Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1. Костная ткань: структура и функции (краткие сведения) 12
1.2. Коллагеновые белки 14
1.3. Обмен коллагена I типа
1.3.1. Биосинтез коллагена I типа 19
1.3.2. Деградация фибриллярных коллагенов 23
1.3.3. Регуляция метаболизма коллагена I типа 1.4. Неколлагеновые белки и протеогликаны костного матрикса 29
1.5. Минеральная фаза костной ткани 35
1.6. Биохимические и патогенетические аспекты развития сахарного диабета 1 типа. 36
1.7. Патогенез диабетической остеопатии 38
1.8. Сведения о применении препаратов на основе гликозаминогликанов и солей кальция при заболеваниях костно-суставной системы 47
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 50
2.1. Материалы исследования 50
2.2 Методы исследования 52
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 57
3.1. Обмен коллагена костной ткани крыс с аллоксановым диабетом (экспериментальная группа №1) 57
3.2. Влияние сульфатированных гликозаминогликанов на обмен коллагена костной ткани крыс с аллоксановым диабетом (экспериментальная группа №2) 67
3.3. Влияние глюконата кальция на обмен коллагена костной ткани крыс с аллоксановым диабетом (экспериментальная группа №3) 80
ГЛАВА 4. Обсуждение полученных результатов 93
Заключение 109
Выводы 112
Список использованных сокращений 114
Список литературы
- Обмен коллагена I типа
- Патогенез диабетической остеопатии
- Методы исследования
- Влияние сульфатированных гликозаминогликанов на обмен коллагена костной ткани крыс с аллоксановым диабетом (экспериментальная группа №2)
Обмен коллагена I типа
Костная ткань – особый вид высокоспециализированной минерализованной соединительной ткани, являющейся морфологической основой опорно-двигательного аппарата [7, 23]. Являясь основой костей, из которых сформирован скелет, костная ткань выполняет механическую функцию, обеспечивая защиту внутренних органов от внешних воздействий и служа опорой для мягких тканей [26]. Костная ткань депонирует неорганический фосфат и кальций [7], вмещая в себя до 95% всех неорганических веществ организма, в числе которых: 99% запасов кальция, 87% фосфора и 58% магния [23]. Не менее важным является участие клеток костной ткани в гемопоэзе [227].
Как и любая другая соединительная ткань, костная ткань представлена клетками и межклеточным веществом. Костная ткань содержит 4 типа клеток: остеобласты, остеоциты, остеокласты и стволовые клетки (osteoprogenitors) [49]. Остеобласты – клетки, продуцирующие костный матрикс. Остеоциты количественно преобладают в зрелой костной ткани и рассматриваются как высокоспециализированные и полностью дифференцированные остеобласты. Наличие большого числа длинных, анастамозирующих между собой цитоплазматических отростков, с помощью которых осуществляется связь между клетками, формирует трхмерную сеть, по которой осуществляется транспорт ионов, метаболитов и питательных веществ [7, 28]. Остеокласты – гигантские многоядерные клетки гематопоэтического происхождения [7, 218]. В основе резорбирующего действия остеокластов лежат 2 основных механизма. Первый – способность за счт действия протонной помпы создавать в месте соприкосновения с поверхностью кости очаги с низким уровнем рН, создавая таким путм условия для растворения кальций-фосфорных солей. Второй – синтез и секреция гидролитических ферментов (матриксных металлопротеиназ, кислой фосфатазы, катепсинов), расщепляющих органические компоненты костного матрикса [218]. Мезенхимальные стволовые клетки (osteoprogenitors) являются предшественниками остеобластов и играют важнейшую роль в регенерации костной ткани при повреждении [100].
Сложный процесс согласованного взаимодействия остеобластов и остеокластов, заключающийся в разрушении старой кости, формировании новой костной ткани и е минерализации называется костным ремоделированием [92]. Ремоделирование костной ткани не приводит к изменению формы и размеров кости как органа [1, 247] и является процессом, поддерживающим е прочность и минеральный гомеостаз [247, 92].
