Содержание к диссертации
Введение
1. Метаболизм биогенных аминов 11
1.1. Биосинтез катехоламинов и серотонина 11
1.2. Секреция катехоламинов 14
1.3. Инактивация и обратный захват биогенных аминов 16
1.4. Деградация и везикулярная утечка катехоламинов и серотонина 20
1.5. Биогенные амины в онтогенезе млекопитающих 24
2. Роль биогенных аминов в развитии стресса 31
3. Метаболизм гомоцистеина и его роль в развитии патологических состояний организма 38
3.1. Характеристика серосодержащих аминокислот 38
3.2. Метаболизм гомоцистеина 38
3.3. Содержание и причины повышения уровня гомоцистеина в организме 44
3.4. Использование различных моделей гипергомоцистеинемии 47
3.5. Влияние пренатальной гипергомоцистеинемии на развитие организма 48
3.6. Развитие окислительного стресса при гипергомоцистеинемии 53
4. Влияние гомоцистеина на содержание биогенных аминов 57
Материалы и методы 64
Результаты исследования 81
Обсуждение результатов 113
Заключение 135
Выводы 137
Список литературы 139
- Инактивация и обратный захват биогенных аминов
- Роль биогенных аминов в развитии стресса
- Влияние пренатальной гипергомоцистеинемии на развитие организма
- Влияние гомоцистеина на содержание биогенных аминов
Инактивация и обратный захват биогенных аминов
Биологическая активность моноаминов, высвобождаемых в синаптическую щель, прекращается очень быстро за счет их возврата в синаптические нервные окончания и/или к эффекторным клеткам, а также путем превращения их в неактивные метаболиты.
Процесс захвата катехоламинов из внеклеточной жидкости отличается от внутриклеточного поглощения их гранулами для хранения. Обратный захват катехоламинов нейронами назван «uptake 1» (Eisenhofer, 2001), а поглощение клетками ненейронального происхождения – «uptake 2» (Iversen, 1997).
Uptake 1 служит по меньшей мере для повторного захвата локально высвобожденного или циркулирующего НА и его внутриклеточного хранения с целью повторного использования. Данный процесс требует затрат энергии и участия специального переносчика, который может транспортировать катехоламины против градиента концентрации. Менее важную роль uptake 1 играет в инактивации циркулирующего АД. При воздействии стрессоров интенсивность обратного захвата 1-го типа возрастает параллельно с возрастающим выбросом НА (Eisenhofer et al., 1990а; Eisenhofer et al., 1991a). Около 90% выброшенного НА возвращается обратно в нейроны (Eisenhofer et al., 1989; Eisenhofer et al., 1991b).
Обратный захват катехоламинов нейронами происходит за счет транспортеров НА (NET), ДА (DAT) и 5-ОТ (SERT). Транслокация моноаминов сопровождается переносом ионов Na+: одна молекула субстрата транспортируется вместе с определенным числом неорганических ионов. Транспорту моноаминов способствует градиент энергии, создаваемый движением ионов Na+ внутри клетки и управляемый градиентом концентрации, созданным Na+/K+-АТФазой. В то время как DAT и NET переносят одну молекулу ДА или НА вместе с двумя ионами Na+ и одним ионом Cl-, SERT транспортирует одну молекулу 5-ОТ совместно с одним ионом Na+ и одним ионом Cl- и переносом одного иона K+ в противоположном направлении (Aggarwal, Mortensen, 2017). Однако симпатические нервы не захватывают обратно О-метилированные метаболиты катехоламинов, такие как норметанефрин и 3-метокси-4-гидроксифенилгликоль (Eisenhofer et al., 1990b).
Транспортеры NET, DAT и SERT демонстрируют высокую гомологию и имеют несколько структурных особенностей: 12 -спиральных трансмембранных доменов, связанных гибкими внутриклеточными и внеклеточными петлями с сайтами фосфорилирования и гликозилирования (Eisenhofer, 2001; Aggarwal, Mortensen, 2017). N- и С-концы их молекул лежат во внутриклеточном пространстве. Транспортер АД, который был выделен из симпатических ганглиев лягушки (Apparsundaram et al., 1997), гомологичен NET и DAT, но транслоцирует АД эффективнее чем НА и ДА. Однако у млекопитающих транспортер АД все еще не идентифицирован.
