лекарственных средств (Vlieghe et al., 2010). В целом, современные стратегии синтеза терапевтических пептидов направлены на повышение производительности, снижение скорости их биодеградации и иммуногенности, а также на поиск новых путей введения в организм, включая использование полимерных систем доставки.
Наряду с созданием аналогов биомакромолекул, искусственные полимеры имеют значительный потенциал в качестве структурной основы биосовместимых и тканезамещающих материалов, используемых в качестве аналогов живых тканей организма (Lutolf, Hubbell, 2005; Dhandayuthapani et al., 2011; Asghari et al., 2017). Существует значительная потребность в подобных материалах в связи с распространением травматических и дегенеративных повреждений органов и тканей. Первичные требования, предъявляемые к этим материалам, включают их высокую биосовместимость/инертность, возможность эффективного заполнения тканевого дефекта и необходимая механическая поддержка. В последние годы основной интерес уделяется созданию биологически активных материалов, имитирующих структуру живых тканей, способных служить матриксом для роста и дифференцировки клеток in vitro и in vivo, а также стимулирующих регенерацию и замещение поврежденной ткани. Подобные тканеинженерные материалы, как правило, должны быть биодеградируемыми (Gunatillake, Adhikari, 2003). В целом, тканевая инженерия является одним из наиболее динамично развивающихся направлений, активно использующих современные достижения наук о материалах, биохимии, полимерной химии и клеточной биологии.
Природные и синтетические полимеры являются основным компонентом тканеинженерных материалов, формирующим биосовместимый матрикс с необходимой структурой и физико-химическими свойствами. При этом синтетические полимеры обеспечивают лучший контроль над химическим составом и механическими свойствами материала, тогда как природные полимеры могут вызывать биологические стимулы и регулировать отклики клеток млекопитающих. Для усиления регенеративных свойств материалы модифицируют биологически активными органическими и/или неорганическими компонентами, в том числе биомакромолекулами и их фрагментами (Хенч, Джонс, 2007). Имеются мнения, что материалы на основе одного компонента не могут соответствовать всем предъявляемым к тканеинженерным материалам требованиям. Перспективнее является создание и применение материалов из нескольких компонентов, получаемых из синтетических и природных полимеров, которые обладают лучшей терапевтической эффективностью в регенерации повреждений мягких и твердых тканей (Sheikholeslam et al., 2017). При создании имплантируемых биоматериалов, в их числе, шовные материалы, материалы для замещения дефектов опорно-двигательной системы и средств доставки лекарств предпочтительно использовать синтетические биодеградируемые полимеры. Среди них наиболее популярными являются алифатические сложные полиэфиры и поли(гидроксикислоты), такие как поли(-капролактон) (ПКЛ), ПМК (полилактид), поли(гликолевая кислота) (полигликолид, ПГК). Эти полимеры одобрены FDA для клинического применения поскольку, наряду с биосовместимыми свойствами, они характеризуются оптимальными периодами биодеградации, механическими свойствами; при этом продукты их биодеградации и метаболизации также являются мало- или нетоксичными (Ohya et al., 2012). ПМК и ПГК, а также их сополимеры наиболее изучены с точки зрения получения, резорбции и поведения in vivo (Билибин, Зорин, 2006).
Биосовместимые свойства синтетических полимеров in vitro и in vivo
Одним из важнейших этапов создания веществ и материалов для биомедицинских приложений является характеристика их токсических свойств, к которым относятся любые неспецифические побочные проявления, вызывающие повреждающий эффект в отношении живых клеток, тканей и органов. Для подобной характеристики полимерных систем и биоматериалов также широко используется термин “биосовместимость”. На посвященной этому вопросу конференции Европейского общества по биоматериалам в 1986 году термин “биосовместимость” получил определение как способность материала осуществлять свою специфическую функцию при приемлемом отклике со стороны организма (Williams, 1989; Duncan, Izzo, 2005). Это достаточно гибкое определение подчеркивает актуальность соотнесения биосовместимых свойств конкретного материала с его практическим применением. Схема, иллюстрирующая основные этапы оценки биосовместимости/токсичности полимерных материалов, показана на рис. 3.