Выделяют 2 морфофункциональных типа костной ткани: трабекулярную (губчатую) и кортикальную (компактную) [23, 153, 76]. Упорядоченные минерализованные коллагеновые фибриллы формируют костные пластинки (ламеллы), которые составляют концентрические цилиндры – остеоны – с полостью внутри, называемой Гаверсовым каналом. Остеон является структурно-функциональной единицей кортикальной кости. В губчатой костной ткани костные пластинки образуют сеть трабекул различной формы и толщины [49, 153, 76].
Зрелая компактная костная ткань более устойчива к механическим воздействиям, чем губчатая [153, 76, 101], в связи с чем, е основная функция – опорно-механическая. В свою очередь, трабекулярная костная ткань участвует в поддержании минерального гомеостаза организма и в гемопоэзе [23, 101], а также в рациональном перераспределении механических нагрузок на кортикальную кость [28]. 1.2. Коллагеновые белки Коллагены – группа структурных белков внеклеточного вещества, содержащих один или несколько доменов, состоящих из уложенных в тройную спираль полипептидных цепей (называемых также -цепями) [239], синтезируемые клетками различных видов соединительной ткани (остеобластами, хондробластами, фибробластами и др.) [8, 59, 6]. Первичную структуру полипептидной цепи коллагена можно записать в виде [Гли-X-Y]333, где X и Y могут быть представлены любой аминокислотой, но чаще в положении X стоит пролин (Про), а в положении Y – гидроксипролин (о-Про) или гидроксилизин (о-Лиз). На долю Про и о-Про приходится 25-30%. Наличие данных аминокислот в структуре пептидных цепей коллагена играет ключевую роль в формировании специфической пространственной конформации коллагеновой макромолекулы. Полипептидная левозакрученная -спираль стабилизируется силами стерического отталкивания пирролидоновых колец пролина, на один виток которой приходится 3 аминокислотных остатка [239, 8, 6, 163]. Спирализованные цепи образуют трхцепочечную правозакрученную суперспиральную молекулу, по центральной оси которой и в участках пересечения -цепей всегда располагается глицин [239, 94, 163]. Между собой цепи удерживаются за счт водородных связей, образованных между амино- и карбоксильными группами пептидного остова и гидроксильными группами гидроксипролина [8, 41]; близкое друг к другу расположение цепей возможно благодаря отсутствию у глицина радикала [154, 8], а «жсткость» и стабильность молекулы тропоколлагена обусловлена наличием в структуре -цепей иминокислот [239, 154, 8]. Такую структуру называют тропоколлагеном [8]. Тропоколлаген является составным элементом (доменом) для формирования различных типов коллагенов [239, 154].
Патогенез диабетической остеопатии
Анализ научных работ, посвящнных изучению фармакокинетики препаратов на основе сульфатированных форм ГАГ, позволяет нам допустить, что при парентеральном введении данных препаратов возможно их накопление в костной ткани без изменения (или с незначительными изменениями) молекулярной массы ГАГ. Накопление хондроитинсульфата с высокой молекулярной массой в костной ткани создат предпосылки для реализации их местных биологических эффектов [2,132, 250, 95, 249, 213, 193].
Ранее было отмечено, что в ряду ПГ SLRPs в зрелой костной ткани в наибольшем количестве присутствуют бигликан и декорин [7, 203]. Известно также, что бигликан способен связываться с КМБ-4, модулируя его активность [174, 122, 92]. Количественно превалирующим гетерополисахаридом в составе бигликана является хондроитинсульфат [204, 133]. Биосинтез ПГ в тканях протекает de novo, а «присоединение» и рост полисахаридных фрагментов ПГ идт на формирующейся полипептидной цепи [59, 163, 204, 238]. Однако, для некоторых регуляторных факторов, в числе которых находится и КМБ-4, одназначно не установлено какой фрагмент макромолекулы ПГ (белковый или полисахаридный) участвует в связывании КМБ-4. Учитывая эти обстоятельства, мы допускаем вероятность того, что хондроитинсульфат способен связывать КМБ-4, выступая в роли модулирующего фактора. Кроме того, продукты распада хондроитинсульфата могут создавать предпосылки для усиленного синтеза бигликана.