В головном мозге TH и DAT являются характерными маркерами для дофаминергических нейронов. Хотя DAT экспрессируется главным образом в дофаминергических клетках мозга, экспрессия NET и DAT не ограничена центральными и периферическими норадреналинергическими нейронами (Eisenhofer, 2001). Обратный захват НА посредствам NET имеет место и в других типах клеток: хромаффинных клетках надпочечников, в легких, в плаценте. Экспрессия DAT также обнаружена в желудочно-кишечном тракте и почках (Eisenhofer, 2001). Помимо ЦНС SERT обнаруживается на многих периферических участках, включая желудочно-кишечный тракт, легкие, плаценту, тромбоциты и лимфоциты крови, а также хромаффинные клетки надпочечников (Ramamoorthy et al., 2011; Brindley et al., 2017). В последних SERT широко экспрессируется и колокализуется с PNMT и выполняет функцию модуляции секреции АД (Brindley et al., 2017).
Экстраневральный транспортер моноаминов, осуществляющий uptake 2 имеет низкое сродство (выше Km) и специфичность для катехоламинов (Iversen, 1997). Данный транспортер моноаминов захватывает преимущественно АД и не является Na2+- и Cl- -зависимым (Eisenhofer, 2001; Goldstein, 2001). Экстраневральный транспортер моноаминов отвечает за образование метаболитов катехоламинов в печени, почках и легких, чувствителен к ингибированию О-метилированными метаболитами катехоламинов (норметанефрином и метанефрином) и кортикостероидами (Kvetnansky et al., 2009).
Варикозные расширения периферических симпатических нейронов или моноаминергические нейроны мозга содержат цитоплазматические везикулы, которые активно запасают синтезированные или повторно захваченные биогенные амины с помощью специфических белков-носителей, называемых везикулярными транспортерами моноаминов (VMAT) (Johnson, 1988). Существуют 2 изоформы данного транспортера: VMAT1 – нейроэндокринная изоформа и VMAT2 – нейронная изоформа (Schuldiner, 1994; Eiden et al., 2002). Нейроны на периферии и в мозге экспрессируют VMAT2, однако хромаффинные клетки надпочечников экспрессируют преимущественно VMAT1 у грызунов, а VMAT2 у человека. Паракринные SIF-клетки (small intensely fluorescent cells) симпатических ганглиев экспрессируют преимущественно изоформу VMAT1 (Eiden et al., 2002). Все катехоламины являются, как правило, наиболее предпочтительными субстратами для VMAT2, чем для VMAT1 (Goldstein, 2001).
VMAT1 и VMAT2 представляют собой высоко гомологичные кислые гликопротеины с молекулярной массой 70 кДа (Wimalasena, 2011). Хотя кристаллические структуры VMAT еще не доступны, анализ последовательности этих и родственных белков свидетельствует о том, что вероятнее всего они представляют собой белки с 12 трансмембранными доменами, сходными с переносчиками моноаминов на плазматической мембране (Wimalasena, 2011). Локализация С- и N-концов в цитоплазме является единственным установленным структурным признаком этих белков (Erickson et al., 1992; Eiden et al., 2002).
Поглощение везикулами моноаминов с помощью VMAT идет за счет протонного градиента, обеспечиваемого работой H+-транспортера, в отличие от переносчика нейротрансмиттеров, который является Na2+-зависимым.
Быстрая инактивация биогенных аминов, выделенных в синаптическую щель, является необходимым условием для точного контроля их эффектов. Везикулярные хранилища моноаминов не существуют в статическом состоянии в ожидании экзоцитоза, а находятся в высоко динамическом равновесии с окружающей цитоплазмой. При этом пассивная утечка катехоламинов уравновешена их активным транспортом под контролем VMAT (Eisenhofer et al., 2004b).
Транспортеры моноаминов играют важную роль в обеспечении метаболических и физиологических функций биогенных аминов, которые удаляются с помощью нейронального или экстраневрального обратного захвата и переноса в накопительные везикулы, а также путем их метаболических превращений под действием МАО в цитоплазме нейронов или с помощью СОМТ.
