Влияние гистидинсодержащих дипептидов на функциональные свойства Сa-каналов саркоплазматического ретикулума Батрукова, Марина Алексеевна

Введение к работе

Актуальность темы. Саркоплазматический ретикулум (СР)
скелетных мышц играет ключевую роль в регуляции мышечного
сокращения. Он представляет собой замкнутую систему мембранных
цистерн и трубочек, пронизывающих саркоплазму вблизи
миофибрилл. СР скелетных мышц представлен двумя морфологически
и функционально различающимися структурами - продолговатыми
трубочками (легкая фракция СР), расположенными вблизи
миофибрилл, и терминальными цистернами (тяжелая фракция СР),
которые контактируют с трансверзальными трубочками сарколеммы
и соединяются с ними посредством особых структур - так
называемых «соединительных ножек». Основным белковым
компонентом продолговатых трубочек является Са-АТФаза,

осуществляющая АТФ-зависимую аккумуляцию Са²⁺ внутрь везикул СР. Терминальные цистерны содержат Са-каналы и обеспечивают быстрый выброс Са²⁺ из ретикулума (Martonosi, 1984; Inesi, 1985).

В 1987 г. из тяжелой фракции СР скелетных мышц и сердца был выделен белок, названный рианодиновым рецептором (RyR), так как он с высоким сродством и специфичностью связывается с алкалоидом рианодином (Imagawa et al., 1987; Inui et al., 1987). Было установлено, что RyR в морфологическом отношении представляет собой белок «соединительных ножек» (Lai et al., 1988; Wagenknecht et al., 1989), а функционально - Са-канал СР (Lai et al., 1988; Smith et al., 1988). Наиболее известными активаторами RyR являются адениловые нуклеотиды, кофеин и ионы Са²⁺ в микромолярных концентрациях, а ингибиторами - рутениевый красный и ионы Mg²⁺ (Smith et al., 1986; Coronado et al., 1994). При регистрации одиночных каналов проводимость Са-каналов для Са²⁺ составляет около 120 pS (Smith et al., 1988). У млекопитающих RyR представлен тремя изоформами, кодируемыми разными генами и обладающими разной первичной структурой и свойствами. Первая изоформа (RyRl) присутствует в скелетных мышцах, вторая (RyR2) - в сердце, третья (RyR3) - в головном мозге и гладкой мускулатуре (Marks et al., 1989; Otsu et al., 1990; Hakamata et al., 1992).

После открытия Са-каналов и выяснения их роли в
функционировании скелетной мускулатуры стал понятен механизм
действия многих физиологически активных соединений. Так, было
показано, что кофеин увеличивает чувствительность

демембранированных мышечных волокон к Са²⁺ (Harrison et al.,
1985), а при добавлении его к изолированным мышечным

препаратам он сам вызывает мышечную контрактуру (Sandow and Brust, 1966). Кроме того, он увеличивает напряжение, развиваемое утомленными мышечными препаратами (Lannergren and Westerblad, 1989). Оказалось, что все эти эффекты связаны с активирующим

действием кофеина на Са-каналы СР. Сходным физиологическим
действием на мышечные препараты обладает дипептид карнозин,
который, в отличие от кофеина, является эндогенным соединением
и присутствует в цитоплазме мышечных клеток в миллимолярных
концентрациях (Crush, 1970; Abe, 1995). Карнозин, подобно кофеину,
увеличивает чувствительность демембранированных мышечных
волокон к Са²⁺ (Harrison et al., 1985), а также повышает
работоспособность (особенно при утомлении) изолированных
мышечных препаратов (Crush, 1970; Петухов и др., 1976). Карнозин в
составе скелетной мускулатуры был открыт в 1900 г., (Gulevitsch and
Amiradzibi, 1900), позднее в скелетной мускулатуре были найдены
его метилированные производные анзерин (Ackermann et al., 1929) и
офидин, также называемый баленином (Imamura, 1939), в головном
мозге был обнаружен гомокарнозин (Pisano et al., 1961), а в сердце
- ацетилкарнозин (Sobue et al., 1975). Карнозин и анзерин
практически не участвуют в традиционных путях метаболизма
мышечной ткани, и их роль в мышечной клетке окончательно не
установлена. Однако в онтогенезе карнозин появляется в мышцах к
моменту замыкания рефлекторных дуг и формирования
координированной двигательной активности и исчезает при
денервации мышцы, что позволяет говорить о том, что эти
дипептиды, по-видимому, имеют большое значение для

функционирования скелетной мускулатуры (Северин, 1954;
Добрынина, 1967). К другим свойствам карнозина, определяющим его
роль в клетке, относятся способность активировать некоторые
ферменты гликолиза (Наградова, 1958; Jenks and Hyatt, 1959; John
son and Aldstack, 1984) и связывать ионы металлов переменной
валентности (Davey, I960; Chikira and Mizukami, 1991), а также его
антиоксидантноe действие (Дупин, 1987; Boldyrev et al., 1988). Кроме
того, карнозин представляет собой буфер, компенсирующий

закисление, которое возникает в ходе мышечной работы (Bate-Smith, 1938; Skulachev, 1978).