В опытах на стромальных клетках костной ткани, выделенных у мышей с генетически детерминированным дефицитом бигликана, были выявлены: усиленный апоптоз остеогенных клеток в сочетании с низким уровнем их дифференцировки и пролиферации, что приводило к снижению количества остеобластов, снижение уровня м-РНК коллагена [85]. В работе X. Chen et al. была подтверждена необходимость бигликана для дифференцировки остеобластов [86]. Таким образом, опосредованное AGEs увеличение количества остеобластов в совокупности с анаболическим эффектом хондроитинсульфата позволяют объяснять наблюдаемые в компактной и губчатой костной ткани изменения у крыс экспериментальной группы №2. Так, в теле 2 поясничного позвонка по сравнению с контролем отмечается: 1) рост концентрации PINP во все дни наблюдения; 2) увеличение количества СК на 14, 21 и 28 дни; 3) увеличение активности ЩФ на 7, 21 и 28 дни опыта.
В то же время, в исследуемой кости по сравнению со значениями показателей у крыс с «изолированным» экспериментальным аллоксановым диабетом отмечалось: 1) увеличение концентрации PINP на 21 и 28 дни эксперимента; 2) рост количества СК на 7, 14 и 28 дни наблюдения; 3) увеличение активности ЩФ на 21 день.
В диафизе бедренной кости по сравнению с контролем: 1) увеличение концентрации PINP на 14 и 21 дни опыта; 2) рост количества СК на 14, 21 и 28 дни наблюдения; 3) увеличение активности ЩФ на 21 день эксперимента.
При сравнительном анализе показателей обмена коллагена у животных экспериментальной группы №2 и крыс с «изолированным» диабетом в диафизе бедренной кости наблюдалось: 1) рост концентрации PTNP на 14, 21 и 28 дни наблюдения по сравнению со значениями показателя у аллоксан-индуцированных животных; 2) увеличение количества СК на 14 и 28 дни опыта; 3) рост активности ЩФ на 21 день. Высокий, по сравнению с контролем и животными с «изолированным» диабетом, уровень анаболической активности в костной ткани животных экспериментальной группы №2 подтверждается средней прямой корреляцией между значениями концентрации PTNP и СК (бедренная кость -р=0,62; р 0,01; тело2-го поясничного позвонка - р=0,41; р 0,05).
Более высокий уровень анаболических процессов в компактной и губчатой ткани у грызунов экспериментальной группы №2 по сравнению с животными с «изолированным» аллоксановым диабетом можно объяснить и с другой стороны.
Известно, что хондроитинсульфат подавляет экспрессию фосфолипазы А2 и циклооксигеназы-2, таким образом снижая концентрацию PgЕ2 [132]. В экспериментальных работах на тканевых культурах был отмечен двойственный эффект PgE2: в высоких концентрациях PgЕ2 снижает, в низких - наоборот -повышает интенсивность синтеза коллагена I типа [203]. Кроме того, у животных экспериментальной группы №2 стимуляция остеокластогенеза, вызванная ГК [123, 62], обуславливает усиление синтеза и выделения в участке резорбции кости факторов дифференцировки остеобластов, что в итоге приводит к росту количества остеобластов и активации анаболических процессов [137]. О двойственном эффекте ГК на биосинтез коллагена свидетельствует и наблюдаемая в нашем эксперименте средняя корреляционная связь между концентрацией 11-ОКС в плазме крови и количеством СК в теле 2 поясничного позвонка у животных экспериментальной группы №2 (=0,42; р 0,05).
Кроме того, на 21 день наблюдения в плазме крови крыс экспериментальной группы №2 выявлена гиперкальциемия, как по сравнению с контролем, так и по сравнению с животными с «изолированным» диабетом, что свидетельствует о развитии вторичного гиперпаратиреоза. Как было отмечено выше, ПТГ проявляет в отношении процессов костного ремоделирования двойственный эффект [137, 98]. Данные предпосылки, с учтом установленной роли гипергликемии в патогенезе изменений в костной ткани, объясняют обнаружение более высокой концентрации P-CrossLaps в диафизе бедренной кости и теле 2 поясничного на 21 день опыта у грызунов экспериментальной группы №2 по сравнению с аллоксан-индуцированными крысами.