Роль биогенных аминов в развитии стресса
В настоящее время исследование влияния неблагоприятных факторов на организм представляет огромный интерес, свидетельством чего является огромное количество работ, посвящённых данной теме (Tanaka, 1999; Konstandi et al., 2000; Gesi et al., 2002; LeBlanc, Ducharme, 2007; Ayala et al., 2012). Различные стрессовые воздействия на организм сопровождаются выделением НА и АД в кровяное русло. После попадания в кровоток эти гормоны оказывают действие на сердечно-сосудистую систему, что приводит к изменению артериального давления, сердечного ритма и энергетического метаболизма, что позволяет организму реагировать на угрозу.
Показано, что такие стрессовые воздействия, как иммобилизация, поражение током конечностей, мощные звуковые сигналы, вызывают значительное увеличение секреции НА в гипоталамусе, миндалевидном теле и в области голубого пятна у крыс (Tanaka, 1999). Однако при повторном предъявлении стимулов выброс этого катехоламина происходит в меньшем объеме. О специфичности ответа катехоламинергической системы на стрессовые условия свидетельствуют данные о том, что при повторяющемся эмоциональном стрессе объем секретируемого НА не снижается (Tanaka, 1999).
При изучении реакции крыс и мышей на стресс было выяснено, что у обоих видов животных наблюдается достоверное снижение содержания НА и 5-ОТ в голубом пятне по сравнению с контрольными животными (Konstandi et al., 2000). В том же исследовании был отмечен повышенный выброс ДА в гипоталамусе, в то время как в миндалевидном теле секреция данного катехоламина была снижена. Также снижение уровня ДА при неизменной скорости его метаболизма наблюдалось в гиппокампе самцов крыс при метаболическом и психогенном стрессе, однако содержание НА в гиппокампе и стриатуме при тех же условиях повышалось (Крицкая и др., 2016).
Воздействие громкого шума также индуцирует рост содержания ДА, НА, АД и их метаболитов, увеличение плотности хромаффинных гранул в клетках надпочечников. Показано, что после многократного предъявления звуковых раздражителей уровень НА в надпочечниках значительно выше контрольных величин (Gesi et al., 2002). Также при аудиогенном стрессе содержание ДА снижается, а концентрация НА увеличивается в миндалевидном комплексе крыс (Леушкина и др., 2013).
При стрессовых воздействиях также нарушается рабочая память за счет высвобождения катехоламинов в префронтальной коре и торможения нейрональной активности через рецепторы к ДА (D1) и НА (1) (Shansky, Lipps, 2013).
Изменение экспрессии ферментов биосинтеза катехоламинов является распространенным ответом на многие виды стресса. Стресс, вызванный холодом или иммобилизацией, ведет к повышению транскрипции ТН в надпочечниках крыс. Активность данного фермента может контролироваться путем фосфорилирования его молекулы по Ser 19, 31 и 40. Было показано, что иммобилизационный стресс вызывает кратковременное повышение фосфорилирования Ser 31 в надпочечниках и голубом пятне. Воздействие электрическим током приводит к значительному снижению фосфорилирования Ser 19 и увеличению по Ser 31 в течение долгого времени (Ong et al., 2011).
Несмотря на то, что транспорт биогенных аминов активируется при стрессе, исследования стресс-индуцируемых изменений активности и экспрессии генов переносчиков катехоламинов, расположенных в периферических нейронах, встречаются довольно редко. В некоторых исследованиях упоминается экспрессия гена и белка NET при окислительном стрессе в клетках линии PC12 (Mao et al., 2004; Mao et al., 2005). Результаты данных экспериментов подтверждают функциональную роль окислительного стресса в поглощении НА нейронами посредством уменьшения количества сайтов связывания для обратного захвата НА и снижения продукции белка NET без изменения экспрессии его гена. Влияние окислительного стресса на NET является посттранскрипционным событием (Mao et al., 2004). На экстраневральном уровне поглощение НА клетками сердца снижается при кардиомиопатии за счет снижения количества NET-рецепторов. Воспроизведение этого процесса в клетках феохромоцитомы PC12 с помощью высоких концентраций внеклеточного НА приводило к снижению количества гликозилированных форм NET как в мембранах, так и в цитозольных фракциях, а добавление антиоксидантов препятствовало негативной регуляции NET. Это позволило сделать вывод о том, что супрессирующий эффект НА на мембранный белок NET является вторичным по отношению к индукции стресса эндоплазматического ретикулума с помощью окисленных метаболитов НА (Mao et al., 2005).