В качестве общих рекомендаций, полимеры медицинского назначения, включая, переносчики БАВ и тканеинженерные материалы, должны иметь возможность для парентерального применения, быть нетоксичными и неиммуногенными. Они должны быть локализованы в организм посредством местного введения или аккумулироваться в определенных местах, вне органов и тканей, где возможно проявление токсичности. К настоящему времени разработан ряд in vitro и in vivo методов для рутинного исследования полимерных систем. Среди них наиболее популярными являются тесты на цитотоксичность, например, МТТ-тест (Bank et al., 1991; Mihai et al., 2011) или тест на активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ) (Itaka et al., 2010;), а также тест на гемолитическую активность (Sovadinova et al., 2011; Jeswani et al., 2015), в которых декстран (ММ 70 кДа) и ПЭИ/пЛиз используются в качестве негативного и позитивных контролей, соответственно (Duncan, Izzo, 2005; Lv et al., 2006).
Первичный скрининг полимеров для парентерального применения также должен включать оценку антигенности (продукции IgG, IgM) и клеточной иммуногенности (индукция цитокинов и хемокинов). Известно, что повторное парентеральное назначения чужеродного макромолекулярного БАВ вызывает образование антител и может приводить к анафилактическому шоку. В дополнение, неиммуногенные переносчики могут выступать гаптенами при взаимодействии с лекарственными молекулами, пептидами или углеводами. Высокая иммунногенность, как правило, исключает возможность большинства применений полимерной системы in vivo. В организме человека низкомолекулярные системы характеризуются быстрой почечной экскрецией; заряженные полимеры (катионные и анионные) подвергаются быстрой метаболизации и элиминации в печени. Гидрофильные полимеры, в том числе, пегилированные макромолекулы избегают быстрого выведения из организма (Duncan, Izzo, 2005; Clem, 2011).
Неспецифическая токсичность полимеров, как правило обусловлена присутствием в них катионных и гидрофобных компонентов и функциональных групп, которые, одновременно, придают полимерам мембранотропное и мембрановреждающее действие. Гидрофильные и анионные группы, напротив, придают полимерам инертность в отношении биологических компонентов, в том числе, клеточной поверхности. При этом, как было отмечено выше, аффинность макромолекул к клеточным мембранам является одним из факторов, повышающих эффективность внутриклеточной интернализации и высвобождения из лизосом (Ben-Dov et al., 2013). Таким образом, терапевтическая эффективность катионных/амфифильных полимеров должна определяться балансом мембранотропных и цитотоксических свойств в аспекте конкретного медицинского применения.
Относительно переносчиков геннотерапевтических препаратов на основе поликатионов их биосовместимость зависит от таких факторов, как ММ, тип катионной функции и плотность заряда, структура и последовательность (блочная, статистическая, линейная, разветвленная), а также конформационная гибкость (Gunatillake, Adhikari, 2003; Aied et al., 2013; Asghari et al., 2017).
Активность полимера понижается с повышением расстояния между реакционноспособными аминогруппами в первичной структуре.
Пространственная организация положительно заряженного компонента зависит от трехмерной структуры и гибкости макромолекулы, что влияет на доступность заряженных групп для поверхности клеток. Показано, что разветвленные полимеры более эффективно воздействуют на физико-химические параметры клеточных мембран, чем глобулярные и линейные. Поэтому, сильно катионные полимеры с подвижным остовом проявляют более выраженные цитотоксические эффекты по сравнению с аналогичными полимерами с меньшей плотностью заряда (Fox et al., 2009).
Подобные зависимости были, в частности, установлены при сравнении свойств дендримера ПАМАМ, а также сывороточного альбумина человека (с глобулярной структурой) и полимеров DADMAC (полидиаллилдиметиламмония хлорид), пЛиз, ПЭИ (с гибкой линейной/разветвленной структурой). Плотность заряда этих катионных макромолекул, определяемая как отношение числа катионных центров к мономерным единицам, коррелировала с их цитотоксическими эффектами (Fischer et al., 2003).