Изменения активности коллагенолитических ферментов (КА), выявленные в костной ткани у грызунов экспериментальной группы №2, хотя и противоречивы, но объяснимы с различных точек зрения. Сравнительно высокий уровень КА на 14 и 28 дни наблюдения в диафизе бедренной кости и теле 2-го поясничного позвонка по отношению к контролю может быть вызван, с одной стороны, интенсификацией костной резорбции, с другой - усилением анаболической активности клеток костной ткани (согласно описанным выше механизмам [5, 9, 62, 70, 75, 82, 83, 85, 86, 98, 99, 123, 132, 137, 171, 194, 195, 203]). Справедливо это и в отношении более высоких значений данного показателя на 14 день эксперимента в компактной и губчатой костной ткани по сравнению с аллоксан-индуцированными крысами. Снижение КА в диафизе бедренной кости у животных экспериментальной группы №2 по сравнению с крысами с «изолированным» диабетом на 28 день опыта объясняется нижеследующим. ММП могут синтезироваться как остеокластами, так и остеобластами [12]. Как было показано выше, активность анаболических процессов в диафизе бедренной кости у аллоксан-индуцированных крыс возвращается к сопоставимому с контролем уровню на 28 день опыта, в то время как у животных экспериментальной группы №2 она выше и по сравнению с контролем, и по сравнению с животными с «изолированным» диабетом. В то же время, у аллокан-индуцированных животных на 28 день выявлена повышенная, по сравнению с контролем, концентрация 11 -ОКС в плазме крови, а у животных экспериментальной группы №2 уровень 11-ОКС от контроля не отличается. Опираясь на эти обстоятельства, мы предполагаем, что причиной высоких значений КА в компактной костной ткани на 28 день опыта у аллоксан-индуцированных грызунов является высокая функциональная активность остеокластов, тогда как у животных экспериментальной группы №2 на 28 день наблюдения отличные от контроля значения КА обусловлены синтезом ММП остеобластами. Таким образом, отличающиеся значения КА в двух экспериментальных группах могут быть опосредованы двумя различными механизмами и объясняются различной функциональной активностью остеокластов и остеобластов.
Методы исследования
Эксперимент проведн на 45 белых беспородных крысах-самцах массой 180-220 г. Летальность в ходе эксперимента составила 29%. Воспроизведение диабета контролировали по сравнению с группой здоровых животных (контрольная группа №3, 8 крыс), которым по схеме внутримышечно вводили кальция глюконат (соответственно срокам наблюдения). Состояние обмена коллагена в экспериментальной группе №3 оценивали по сравнению с крысами с «изолированным» аллоксановым диабетом (экспериментальная группа №1, 40 крыс) и контрольными животными (контрольная группа №1). Контрольную группу составили 10 крыс, находящихся на стандартном рационе вивария и получивших однократно подкожные инъекции по 0,5 мл 0,9% раствора натрия хлорида. Ткани погибших животных для оценки изучаемых показателей не использовались.
Концентрация глюкозы в плазме крови крыс экспериментальной группы №3 была повышена в течение всего опыта на 7, 14, 21 и 28 дни на 68,33% (p=0,000778), 39,19% (p=0,000771), 37,01% (p=0,00779) и 78,15% (p=0,000764) по сравнению с изучаемым показателем у животных контрольной группы №3 соответственно; уровень HbA1c вырос на 20,73% (p=0,000691), 20,73% (p=0,000883), 43,21% (p=0,000697) и 11,11% (p=0,000977) по сравнению с животными контрольной группы №3 соответственно срокам наблюдения (таблица №12).
Уровень 11-ОКС в плазме крови крыс экспериментальной группы №3 на 7 день опыта снизился на 11,91% (p=0,001381), затем вырос на 31,21% (p=0,007686) и 49,67% (p=0,000379) соответственно на 14 и 21 дни эксперимента, не отличаясь от контроля (285,5 [283,2; 295,8] мкг/л) на 28 день наблюдения (Рисунок 11). Таблица № 12. Концентрация глюкозы и гликозилированного гемоглобина в плазме крови животных экспериментальной группы №3.