В нормальных условиях переносчик катехоламинов VMAT1 широко экспрессируется во всех типах хромаффинных клеток надпочечников, в то время как VMAT2 локализуется совместно с ТН, но не с PNMT, что указывает на его присутствие в хромаффинных клетках, синтезирующих НА. Однократное и многократное воздействие иммобилизационного стресса приводит к увеличению экспрессии мРНК и белка VMAT2 в мозговом слое надпочечников крыс (Tillinger et al., 2010; Sabban et al., 2012). При этом также имеет место увеличение экспрессии VMAT2 в хромаффинных клетках, синтезирующих АД, которое не наблюдается у контрольных крыс. По мнению авторов, полученные данные свидетельствуют об адаптации мозгового вещества надпочечников к длительному действию стрессорного фактора путем повышения эффективности хранения катехоламинов.
Под влиянием стресса происходит изменение активности ферментов, осуществляющих деградацию моноаминов. Было отмечено снижение активности как МАО А, так и МАО В в печени иммобилизованных крыс (Obata, Yamanaka, 1994). При действии электрического тока также наблюдается снижение активности МАО А в мозге крыс (Lemoine et al., 1990). Тем не менее, изменений активности МАО в мозговом слое надпочечников стрессированных крыс обнаружено не было (Kvetnansky et al., 2013). Однако в хромаффинных клетках неоднократно иммобилизованных животных было отмечено снижение активности СOMT.
Проблема влияния пренатального стресса на развитие плода в настоящее время привлекает пристальное внимание ученых всего мира. На данный момент установлено, что стрессирование беременных матерей, особенно в последнюю треть беременности, приводит к серьезным перестройкам гормонального уровня у плодов и вызывает изменение различных форм поведения в процессе постнатального развития потомства. Так, отмечено, что пренатальный стресс демаскулинизирует и феминизирует половое поведение взрослых самцов крыс, рожденных от стрессированных матерей (Wang et al., 2006). Пренатальный стресс снижает фертильность и плодовитость у родившихся самок (Frye, Orecki, 2002). У них также отмечалась нерегулярность эстральных циклов.
Стресс, возникающий вследствие внутриутробной гипоксии или под влиянием ксенобиотиков на материнский организм при беременности, может приводить к серьезным нарушениям плацентации, эмбриогенеза и формирования разных функциональных систем новорожденных. Ряд патологий, таких как материнская анемия, ГГЦ, снижение плацентарного кровообращения вследствие гипертензии у матери, курение, потребление алкоголя, как известно, приводят к развитию стресса у плода. Во всех перечисленных ситуациях доступность кислорода к клеткам плода снижается (Mamet et al., 2002). По одной из гипотез, материнский стресс на ранних стадиях беременности передается плоду не только посредствам глюкокортикоидов, но и через катехоламины. Повышенная секреция катехоламинов у матери снижает кровоток матки за счет увеличения тонуса маточных артерий (Barton et al., 1974). Напротив, уменьшение кровотока матки, вызванное окклюзией маточной артерии, приводит к устойчивому повышению содержания катехоламинов в организме плода и сдвигу его метаболизма в анаэробное состояние, что указывает на фетальный стресс (Gu et al., 1985). Подобные эффекты наблюдаются также при эмоциональном стрессе матери (Rakers et al., 2015). С другой стороны, удаление надпочечников у беременных животных приводит не только к нехватке глюкокортикостероидов, но и катехоламинов, которые играют исключительно важную роль в развитии плода.