Как отмечается в работе (Fischer et al., 2001) взаимодействие катионных полимеров с компонентами мембран, в их числе, фосфолипидами, белками и гликопротеинами, сопровождается нарушением структуры и функциональной активности мембран. Согласно данным ЛДГ и МТТ-тестов опосредованное поликатионами повышение проницаемости плазматической мембраны клеток для высокомолекулярных соединений предшествует понижению метаболической активности клеток. В качестве позитивного контроля в работе использовали селективный индуктор апоптоза стауроспорин (ингибитор протеинкиназы С), который вызывал типичные изменения в клетках карциномы надпочечников (SW 13) (уменьшение размера ядра и его фрагментацию, конденсацию хроматина) и клеточную гибель, предотвращаемую ингибитором каспаз; при этом плазматическая мембрана клеток оставалась интактной. В отличие от стауроспорина ПЭИ (800 кДа, концентрация 0.06 мг/мл) и его комплексы с ДНК характеризовались некротическим действием, проявляющимся в ранней проницаемости мембраны без выраженного изменения морфологии ядра. В дополнении, опосредованная ПЭИ гибель клеток не уменьшалась в присутствии ингибитора каспаз (Fischer et al., 2001).
В работе Fischer с соавторами проведено сравнительное исследование влияния ряда синтетических поликатионов на метаболическую активность мышиных фибробластов (L929) с помощью МТТ-теста и гемолитической активности на эритроцитах человека. Все полимеры ингибировали жизнеспособность клеток пропорционально концентрации и времени экспозиции. Установлено, что цитотоксичность полимеров варьируется в ряду: ПЭИ = пЛиз полидиаллилдиметиламмония хлорид диэтиламиноэтилдекстран поливинилпиридин бромид ПАМАМ (дендример типа “Starburst”) катионизированный альбумин нативный альбумин. У всех полимеров наблюдалась прямо пропорциональная зависимость влияния концентрации вещества (от 0 до 10 мг/мл) от времени инкубации (3, 12, 24 ч) на метаболическую активность (Fischer et al., 2003).
Токсические эффекты in vitro, обусловленные ПЭИ-опосредованной трансфекцией, могут быть дифференцированы на острую цитотоксичность, связанную с прямым действием молекул ПЭИ, и отложенную цитотоксичность, наблюдаемую для полиплексов ПЭИ/ДНК. После комплексообразования с ДНК, острая цитотоксичность ПЭИ уменьшается (Godbey et al., 2001); отложенная токсичность полиплексов коррелирует со скоростью высвобождения ДНК (Godbey et al., 1999). Показано, что введение несвязанного ПЭИ с циркуляторное русло, сопровождается взаимодействием поликатиона с отрицательно заряженными белками сыворотки (н-р, альбумин) и эритроцитами, а также преципитацией комплексов в виде больших кластеров, адгезированных на поверхности клеток. В условиях in vitro ПЭИ дестабилизирует клеточные компоненты, приводя к уменьшению размера клеток, уменьшению числа митоточески активных клеток и вакуолизации цитоплазмы (Godbey et al., 2001; Zhong et al., 2013).
Взаимодействие модифицированных ПЭИ с плазмидной ДНК
Исследовано образование электростатических комплексов поликатионов с модельной плазмидой pEGFP-N2. Электрофоретическим методом определены минимальные концентрации полимеров в серии двукратных разведений, полностью связывающие суперскрученную пДНК (10 мкг/мл) в растворе. Соответствующие ДНК-связывающие концентрации полимеров отмечены на электрофореграммах двойной звездочкой (рис. 8). На основании этих концентраций рассчитывали стехиометрию комплексов поликатион/пДНК по массе, а также соответствующий параметр N/P, показывающий молярное соотношение катионных групп (аминогрупп) полимера к анионным (фосфатным) группам ДНК в образующемся комплексе (Zhao et al., 2009).
Исходный ПЭИ и мПЭИ1 связывали пДНК в массовом соотношении 1:1 и соотношении N/P, равном 6 (Таблица 4). Это показывает, что 50%-ная модификация ПЭИ не изменяет комплексообразующей способности поликатиона. Дальнейшая модификация ПЭИ приводила к постепенному увеличению ДНК-связывающих концентраций в 1.5 и 3 раза (N/P = 9 и 18) для мПЭИ2 и мПЭИ3, соответственно, тогда как мПЭИ4 почти не обладал способность взаимодействовать с пДНК (N/P = 600).