В плазме крови крыс экспериментальной группы №3 наблюдались фазные изменения активности общей щелочной фосфатазы: рост в 2,3 раза на 7 день опыта (p=0,034866), снижение на 25,56% на 14 день наблюдения (p=0,000354), затем увеличение уровня активности на 45,16 % на 28 день эксперимента (p=0,007375) по сравнению с контрольными значениями данного показателя (таблица №13). Уровень активности общей щелочной фосфатазы в плазме крови животных изучаемой группы был понижен на 40,85% (p1=0,000361) и 41,96% (p1=0,040994) по сравнению со значениями данного показателя у грызунов с «изолированным» диабетом соответственно на 14 и 21 дни эксперимента (таблицы №3 и №13).
На 14, 21 и 28 дни наблюдения в плазме крови крыс подопытной группы №3 отмечено значительное увеличение концентрации свободного гидроксипролина соответственно в 30 (p=0,000339), 45 (p=0,000327) и 47,5 раз (p=0,000329) по сравнению с контролем (таблица №12). На 14 и 28 дни эксперимента концентрация свободного гидроксипролина в плазме крови у данной группы была выше соответственно на 83,83% (p1=0,00029) и 35,71 (p1=0,014229) по сравнению со значениями данного показателя у аллоксан-индуцированнных грызунов (таблицы №3 и №13).
Коллагенолитическая активность плазмы крови грызунов экспериментальной группы №3 от контроля не отличалась. По сравнению со значениями изучаемого показателя у животных с «изолированным» диабетом уровень активности коллагенолитических ферментов в плазме крови крыс экспериментальной группы №3 был ниже на 14 (p1=0,036775) и 28 дни (p1=0,000282) наблюдения (таблицы №3 и №13).
Концентрация общего кальция в плазме крови животных экспериментальной группы №3 уменьшалась на 14, 21 и 28 дни наблюдения уменьшалась соответственно на 6,06% (p=0,003828), 10,82% (p=0,000234) и 11,69% (p=0,001648) по сравнению с контролем (таблица №13). Сравнительный анализ данного показателя у крыс экспериментальной группы №3 и аллоксан-индуцированных грызунов выявил, что у последних концентрация общего кальция в плазме крови была выше на 15,2% (p1=0,004054) и 12,14% (p1=0,0012) соответственно на 14 и 21 дни эксперимента (таблицы №3 и №13). Таблица №13. Показатели обмена коллагена, концентрация общего кальция, активность щелочной фосфатазы в плазме крови крыс экспериментальной группы №3 (Ме [25%; 75%]). СО, мкмоль/л КА, мкмоль/г/ч Ca, ммоль/л ЩФ, нмоль/(с л) В компактной костной ткани у крыс экспериментальной группы №3 на 7 день опыта отмечалось увеличение уровня свободного гидроксипролина на 55,53% (p=0,001299) по сравнению с контролем (таблица №14). При сравнении данного показателя у животных экспериментальной группы №3 и у крыс с «изолированным» диабетом отмечалась сниженная на 30,01% (p1=0,000205) концентрация гидроксипролина в компактной кости у грызунов экспериментальной группы №3 на 14 день опыта (таблицы №4 и №14).
Влияние сульфатированных гликозаминогликанов на обмен коллагена костной ткани крыс с аллоксановым диабетом (экспериментальная группа №2)
Экспериментальными исследованиями было установлено, что аллоксановый диабет приводит к разнообразным сдвигам в обмене коллагена в различных органах и тканях [47, 253]. Показано также, что метаболизм коллагена I типа, являющегося количественно преобладающим органическим компонентом остеоида [6, 168, 7], претерпевает разнонаправленные изменения в динамике экспериментального диабета [18, 17, 37]. Многогранность инсулинозависимого диабета и важнейшая структурно-функциональная роль коллагена I типа в обеспечении прочностных свойств кости во многом побуждает к дальнейшему изучению патогенетических феноменов, наблюдающихся в костной ткани и сопровождающих течение экспериментального аллоксанового диабета.
