Введение к работе
Актуальность проблемы
Мультиферментная цитохром Р —450—зависимая монооксигеназиая система микросом (МОС) печени является ключевой системой метаболизма ксенобиотиков. Она участвует также в окислении эндогенных субстратов (стероидных гормонов, холестерина и т.п.]. Центральная роль МОС в метаболизме лекарственных веществ, активации канцерогенных ксенобиоткков, в ряде биосинтетических процессов обуславливает пристальное внимание исследователей к ее структурно —функциональной организации и механизмам катализируемых ею реакций.
Одной из центральных проблем в изучении механизмов функционирования МОС является исследование белок—белковых взаимодействий. До настоящего времени не существует однозначного представления о молекулярных механизмах взаимодействия главных компонентов МОС — цитохрома Р —450 и NADPH —цитохром Р —450 редуктазы. Большинство результатов, полученных с помощью химической модификации этих белков, свидетельствуют о важной роли электростатических: взаимодействий, в которых участвуют аминогруппы гемопротеина и карбоксильные группы NADPH — ФГк. Однако, при использовании бифункциональных сшивающих агентов не удалось получить ковалентно сшитый комплекс этих белков2. Более того, некоторые данные о влиянии ионной силы и диэлектрической проницаемости среды на взаимодействие компонентов МОС были интерпретированы как свидетельство того, что поверхностные заряды цитохрома Р—450 и NADPH —ФП не только не участвуют в специфическом взаимодействии этих белков, но и мешают образованию их комплекса за счет электростатического отталкивания молекул^.
1 Nadler S.C.. Strobe] H.W. Arch. Biochem. Biophys., 1988, V. 261, P. 418-429
Nadler S.G., Strobel H.W. Arch. Biochem. Biophys., 1991, V. 290,. P. 277-284
Bernhardt R. et al., in; Biochemistry, Biophisics and Regulation of Cytochrome P—450, P. 595—598. J.A. Gustafsson et al.(Eds.) Elsevier/Noth - Holland Biomedical Press, 1980.
Bernhardt R. et al., Biochem. Biophys. Acta,. 1983, V. 745, P. 140-148.
Bernhardt R. et al., Biochem. Biophys Acta, 1984, V. 785, P.186-I90.
Bernhardt R., Kraft R., Otto A, and Ruckpaul K. Biomed. Biochim. Acta, 1988, V. 43, P. 581-592.
Shen S., Strofael H.W. Arch. Biochem. Biophys, 1992. V. 294, P. 83-90.
2 Bernhardt R. et al., Biochem. Biophys. Acta, 1984, V. 785, P. 186- 190.
Tamburini P.P. et al„ Biochem. Biophys. Res. , 1986, V. 134, P.519—526.
Schenkman John B. Proc. NATO Adv. Study last., Cesrae, Aug.27-Sept.7, 1989. New York, London, 1991, P. 1-Ю.
Kanaeva I.P. et al, Arch. Biochem. Biophys, 1992, V. 298, P. 403- 412.
3 VoznesenskyAl., Schenkman J B. J. Biol. Chem, 1992, V. 267, P. 14669-14676.
Voznesensky A.I., Schenkman J.B. J. Biol. Chem, 1994, V. 269, P. 15724-15731.
В го же время, из литературных данных известно, что лишенная гидрофобного фрагмента NADPH — цитохром Р —450 редуктаза не способна к образованию комплексов с цитохромом Р—450^, что указывает на то, что в образовании комплексов этих белков определенную роль играют также и гидрофобные взаимодействия. Учитывая противоречивость перечисленных выше фактов, большой интерес представляет исследование вклада электростатических взаимодействий в образование функционально — активных комплексов мнкросомальных белков.
Целью настоящей работы явилось исследование роли электростатических взаимодействий в образовании комплексов цитохрома Р-450 2В4 с NADPH — цитохром Р—450 редуктазой.
Были поставлены следующие задачи исследования:
1. Получить модифицированный янтарным ангидридом цитохром Р —450
2В4 с различным числом сукцинилированных аминогрупп.
2. Исследовать электрон — транспортные и каталитические свойства
сукцинилированного цитохрома Р —450.
-
Разработать подходы для прямой регистрации процессов образования олкгомеров цитохрома Р—450 и его комплексов с NADPH — цитохром Р — 450 редуктазой, основанные на принципах переноса энергии и тушении флуоресценции зондов, введенных в молекулы цитохрома Р —450 2В4 и NADPH - цитохром Р— 450 редуктазы.
-
Исследовать влияние сукцинилирования цитохрома Р —450 2В4 на его взаимодействие с NADPH — цитохром Р—450 редуктазой.
Подобраны флуоресцентные метки и условия модификации цитохрома Р — 450 и NADPH — цитохром Р— 450 редуктазы для применения методов, основанных на переносе и тушении энергии флуоресценции ковалентно связанных с белками флуоресцентных меток. Показано, что такая модификация не нарушает белок —белкового взаимодействия цитохрома Р—450 2В4. Разработанные таким образом методы использованы для регистрации образования олигомеров цитохрома Р—450 2В4 и его комплексов с NADPH— цитохром Р —450 редуктазой.
В результате проведенных экспериментов были получены препараты цитохрома Р—450 2В4 с различным числом сукцинилированных остатков лизина.
* Coon. M.J. et al., Liver microsomal membranes: recanstitution of the bidroxylatian system, containing cytochrome P—450-; The structural basis of membrane function., Ed. by Y. Hatefi and LDjavadi — Ohaniance., N.Y., Academic Press; 1976, P.4.09-427.
Показано, что модификация до 30% свободных аминогрупп гемопротеина не влияет на его спектральные свойства, взаимодействие с N,N—диметиланилином и каталитическую активность в пероксидазной системе.
Установлено, что модификация аминогрупп цитохрома Р —450 2В4 янтарным ангидридом приводит к существенному сдвигу равновесия агрегации гемопротеина в сторону мономеров, в результате ускорения распада агрегатов. Показано так же, что в результате такой модификации увеличиваются константы диссоциации комплекса гемопротеина с NADPH — цитохром Р—450 редуктазои , что обусловлено как увеличением константы скорости распада, так и снижением константы скорости образования комплекса. Таким образом, показано, что заряд аминогрупп цитохрома Р—450 необходим для увеличения прочности образовавшегося комплекса цитохрома Р—450 с NADPH — цитохром Р —450 редуктазои.
Полученные результаты представляют интерес для выяснения механизмов функционирования монооксигеназной системы печени животных и человека. Разработанные методические подходы используются в лаборатории микросомалького окисления ИБМХ РАМН и лаборатории биоспектроскопии (INSERM U.310) института физико-химической биологии (Франция).
АПРОБАЦИЯ ДИССЕРТАЦИИ. Результаты исследований были доложены на 7 —ой, 8—ой и 9 —ой Международных: конференциях по цитохрому Р —450: "Biochemistry & Biophysics of Cytochrome P —450; Structure & Function, Biotechnological & Ecological Aspects" (Москва, 1991); "Cytochrome P —450: Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology" (Лиссабон, 1993); "Cytochrome P — 450: Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology" (Цюрих, 1995), а также на совместном заседании учебно—научного комплекса кафедры биохимии МВФ РГМУ и института биологической и медицинской химии РАМН.
ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ.
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация изложена на страницах
машинописного текста, включая рисунка и таблиц: Состоит из введения,
обзора литературы, описания материалов и методов исследования,
экспериментальной части, обсуждения, выводов и списка цитируемой
литературы, содержащего источников.