Взаимосвязь между степенью модификации ПЭИ и соотношения N/P для комплексов поликатион/пДНК может быть представлена в виде сигмоидальной зависимости (данные не показаны). При этом полумаксимальный ДНК-связывающий эффект (от исходного ПЭИ) следует ожидать для полимера, модифицированного в молярном соотношении ПО/NH между 1 и 2, между 100 и 200% пропиленоксидного компонента.
По данным динамического рассеяния света установлено, что ПЭИ образует с пДНК катионные нано размерные частицы со средним гидродинамическим диаметром (ГД) около 130 нм (Таблица 4). Для модифицированных полимеров мПЭИ1–3 в тех же условиях наблюдалось формирование более крупных наночастиц с ГД от 167 до 288 нм пропорционально степени модификации, при одновременном частичном понижении их дзета-потенциала (с +37.1 до +25.6 мВ) и некотором повышении однородности (уменьшение индекса распределения частиц (ИРЧ) (Таблица 4).
Ранее в работах других авторов показано, что конъюгация ПЭИ с несколькими молекулами ПЭГ (ММ 550 и 5000 Да) незначительно изменяет характеристики комплексов полимера с пДНК (ГД100 нм, N/P=9). Присоединение одной молекулы ПЭГ с ММ 20 кДа приводило к образованию более компактных частиц (ГД70 нм) (Petersen et al., 2002). В то же время модификация ПЭИ десятью остатками ПЭГ с ММ 2 кДа приводила к формированию нано размерных нейтральных комплексов с пДНК (Merdan et al., 2005), что указывает на участие пегилированного компонента в формировании границы раздела полиплекс/раствор.
Полученные нами результаты показывают, что производные ПЭИ, модифицированные монопропиленгликолевыми группами на 50–100%, сохраняют свои катионные свойства и способность электростатически связывать, конденсировать и катионизировать молекулы ДНК. Принимая во внимание значительное уменьшение мембраноповреждающего и цитотоксического эффектов этих полимеров, предложенный способ модификации позволяет эффективно регулировать баланс между биосовместимостью катионных полимеров и их электростатическим комплексообразованием с макромолекулами.
В дополнении исследована способность поликатионов защищать пДНК в составе полиплексов от расщепления ферментами. Комплексы поликатион/пДНК обрабатывали бычьей ДНКазой I и анализировали электрофоретически как описано в разделе (2.2.3). Активность ДНКазы I (0.08 ед./мл) соответствовала физиологическому уровню в крови условно здорового человека (Брызгунова и др., 2008).
В условиях эксперимента “голая” пДНК интенсивно деградировала до недетектируемых продуктов (рис. 9, дорожка 3). После ферментативной обработки комплексов ПЭИ и его производных мПЭИ1–3 (без высвобождения ДНК гепарином) продукты расщепления пДНК не выявлялись (дорожки 5, 8, 11, 14), в отличие от комплексов с мПЭИ4 (дорожка 17). Это показывает, что мПЭИ4 не предотвращает деградации пДНК вследствие его слабых ДНК-связывающих свойств (Таблица 4, рис. 8Д).
Для оценки целостности пДНК, конденсированной поликатионами и подвергшейся воздействию ДНКазы I, комплексы с ПЭИ и мПЭИ1–3 инкубировали с гепарином (линейный полисахарид – полиэлектролит, относящийся к классу кислых гликозаминогликанов, полианионный характер которого обусловлен наличием большого числа отрицательно заряженных групп) (Кондашевская, 2010). Под действием гепарина пДНК высвобождается из комплекса с поликатионом вследствие конкурентного замещения.
Установлено, что среди исследуемых поликатионов наибольшая целостность пДНК сохраняется для мПЭИ2, для которого продукты расщепления пДНК состояли, преимущественно, из неповрежденной суперскрученной и релаксированной (кольцевой) форм пДНК в сходном соотношении (рис. 9, дорожка 12). В тех же условиях продукты расщепления пДНК для комплексов с другими поликатионами характеризовались повышенным количеством релаксированной (кольцевой) и линейной форм пДНК (рис. 9, дорожки 6, 9, 16).