Влияние пренатальной гипергомоцистеинемии на развитие организма
В процессе внутриутробного развития плод зависит от питательных веществ, поступающих через плаценту от матери. Плацентарный барьер, разделяющий материнскую кровь и кровь плода, включает в себя эндотелиоциты капилляров матери, синцитиотрофобласт и эндотелий сосудов плода. Показано, что концентрация общего ГЦ у плода зависит от концентрации материнского ГЦ (Murphy et al., 2004), что может быть объяснено его транспортом через плаценту (Tsitsiou et al., 2011). В мембранах (микровилли и базальная мембрана) синцитиотрофобласта обнаружены различные классы транспортеров аминокислот. Установлено, что ГЦ может проникать через плаценту за счет L, A и y+L транспортных систем. L-транспортная система в большей мере, чем все остальные, опосредует вход ГЦ через микровилли синцитиотрофобласта (Tsitsiou et al., 2011).
Как показывают исследования, в плаценте человека преобладает только один метаболический путь – реметилирование ГЦ с образованием метионина, катализируемое метионинсинтазой, что подтверждается очень низкой экспрессией CBS и отсутствием экспрессии бетаин гомоцистеинметилтрансферазы (Solanky et al., 2010). Таким образом, ГЦ может появляться в крови плода не только в результате его транспорта через плацентарный барьер, но также за счет метаболизма метионина в плаценте.
Основным местом повреждающего действия ГЦ является внутренняя поверхность сосудов, что значительно повышает риск развития тромбозов. Микротромбообразование и нарушения микроциркуляции приводят к целому ряду акушерских осложнений. Нарушение плацентации и фетоплацентарного кровообращения могут быть причиной репродуктивной недостаточности, в частности, невынашивания беременности и бесплодия в результате дефектов имплантации зародыша. На более поздних стадиях беременности ГГЦ является причиной развития хронической фетоплацентарной недостаточности и хронической внутриутробной гипоксии плода (Hague, 2003). Это приводит к рождению детей с низкой массой тела и снижению функциональных резервов всех жизнеобеспечивающих систем новорожденного, а также к развитию целого ряда осложнений периода раннего онтогенеза. ГЦ свободно проходит через плацентарный барьер и может оказывать тератогенное и фетотоксическое действие на плод. Было доказано, что ГГЦ матери является одной из причин анэнцефалии и незаращения спинномозгового канала эмбриона (Blom, 2009).
Мутации в гене метилентетрагидрофолатредуктазы у матерей, отцов или детей с дефектом нервной трубки являются молекулярно-генетическими доказательствами связи метаболизма ГЦ с данной патологией (Fowler, 1997). С использованием модели куриного эмбриона было показано, что метилирование имеет решающее значение для правильного замыкания нервной трубки. Ингибирование SAH-гидролазы куриного эмбриона in vitro приводило к торможению метилирования, что подтверждалось увеличением концентрации SAH и снижением отношения SAM/SAH (Rosenquist et al., 1996; Afman et al., 2005). Наряду с этими метаболическими изменениями наблюдалось расширение передней нейропоры. Отношение SAM/SAH также снижено и у матерей, дети которых имели дефект нервной трубки (Zhao et al., 2006).
Несмотря на то, что пренатальная ГГЦ является причиной возникновения глубоких функциональных нарушений в ЦНС потомства, о чем свидетельствуют работы, опубликованные отечественными (Makhro et al., 2008; Махро и др., 2008; Arutjunyan et al., 2012a; Arutyunyan et al., 2012b; Милютина и др., 2012; Gerasimova et al., 2017) и зарубежными исследователями (Baydas et al., 2007b; Koz et al., 2010), механизмы данных изменений все еще не ясны.
У взрослых лабораторных животных повышенное содержание ГЦ является важным фактором развития когнитивных нарушений (Baydas et al., 2003). Так, в экспериментах in vivo было показано, что хроническое введение крысам ГЦ нарушает как краткосрочную, так и долговременную память (Baydas et al., 2003; Streck et al., 2004). Эпидемиологические исследования установили сильную корреляцию между повышенным уровнем ГЦ и неврологическими расстройствами, такими как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, аутизм, депрессия, шизофрения (Kumar et al., 2017). У крыс, получавших ГЦ в течение 2-х недель, отмечалось нарушение памяти и изменения в ткани мозга, характерные для болезни Альцгеймера (Zhang et al., 2009). В основе этих изменений лежит нейротоксический эффект ГЦ, высокие концентрации которого снижают жизнеспособность клеток главным образом за счет развития окислительного стресса и повышенной выработки провоспалительных цитокинов в ткани мозга (Miller, 2003; da Cunha et al., 2012a).