Поскольку карнозин и кофеин обладают сходным действием на мышечные препараты и эффект кофеина определяется его способностью активировать Са-каналы СР, мы предположили, что действие карнозина на мышечные препараты также может быть связано с его влиянием на Са-каналы СР.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось исследование влияния карнозина на функционирование Са-каналов СР, для чего были поставлены следующие задачи:

1. Выделить препараты тяжелого СР, содержащие функционально активные Са-каналы;

2. Оценить возможность прямого активирующего действия карнозина на Са-каналы СР;

3. Исследовать влияние карнозина на взаимодействие Са-каналов СР с другими модуляторами их активности;

4. Исследовать рН-зависимость действия карнозина на Са-каналы СР;

5. Проанализировать влияние карнозина на разные изоформы RyR.

Научная новизна работы. В настоящей работе впервые показано, что карнозин и родственные соединения активируют чувствительные к рутениевому красному Са-каналы СР скелетных мышц и сердца.

Исследование влияния карнозина на взаимодействие Са-каналов СР скелетных мышц с другими регуляторами их активности показало, что карнозин увеличивает активирующее действие адениловых нуклеотидов и кофеина и снижает ингибиругощее действие низких концентраций Mg²⁺. Установлено, что карнозин расширяет диапазон активирующих концентраций ионов Са²⁺. Аналогичным действием на Са-каналы СР сердца обладает ацетилкарнозин.

Определена рН-зависимость активирующего действия карнозина на Са-каналы. Установлено, что активирующее действие карнозина возрастает при закислении среды. Это позволяет предположить, что активатором Са-каналов может быть протонированная форма карнозина. Таким образом, карнозин может защищать Са-каналы СР от инактивации при закислении, возникающем в ходе мышечной работы.

Установлена роль различных функциональных групп молекулы карнозина в обеспечении его активирующего действия на Са-каналы СР скелетных мышц кролика. Показано, что анзерин (1-метил-карнозин) и карцинин (декарбоксилированный карнозин) действуют на Са-каналы более эффективно, чем карнозин. Активирующая способность офидина (3-метил-карнозин) и ацетилкарнозина снижена по сравнению с карнозином. Гомокарнозин (у-аминобутирил-Ь-гистидин) и карнозин действуют на Са-каналы практически одинаково.

Показано также, что карнозин и ацетилкарнозин более эффективно активируют Са-каналы СР тех тканей, в которых они присутствуют в качестве эндогенных соединений: карнозин более эффективен в случае СР скелетных мышц, а ацетилкарнозин - СР сердца.

Практическая значимость работы. Проведенные исследования расширяют представления о способах регуляции активности Са-каналов СР и о роли гистидинсодержащих дипептидов в мышечной ткани. Подходы, использованные в данной работе, а также полученные результаты могут использоваться при изучении функциональных особенностей Са-каналов СР. В частности, способность карнозина изменять сродство Са-каналов СР к другим модуляторам их активности необходимо учитывать при определении

параметров транспорта Са²⁺ в мышечных клетках и проводить эксперименты in vitro в присутствии физиологических концентраций карнозина, т.е. в условиях, по возможности приближенных к естественным. Результаты данной работы используются при чтении курса лекций по биохимии мембран на кафедре биохимии Биологического факультета МГУ, а также при организации практической экспериментальной работы студентов и аспирантов кафедры.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на
научном семинаре кафедры биохимии биологического факультета
МГУ, на Первой Российско-Британской конференции по мембранной
биоэнергетике (Southampton, 1992), на Международной

конференции аспирантов и студентов по фундаментальным наукам "Ломоносов-96" (Москва, 1996) и на Всероссийской конференции "Прикладные аспекты исследования скелетных, сердечных и гладких мышц" (Пущино, 1996).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 работы.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения,
обзора литературы, описания материалов и методов исследования,
результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка
цитируемой литературы. Работа содержит стр. машинописного