Введение к работе
Изучению влияния ионизирующего излучения на различные биохимические процессы в растительных клетках посвящено большое число работ отечественных и зарубежных авторов. Интерес к этой области радиобиологии в значительной степени связан с обнаружением стимулирующего и мутагенного эффектов облучения, которые исследовались преимущественно на растениях, представляющих интерес для промышленности и сельского хозяйства. В последние годы все более пристальное внимание уделяется методам культивирования растительных клеток и тканей. Это связано в первую очередь о перспективностью их использования в качестве продуцентов различных биологически активных веществ, находящих широкое практическое применение. Кроме того, метод культуры тканей позволяет достаточно адекватно оценивать влияние ионизирующих излучений на отдельные клетки или клеточные популяции, выращиваемые в строго контролируемых условиях. Оценка состояния белкового метаболизма в норме и в условиях воздействия стрессовых факторов создает предпосылки для более эффективного развития биотехнологии культивируемых клеток. На кафедре биохимии Санкт-Петербургской Государственной Химико-Фармацевтической Академии в течение многих лет проводятся исследования z использованием в качестве объектов промышленных штаммов Ралах ginseng и Rauwolfia serpentina Benth. Данная работа является продолжением исследований сотрудников кафедры в этой области.
Ее цель: изучить влияние рентгеновского излучения на рост и 5елок-синтезирующую способность культуры ткани Rauwolfia serpentina Benth.- продуцента ценного антиаритмического препарата эймалина.
С точки зрения радиобиологии особый интерес представляет изучение обмена отдельных ферментов в условиях лучевого воздейс-
- 4 -твия, поскольку ферментные системы играют важную роль в жизнедеятельности организма. В частности, сотрудниками кафедры биохимии СПХФА проведены исследования пострадиационных изменений биосинтеза и молекулярной гетерогенности ряда ферментов из различных органов животных: альдолази, каталазы, протеиназы, бутирилхолинэс-теразы [Комов и соавт, 1976-1988]. В данной работе наряду, с оценкой состояния метаболизма общего белка изучено влияние облучения на параметры обмена и молекулярную гетерогенность каталазы - одного из ферментов антиоксидантний защиты организма.
Данные литературы убедительно свидетельствуют о роли каталазы в процессах пострадиационного восстановления. Известно, что, активно разлагая перекись водорода, каталаза обеспечивает снижение уровня перекисного окисления липидое в облученных клетках. Кроме того, она повышает эффективность действия эндогенных и экзогенных тиоловых соединений, играющих радиопротекторную роль. Пострадиационные изменения активности этого фермента в различных животных и растительных объектах наблюдали многие исследователи, однако результаты в некоторых случаях противоречивы. Отмечается, что активация каталазы в растительных тканях коррелирует с их быстрым восстановлением, введение экзогенной каталазы значительно уменьшало степень радиационных повреждений в различных системах [Гродзинский,Петров,1969; Pai.Qaur,19881. Тем не менее, однозначного вывода о роли этого фермента в развитии радиобиологических реакций до сих пор нет. Крайне ограничены также сведения об изменении изоэнзимного спектра каталазы в условиях лучевого воздействия, остается невыясненным и механизм пострадиационных нарушений ее кругооборота. На основании вышеизложенного можно рассматривать предпринятое нами исследование как принципиально новое и актуальное.
Задачи исследования. В работе были поставлены.следующие задачи:
-
Оценить влияние ионизирующего излучения на прирост биомассы в культуре ткани R. serpentina при культивировании на облученной и необлученной питательной среде.
-
Исследовать пострадиационные изменения содержания белка и параметров его обмена в клетках ткани R.serpentina при облучении на 2-е и 25-е сутки роста.
-
Охарактеризовать динамику изменения активности и оценить молекулярную гетерогенность каталазы в процессе роста культуры ткани R. serpentina после облучения с последующей пересадкой или без нее.
-
Выделить и очистить до гомогенного состояния каталазу из культивируемых клеток R.serpentina и получить к ней моноспецифические антитела.
-
Провести сравнительную оценку пострадиационных изменений кругооборота каталазы в культуре ткани R.serpentina, подвергнутой облучению на ранних сроках роста и в период максимальной активности фермента.
Научная новизна. Исследованы пострадиационные нарушения белкового обмена в культуре ткани R. serpentina, подвергнутой облучению на 2-е или 25-е сутки роста. Показано, что в результате лучевого воздействия на зрелую культуру происходит активация белок-синтетических процессов, следствием чего является увеличение концентрации белка в клетках на ранней стадии пострадиационного периода. Наряду с этим сокращается время функционирования белковых молекул. В культуре ткани того же возраста, выросшей из облученного инокулята, параметры обмена белка также превышали контрольные значения, хотя его концентрация в клетках не отличалась
- б -от нормы.
В работе впервые были изучены и сопоставлены динамика изменения активности, молекулярная гетерогенность и параметры обмена каталазы в облученной культуре ткани R. serpentina. Установлено, что облучение 25-суточной культуры приводит к снижению скорости обмена фермента более чем в 2 раза, тогда как в культуре ткани того же возраста, выросшей из облученного инокулята, константы скоростей.синтеза и распада каталазы превышают норму. Ускорению кругооборота фермента в большей степени способствовало облучение инокулята с последующей пересадкой. Наряду с этим происходят существенные изменения изоэнзимного спектра каталазы, отражающие адаптивные возможности культивируемых клеток.
Проведена сравнительная оценка прироста биомассы в условиях лучевого воздействия в различных дозах и на разных сроках культивирования. Установлено, что радиационное воздействие в дозах 8 и 50 Гр способствует ускоренному росту культивируемых клеток, но не увеличивает конечный выход биомассы. Облучение в дозах 100 и 150 Гр приводит к ускоренному старению и гибели культуры.
Теоретическая и практическая значимость. Выполненная работа является теоретическим исследованием. Полученные данные об изменениях активности и молекулярной гетерогенности каталазы в культуре ткани R. serpentina позволяют расширить представления о роли этого фермента в процессах пострадиационного восстановления и дают основание предполагать, что перекись водорода, образующаяся под действием ионизирующего излучения, является одним из факторов, индуцирующих его биосинтез.
В качестве объекта исследования был выбран штамм, являющийся промышленным продуцентом аймалина - высокоэффективного противоа-ритмического препарата. Установленный нами факт стимуляции роста
I -
гультуры ткани в результате облучения в малых дозах может иметь шределенное практическое значение, поскольку позволяет сократить ;роки культивирования.
Структура и объем диссертации. Работа изложена на страни-дах, содержит 4 таблицы и 33 рисунка, состоит из введения, обзора литературы, методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка использованной литературы. Последний включает в себя 237 наименований, из них 106 - на иностранном языке.