В мозге мышей и крыс, перенесших пренатальную ГГЦ, отмечается повышение числа апоптотических клеток (Jadavji et al., 2015). В экспериментах in vitro также показано, что ГЦ способен вызывать апоптоз в культивируемых нейронах гиппокампа из мозга эмбрионов крыс (Kruman et al., 2000). Аналогичные эффекты были обнаружены и при исследовании астроцитов (Maler et al., 2003). Пренатальная ГГЦ ведет к изменению экспрессии молекул адгезии нейрональной сети, уменьшению экспрессии глиального фибриллярного кислого белка, образующего промежуточные филаменты в клетках астроглии и в клетках глиального происхождения, а также белка S100B в мозге новорожденных крысят (Bayadas et al., 2006).
Согласно литературным данным, механизм активации апоптоза при ГГЦ в различных типах клеток может осуществляться как «внешним путем» через взаимодействие внеклеточных сигналов с рецепторами клеточной поверхности (Suhara et al., 2004), так и «внутренним», связанным с деструкцией митохондрий под действием окислительного стресса и выходом цитохрома С в цитоплазму (Cai et al., 2013). Роль окислительного стресса в индуцированных ГГЦ нарушениях развития нервной системы и когнитивных функций потомства подтверждается также тем, что они могут быть устранены путем введения животным во время беременности раствора мелатонина и некоторых коротких пептидов, обладающих выраженными антиоксидантными свойствами (Baydas et al., 2008; Gitto et al., 2009; Arutjunyan et al., 2012a). Предполагается, что негативное действие ГЦ на организм матери и плода обусловлено его эксайтотоксическим эффектом, ввиду структурного сходства с глутаматом, что приводит к нарушению развития нервной системы плода (Болдырев, 2009). Кроме того, имеются данные о том, что повышение уровня ГЦ в крови матери подавляет работу NMDA-рецепторов в нейрональном эпителии, что также является причиной аномального развития мозга потомства (Rosenquist, Finnell, 2001).
Вызванное хронической ГГЦ матери нарушение развития мозга плода, неоспоримо затрагивает когнитивные функции потомства. Хорошо известно, что синаптическая пластичность, которая может быть косвенно оценена с помощью распределения специфических цитоскелетных белков, участвующих в ремоделировании цитоскелета синаптических терминалей (Журавин и др., 2009), является необходимым условием для обучения и формирования памяти (Richter-Levin, Segal, 1991; Chai et al., 2013). Синаптическая передача в нервной системе включает в себя последовательное вовлечение пресинаптических и постсинаптических компонентов. В пресинаптическом высвобождении нейротрансмиттеров задействованы ассоциированные с синаптическими везикулами белки, такие как синапсин 1, синаптофизин и синаптобревин, которые считаются маркерами синаптической пластичности в нейронных сетях (Slutsky et al., 2010; Chai et al., 2013). Хроническое введение ГЦ взрослым крысам индуцирует сокращение дендритных ветвей и плотность шипиков в поле СА1 гиппокампа. Также было обнаружено снижение экспрессии синаптотагмина, синаптофизина и синапсина и уровней постсинаптических белков NR1 и NR2A при ГГЦ (Chai et al., 2013). Введение в течение 7 дней L-метионина половозрелым мышам способствовало уменьшению плотности дендритных шипиков пирамидных нейронов в III слое лобной коры (Miyata et al., 2010). Ранее на модели пренатальной гипоксии было показано снижение количества синаптоподин-позитивных дендритных лабильных шипиков в кортикальных отделах головного мозга взрослых крыс (Журавин и др., 2009), однако на модели пренатальной ГГЦ такие исследования не проводились.
Влияние гомоцистеина на содержание биогенных аминов
Ввиду того, что метаболизм биогенных аминов связан с метиониновым циклом за счет непрерывного использования метильных групп и кофакторов, значительный интерес представляют исследования влияния высокого уровня ГЦ на обмен катехоламинов и 5-ОТ в организме.