Полученные результаты указывают на возможность регуляции протекторных свойств катионных полимеров при ферментативной деградации путем контролируемого оксипропилирования. Введение в ПЭИ пропиленоксидного компонента в определенном количестве ( 75%) обеспечивает максимальный защитный эффект. По-видимому, эта степень модификация ПЭИ является оптимальной для ингибирования взаимодействия пДНК с белками при сохранении достаточной способности полимера связывать и удерживать пДНК в составе комплекса.
Известно, что сходный защитный эффект достигается посредством пришивки к макромолекулам отдельных гидрофильных молекул, в том числе, ПЭГ (Liu et al., 2016), поли[N-(2-гидроксипропил)метакриламида] (Lammers, Ulbrich, 2010), гидроксиэтилкрахмала (Noga et al., 2013), полисаркозина (pSar) (Du et al., 2015), олигосахаридов (Wang et al., 2001), белков (Kircheis et al., 2001) или пептидной последовательности пролин аланин-серин (Morys et al., 2017). Подобная конъюгация обеспечивает, преимущественно, неспецифическое экранирование поверхности полиплексов гидрофильным компонентом от связывания с белками.
Контролируемое оксипропилирование позволяет делокализовать амфифильный пропиленоксидный компонент, распределив его между аминогруппами полимера. Подобный способ модификации может быть использован для придания полимерной макромолекуле новых физико-химических и биологических свойств.
Трансфекционная активность DMAP100 и роль агрегационной устойчивости полиплексов
Установлено, что оптимизированный DMAP100, аналогично другим катионным ПАА (рис. 11), характеризуется низкой трансфекционной активностью в отношении клеток HEK293 в стандартных условиях (среда DMEM с ЭТС, концентрация пДНК в комплексе 10 мкг/мл, фактор разбавления комплексов в среде 10 раз, время обработки 4 часа с последующим удалением среды с комплексами) (рис. 18А). Обнаружено, что добавление к клеткам раствора полиплекса, предварительно разбавленного бессывороточной средой в 4 раза (при сохранении количества вносимой пДНК), позволяет существенно повысить уровень трансфекции. Для проявления подобной активности клетки культивировали в присутствии полиплексов в течение 48 ч.
По сравнению с комплексами TurboFect/pEGFP-N2, для которых флуоресценция клеток достигала максимума приблизительно через 24 ч, полиплексы на основе DMAP100 характеризовались более низкими нарастанием и интенсивностью флуоресценции клеток (рис. 18Б и В), что можно объяснить замедленным выходом комплексов на основе ПАА из лизосом.
По данным проточной цитофлуориметрии относительное содержание EGFP-позитивных клеток, обработанных комплексами DMAP100/pEGFP-N2, через 48 ч составило около 40.6% (рис. 18Е). Эффективность трансфекции комплексами с TurboFect составила около 81.5%.
В качестве показателя жизнеспособности трансфицируемых клеток HEK293 регистрировали сигнал восстановления индикатора MTS после 72 ч культивирования (рис. 19). Средние значения сигнала составили: для необработанных клеток (контроль) 1.26±0.04, для клеток с плазмидной ДНК 1.24±0.15, для неразбавленных и разбавленных комплексов DМАP100/pEGFP-N2, соответственно, 1.35±0.10 и 1.21±0.14, для TurboFect/pEGFP-N2 0.15±0.01. Результаты показывают, что полиплексы на основе DМAP100 не обладают цитотоксичностью в условиях длительного культивирования с клетами, тогда как полиплексы на основе TurboFect в значительной степени ингибируют жизнеспособность клеток, что, вероятно, обусловлено как мембраноповреждающим действием этого поликатиона, так и вызываемой им интенсивной нефизиологической экспрессией маркерного белка EGFP. Это подтверждает, что, несмотря на меньшую трансфекционную эффективность, преимуществом полиаспаратамида DМAP100 перед высокоактивным трансфекционным агентом является высокая совместимость с клетками млекопитающих.