Анализируя результаты нашего исследования, мы можем отметить общие черты, характеризующие метаболизм коллагена во всех трех экспериментальных группах. Во-первых, аллоксановый диабет у крыс вызывает увеличение интенсивности метаболизма, затрагивающего костный коллаген, при этом активизируются и катаболические и анаболические процессы. Во-вторых, интенсивность анаболизма в костной ткани в ходе эксперимента преобладала над деградирующими процессами или была ими уравновешена. В-третьих, подчеркивая роль коллагена I типа в поддержании минерального гомеостаза, выявлена потеря костной тканью кальция и фосфора.
Между тем, различия, выявленные в показателях обмена костного коллагена между экспериментальными группами, порождают ряд вопросов. Предложенные в качестве вероятных причин патогенетические механизмы, обуславливающие сдвиги в обмене коллагена, требуют дальнейшего тщательного изучения. Рассматривая наше исследование, в подтверждении нуждаются причины, обуславливающие сравнительно высокий уровень катаболизма и анаболизма в костной ткани животных экспериментальных групп №2 и №3 по сравнению с крысами с «изолированным» диабетом.
Перспективным направлением будущих исследований на данную тему следует признать изучение роли кальций-регулирующих гормонов в патогенезе изменений обмена коллагена I типа в костной ткани в динамике аллоксанового диабета. На наш взгляд, приоритет подобных изысканий обусловлен рядом причин. Одна из них – неустановленная ясно физиологическая роль кальцитонина [173, 203, 169, 141], неопределенная тем более в динамике аллоксанового диабета. Отсутствие достоверных различий в концентрации общего кальция плазмы крови животных, выраженные обменные сдвиги в метаболизме костного коллагена и нарушение минерального гомеостаза в костной ткани подопытных крыс экспериментальных групп №1 и №2 по сравнению с контролем – в нашем эксперименте – позволяют допустить высокую вероятность развития гиперпаратиреоза. В то же время, наблюдения показывают, что у больных СД может иметь место функциональный гипопаратиреоз [57, 243] либо нормальный уровень ПТГ и не отличающаяся от контроля концентрация ионизированного кальция в крови [55]. Два последних обстоятельства ясно указывают на необходимость изучения патогенетических эффектов ПТГ на обмен коллагена I типа в динамике экспериментального инсулинозависимого диабета. Не менее важным представляется также количественный анализ взаимосвязи специфичных показателей обмена костного коллагена с концентрацией кальций-регулирующих гормонов в плазме крови и в костной ткани. В свете выше изложенного, интересным будет изучение состояния тканевых рецепторов рассматриваемых гормонов при аллоксановом диабете, как модуляторов их биологических эффектов.
Разнонаправленные фазные изменения активности тканевых коллагенолитических ферментов в динамике аллоксанового диабета и под влиянием сульфатированных ГАГ и глюконата кальция несомненно представляют большой научный интерес. Рассматривая данный аспект как звено в патогенезе изменений в обмене коллагена I типа костной ткани, небезынтересным является количественное определение активности ММП и их тканевых ингибиторов, а также остеокластического коллагенолитического фактора катепсина К с применением более специфичных методов. Кроме того, немаловажным видится изучение взаимосвязи количества цинка и кальция в костной ткани при аллоксановом диабете (кофакторы ММП [126, 30]) с активностью ММП и действием их тканевых ингибиторов.
Подытоживая, следует ещ раз подчеркнуть важнейшую роль коллагена I типа в обеспечении механической прочности кости. Особенности его строения – наличие «жсткой» стержневой спиральной структуры, обращнные кнаружи боковые цепи аминокислот, входящих в состав его суперспирали – создают уникальный потенциал для взаимодействия с богатым, разнообразным белковым содержимым костной ткани [239], делают этот фибриллярный белок каркасом для отложения на нм впоследствии фосфорно-кальциевых солей [187, 92, 203].
Таким образом, характерная для коллагена I типа механическая прочность, высокая способность к взаимодействию с множеством макромолекул, его важнейшая роль в обеспечении свойств костной ткани делают костный коллаген перспективным объектом для последующих научных исследований, посвященных патогенезу диабетической остеопатии.