Установлено, что в структурах гипоталамуса, ответственных за регуляцию репродуктивной функции, обнаруживаются нормальные суточные ритмы катехоламинов (Милютина и др., 2007; Кореневский и др., 2007). С использованием модели ГГЦ, вызванной потреблением метионина с питьевой водой, отмечено изменение нормальной суточной динамики концентраций НА и ДА в гипоталамусе взрослых подопытных животных (Милютина и др., 2012). У самок крыс с пренатальной ГГЦ было обнаружено снижение содержания НА и повышение ДА в медиальной преоптической области и срединном возвышении с аркуатными ядрами (Арутюнян и др., 2016).
Повышение НА в гипоталамусе при метиониновой нагрузке также подтверждено данными других исследователей. По их мнению, ГЦ индуцирует увеличение секреции лютеинизирующего гормона гипофизом вследствие ингибирования активности СОМТ в срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса, приводя к накоплению НА (Ladosky et al., 1983).
Повышенное потребление метионина может приводить к увеличению образования не только ГЦ, но и других продуктов метионинового цикла, таких как SAH и SAM. Эти продукты оказывают влияние на биосинтез биогенных аминов и их обратный захват. Известно, что повышение содержания SAM изменяет нейротрансмиттерные функции НА и может уменьшать связанную с ним внутриклеточную передачу сигналов в мозге крысы (Fonlupt et al., 1993). SAH (0,1-30 мг/кг) увеличивает синтез НА из тирозина в стволе мозга и в среднем мозге крысы (Fonlupt et al., 1979b). Также показано, что SAM (0,1 мг/кг массы животного) снижает синтез НА in vivo и не влияет на уровень 5-ОТ в мозге крысы. Однако при введении SAH (7 мг/кг массы животного) наблюдается увеличение синтеза НА и снижение синтеза 5-ОТ. В то же время влияния SAM и SAH на скорость синтеза ДА отмечено не было (Fonlupt et al., 1979a). При инкубации гомогената мозга крысы с 10 мкМ SAH обратный захват НА становится зависимым от своей концентрации. Низкое содержание НА приводит к снижению захвата, высокое – к увеличению (Fonlupt et al., 1988). SAH в концентрации 10-7-10-5 М активирует обратный захват НА и 5-ОТ в препаратах синаптосом, но не влияет на захват ДА (Fonlupt et al., 1979c).
Хроническое повышение уровня ГЦ в сыворотке крови приводит к увеличению содержания НА в медиальной преоптической области самок крыс, а также к повышению содержания его предшественника, ДА, в срединном возвышении с аркуатными ядрами (Арутюнян и др., 2011). Это свидетельствует в пользу того, что ГГЦ приводит к нарушению нормального биосинтеза гипоталамических нейромедиаторов-моноаминов.
Серосодержащие аминокислоты, в том числе и ГЦ, стимулируют высвобождение нейротрансмиттеров (ДА, ГАМК, аспартат) из клеток различных нейрональных культур по рецептор-опосредованному механизму (Mount et al., 1990). При этом стимуляция Ca2+-зависимого высвобождения НА в срезах гиппокампа, вызываемая ГЦ, опосредована NMDA-рецептором (Selema et al., 1997).
Одним из предполагаемых механизмов токсического действия ГЦ является его влияние на активность СOMT. Хорошо известно, что СOMT катализирует метилирование катехол-содержащих веществ. Как правило, СOMT имеет очень низкую специфичность к субстрату и поэтому участвует в метаболизме самых разнообразных веществ, таких как эндогенные катехоламины (нейротрансмиттеры, нейрогормоны) и катехол-эстрогены, а также различные катехол-содержащие ксенобиотики, поступающие в организм (Zhu et al., 2000; Zhu et al., 2001). СOMT-опосредованное метилирование эндогенных катехоламинов и катехол-эстрогенов не только инактивирует их деятельность в качестве нейротрансмиттреров и гормонов, но также в значительной степени снижает их реакционную способность и цитотоксичность. Во время СOMT-опосредованного О-метилирования катехоламинов SAM превращается в SAH после передачи метильной группы на субстрат. Известно, что SAH является эндогенным ингибитором О-метилирования эндогенных и экзогенных катехолов (Zhu et al., 2000), так как значение KI SAH для СOMT ниже, чем значение KM SAH для данного фермента (Zhu et al., 2001).
