Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ
В настоящее время исследователями накоплен большой материал по механизмам секреции полипептидов в бактериях. Наиболее значительная часть исследований касается роли в этих процессах сигнальных пептидов. Известно, однако, что зрелая часть некоторых белков может играть важную роль в процессах их секреции. В последнее время интерес исследователей к проблеме влияния зрелой части секретируемьгх белков на их секрецию значительно возрос. Так, показано, что замена гидрофобных остатков зрелой части на гидрофильные может блокировать секрецию некоторых белков (Robertson et al., 1994). Показано также, что определенные мотивы первичной последовательности в зрелой части белка могут существенно влиять на способность белка быть сскретированным. Предполагается, что эти части первичной последовательности играют определяющую роль в принятии пресекреторным белком конформации, способной транслоцироваться (Cheah et al., 1994).
Интересную модель для изучения роли зрелой части белка в его секреции представляет из себя внеклеточная рибоїгуклеаза Bacillus intermedius 7Р (биназа). Биназа является в настоящее время интенсивно изучаемым белком. Ее ген проклонирован в E.coli. Трехмерная структура биназы определена методом рентгеноструктурного анализа, и проведено соотнесение сигналов ее ЯМР - спектра с первичной последовательностью.
Биназа является небольшим белком, без дисульфидных связей, секретирующимся как в нативном штамме-продуценте, так и в рекомбинантных штаммах E.coli, во внешнюю среду. Видимо, биназа, как и некоторые другие внеклеточные нуклеазы, принадлежит к "самосекретирующимся" белкам. Тот факт, что нуклеазы и многие другие внеклеточные белки могут секретироваться в ростовую среду клетками граммотрицательных бактерий - рекомбинантными штаммами E.coli, свидетельствует, что определенная информация, необходимая для секреции этих белков, содержится в самой
последовательности белка и для секреции последнего не требуются дополнительные белковые факторы (И.Б.Лещинская и др. 1991) Несомненно, что гидрофобные аминокислоты зрелой части белка должны играть большую роль в реализации этой информации. Представляет большой интерес выяснить эту роль гидрофобных аминокислот. Компьютерный структурный анализ и сайт-специфический мутагенез могут дать принципиально новую информацию о механизмах влияния отдельных гидрофобных аминокислот в зрелых частях белков на их способность к секреции.
Целью данной работы было выяснение механизмов влиянии гидрофобных аминокислот в зрелой части сегрегируемых белков на их секрецию на примере бшшзы, в сравнении с препромелиттнном и гормоном роста человека. В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:
1. Провести исследование гидрофобных взаимодействий с
участием некоторых гидрофобных аминокислотных остатков (Тгр)
методом ЯМР.
2. Провести сайт - специфический мутагенез биназы по остаткам
триптофана.
3. Исследовать влияние мутаций по остаткам триптофана на
секрецию биназы.
4. Провести сравнительный компьютерный анализ особенностей
структур препромслитгина, гормона роста человека и биназы с точки
зрения ігх влияния на секрецию.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ Впервые проведен сравнительный компьютерный анализ структур зрелых частей полипептидов, влияющих на их секрецию, для таких белков, как препромелигтин, гормоны роста и внеклеточная щелочная рибонуклеаза Bacillus intermedius 7Р. Обнаружено, что зрелые части белков, для которых показано их влияние на секрецию, состоят из амфифильных вторичных структур. На основании
компьютерного анализа и исследований методов ЯМР показано, что остаток Тгр34 биназы участвует в формировании вторичных структур амфифильной природы, которые могут влиять на секрецию белка.
Методом сайт-специфического мутагенеза показано, что замена остатков Тгр34 и Тгр70 па менее гидрофобные остатки (Asp) блокирует секрецию биназы в клетках E.coli.
Основные положения диссертационной работы были доложены на 16 Международном конгрессе по биохимии и молекулярной биологии (Нью Дели, 1994 ), VI Конференции Российской Федерации "Новые направления биотехнологии" (Пущино, 1994 ), Первом Евроазийском симпозиуме по современным достижениям в биотехнологии (Анкара, 1995).