Выявленная зависимость активности полиплексов на основе ПАА от разбавления и присутствия в среде сыворотки (раздел 3.2.5) указывает на важную роль коллоидной устойчивости в условиях трансфекции. Известно, что белки сыворотки индуцируют агрегацию различных наночастиц (Saptarshi et al., 2013), в том числе, полиплексов (Zou et al., 2009), что сопровождается понижением их эффективной концентрации и доступности для клеток in vitro и in vivo.
Для оценки эффекта белков исследована стабильность комплексов DМAP100/pEGFP-N2 (концентрация компонентов 10 мкг/мл) в присутствии питательной среды с ЭТС и преобладающего белка – бычьего сывороточного альбумина (БСА). В среде с ЭТС анализ методом ДРС оказался невозможным из-за сильного мешающего влияния избытка компонентов сыворотки. Взаимодействие полиплексов с БСА (50 мкг/мл) сопровождалось значительным увеличением размера частиц до 520 нм (рис. 20А) и их перезарядкой до отрицательного значения ж-потенциала –9.2 мВ (рис. 20Б). Это показывает, что даже в пониженной концентрации молекулы БСА адсорбируются на поверхности катионного полиплекса, подавляют его заряд и вызывают частичную агрегацию.
Интенсивность агрегационного процесса зависит от ряда факторов и, прежде всего, от критической концентрации коллоидных частиц. Поэтому добавление полиплексов в концентрации, рекомендуемой к применению in vitro (10 мкг/мл), в среду с сывороткой приводит к их необратимой агрегации и недоступности для клеток, тогда как предварительное разбавление полиплексов способствует поверхностной адсорбции белков сыворотки, которые, в этом случае выступают “защитным коллоидом”, предотвращающим дальнейшую агрегацию частиц (рис. 20В).
Поскольку местная генная терапия in vivo, как правило, требует на порядок более высоких концентраций пДНК, т.е. 100-200 мкг/мл (Smrekar et al., 2003; Xu et al., 2015), нами дополнительно исследована стабильность полиплексов в повышенных концентрациях компонентов. В этом случае получали комплекс DMAP100 с другой плазмидой pC4W-GL3, кодирующей ген люциферазы, т.к. она является более удобной репортерной пДНК для выявления уровня трансфекции в экспериментах in vivo.
Тогда как в обычной концентрации (10 мкг/мл) комплекс DМAP100/pC4W-GL3 был стабилен во времени (рис. 20Г), повышение концентрации компонентов приводило к увеличению размера и постепенной агрегации полиплексов. В максимальной концентрации 125 мкг/мл формирующиеся полиплексы необратимо агрегировали в течение 20 мин инкубации (рис. 20Г). Подобная нестабильность затрудняет применение полученной геннотерапевтической формуляции in vivo.
Обнаружено, что добавление избытка DМAP100 в концентрации 0.5 мг/мл к предварительно полученным полиплексам (125 мкг/мл) предотвращает агрегацию при инкубации (рис. 20Г). По-видимому, растворенные молекулы ПАА блокируют сайты неспецифического взаимодействия на поверхности полиплексов и создают дополнительный положительный заряд, тем самым ингибируя агрегацию коллоидной системы. Отсутствие у DМAP100 цитотоксической активности допускает возможность применения повышенных (миллиграммовых) концентраций полимера в формуляциях пДНК для повышения их стабильности. Кроме того, согласно данным литературы избыток катионного полимера может усиливать эффективность трансфекции клеток комплексами пДНК (Kim et al., 2016; Licciardi et al., 2006).
Также имеются свидетельства о влиянии рН и белков сыворотки на эффективность трансфекции клеток комплексами хитозан/пДНК (ГД=243±12, =+41.4±5.1, ИРЧ=0.39). Показано, что при физиологическом значении рН культуральной среды (рН=7.4) с добавлением сыворотки полиплексы образуют крупные микроразмерные агрегаты, тогда как понижение рН до 6.5 способствует образованию субмикрометровых частиц, обладающих повышенной трансфекционной активностью (Nimesh et al., 2010).