Установлено, что SAH может конкурентно ингибировать способность SAM функционировать в качестве донора метильных групп в процессе СOMT опосредованного метилирования 2-гидроксиэстрадиола (Zhu, 2002). Эти данные натолкнули ученых на мысль, что SAM и SAH взаимодействуют с одним и тем же сайтом связывания СOMT. Впоследствии предположение подтвердилось данными рентгеновской кристаллографии и исследованиями с помощью компьютерного моделирования. Кинетический анализ показал, что SAH является абсолютно бесконкурентным ингибитором СOMT опосредованного формирования метилированных продуктов (Zhu et al., 2000). Схема взаимодействия SAM и SAH с СOMT изображена на рисунке 11.
COMT – катехол-О метилтрансфераза, SAM – S-аденозилметионин, SAH – S аденозилгомоцистеин Поскольку SAH является сильным ингибитором СOMT, то повышение концентрации SAH будет подавлять СOMT-опосредованное метилирование катехоламинов и вследствие этого увеличивать их содержание в крови и других тканях (Zhu, 2002). Постоянное повышение уровня биологически активных катехоламинов может привести к ряду патологических изменений, так как норадреналин и адреналин известны в качестве мощных стимуляторов сердечно-сосудистой системы.
Также катехоламины являются потенциально реакционноспособными молекулами. Повышенный уровень катехоламинов в тканях ведет к повышенному образованию реактивных семихинонов и оксирадикалов (гидроксильных и супероксидных радикалов) (Bolton et al., 2000). Одним из метаболических путей, приводящих к формированию реактивных продуктов, является окислительно-восстановительный цикл между катехоламинами или их катехол-содержащими метаболитами, и хинон/семихинонными промежуточными соединениями (Bolton et al., 2000). Разнообразные окисляющие ферменты, такие как TH, тирозиназы и лактопероксидазы, могут служить катализаторами окислительно-восстановительных реакций (Bolton et al., 2000). Кроме того, данные реакции могут происходить автоматически, без участия ферментов (автоокисление). Показано, что ГЦ и гомоцистеиновая кислота подавляют окисление L-ДОФА в присутствии железа (Shen, Dryhurst, 1998) в то время, как NO-опосредованное окисление НА и его окисление в присутствии хлорида железа в тех же условиях усиливается (Biasetti, Dawson, 2002). В некоторых работах было продемонстрировано, что реактивные хиноны/семихиноны катехоламинов и оксирадикалы чрезвычайно токсичны для клеток (Bolton et al., 2000).
В дополнение к выше сказанному важно отметить, что в ходе моноаминоксидазной реакции метаболизма биогенных аминов может образовываться перекись водорода. В присутствии ионов двухвалентного железа перекись водорода может превращаться в гидроксильные свободные радикалы по реакции Фентона (Cohen, 2000). Разнообразные метаболические пути, ведущие к генерации свободных радикалов и реакционноспособных катехоламинов, изображены на рисунке 12.
Согласно данным in vitro, SAH также оказывает дозозависимое ингибирующее действие на PNMT. Показано, что в присутствии 510-6 М SAH активность фермента может снижаться на 50%. При повышении концентрации SAH до 510-5 М активность PNMT полностью подавляется, однако при более низкой концентрации SAH ингибирование фермента не происходит (Deguchi, Barchas, 1971). Также установлено, что ни аденозин, ни ГЦ не снижают активности метилтрансферазы, однако они блокируют гидролиз SAH, а тот, в свою очередь, ингибирует действие PNMT (Deguchi, Barchas, 1971).
SAH-гидролаза катализирует обратимое расщепление тиоэфирной связи SAH с образованием аденозина и ГЦ. Было показано, что данный фермент, выделенный из Dictyostelium discoideum или эритроцитов кролика, инактивируется при инкубации с цAMФ вследствие диссоциации кофактора НАД+ (Suarez, Chagoya de Sanchez, 1997). Поскольку катехоламины могут увеличивать количество цAMФ, в исследованиях, проведенных на морских свинках, было обнаружено, что АД может подавлять активность SAH-гидролазы (Suarez, Chagoya de Sanchez, 1997).