Содержание к диссертации
Список сокращений стр.4
Введение " 5
Гл.1- Обзор литературы:
I.I. Общие сведения о структуре фоторецепторной клетки "10
1.2 Транспортные АТФазы " 15
1.2.1. Краткие сведения о НаД-АТФазе 15
1.2.2. Краткие сведения о Ca,Mg -АТФазе "23
1.3. АТФазные системы и активное накопление иона кальция в фоторецепторной клетке 32
1.3.1. Наличие АТФазных систем в фоторецепторной клетке. 32
1.3.2. Перемещение иона Са в фоторецепторной клетке 36
Гл.2- Материал и методы исследования:
2.1. Получение различных препаратов фоторецепторной клетки,их характеристика, "42
2.1.1. Выделение НСП и ВШ "42
2.1.2. Получение разрушенных препаратов НСП " 43
2.1.3. Получение везикул НСП и ВСП. , • І " 43
2.1.4. Характеристика полученных препаратов " 44
2.2.0пределение активности На,К-, Mg -, Ca,Mg-,
Са-АТФаз и количества неорганического фосфата " 47
2.3.Определение активности К-зависимой уабаин-чув ствительной п-нитрофенилфосфатазы 48
2,4.Определение АТФ-зависимого накопления иона Са 49
2.5.Индукция перекисного окисления яипидов "50
2.6,Использованные реактивы, препараты и приборы. " 50
2.7.Статистическая обработка "
Гл.З -Результаты исследований
3.1. Локализация На,К- и Mg -АТФаз в фоторецед торной клетке палочки, "52
3.2. О латентной Иа,К-АТФазе наружных сегментов палочки сетчатки "60
3.2.1. Влияние разрушения структуры наружных сегментов(гипотоническим шоком) на На,К-АТФазную активность, , " 60
3.2.2. Влияние люброла на На,К-АТФазу. ,: " 63
3.3. Локализация Ca,Mg- и Са-зависимой АТФаз в фоторецепторной клетке "71
3.4. АТФ-зависимое накопление Са в фоторе - цепторной клетке І "79
3.5. Влияние освещения на Па,К- и Mg -АТФазные активности фоторецепторной клетки, " 91
3.5.1. Фотоиндуцированные изменения активности АТФазных систем "91
3.5.2. Возможные механизмы фотоиндуцированных изменений ферментативной активности "95
Обсуждение 100
Выводы 107
Список использованной литературы
Введение к работе
В основе функционирования фоторецепторных клеток сетчатки лежат ионные перемещения в наружных сегментах, в частности палочек, являющихся первичными акцепторами световых квантов и состоящих из стопки так называемых дисков, окруженных наружной мембраной. Распределение потенциалообразующих ионов в этих структурах носит своеобразный характер. Во внутридисковом пространстве ион На значительно преобладает над ионом К,т.е. состав среды подобен внеклеточной среде, в меж дисковом же пространстве соотношение ионов На и К типично для внутриклеточного состава( Etingof et аі.,І970;Берман и др.,1971).Следует полагать, что для поддержания градиента кониентращи ионов на мембране диска необходима как обычно, На,К-АТФаза.Однако данные о наличии и уровне активности этой ферментной системы в НСП противоречивы.Имеются указания и об относительно высокой активности На,К-АТФазы в этих структурах (Собота и др.,1972; Hendriks et al .,1973; Prank et al., 1973)и о почти полном отсутствии фермента в них( Bownds, 1974; Берман,1975),Отдельные указания свидетельствуют о наличии в НСП латентной формы На,К-АТФазы, т.е. формы, выявляемой лишь после специальной обработки мембран(Собота,1973; Hemminki ,1974,1975а).
В результате поглощения кванта света зрительным пигментом родопсином, в случае палочки сетчатки, уменьшается На проницаемость наружной мембраны клетки и соответственно изменяется ее биоэлектрическая активность. Поскольку диски, в которых сосредоточен родопсин, пространственно отдалены от наружной мембраны, необходимы какие-то пути передачи сигнала с диска на наружную мембрану; Согласно одной из наиболее распространенных гипотез о механизме возбуждения фоторенепторной клетки, функцию медиатора, обеспечивающего передачу сигнала, выполняет ион кальция ( Hagins ,1972).Автор полагает,что как в случае с ионами.
К, имеется градиент концентрации Са на мембране диска; его содержание существенно отличается во внутри- и меж дисковых пространствах. При освещении изменяется проницаемость мембраны диска и часть ионов из диска попадает в междисковое пространство. Эти ионы блокируют натриевые поры наружной мембраны, что приводит к фоторецепториой клетки.
Считают, что поддержание градиента концентраций Са на мембране диска и восстановление его содержания в фазу темновой адаптации обеспечивает Ca,Mg -АТФаза.Между тем наличие этого фермента в НСП не обнаружено( Ostwald and Heller ,1972; Bonting , 1976; Saek and Harries ,1977),но этими же авторами показано наличие в дисках Са-зависимой АТФазы,которая по-видимому,также может выполнять роль Са-насоса.Весьма противоречивы данные и об изменениях содержания иона кальция в НСП при ocBeuieiffiH(Bownds et al. 1971; Hendriks et al. ,1977; Smith, 1979; Шевченко и др., 1981) и о возможности его активного накопления в дисках( Neu-feld, I972;Hemminki, ,1975в;Hendriks et al. ,1977; Schnet-kamp ,1979).
Рядом авторов отмечены фотоиндуцированные изменения активности 1Та,К-,Са- , Mg -АТФаз в НСП( Scarpelli and Craig ,1963; Островский и Федорович,1965; Ostwald and Heller ,1972; Собота, 1973; Hemminki ,1975).Возможность таких изменений может рассматриваться как свидетельство локализации Па, К-АТФазы в НСП.Механизм изменений активности фермента при освещении не известен.
Учитывая трудности получения чистых фракций НСП,нельзя исключить,что в некоторых работах исследуемые препараты могли содержать примеси других мембранных фрагментов,что могло отражаться на получаемых результатах.
Таким образом, ряд центральных вопросов, касающихся транспортных АТФаз фоторецепторной клетки сетчатки, оставался к моменту настоящих исследований спорным и малоизученным. Основная цель настоящей работы состояла в изучении транспортных АТФаз, в частности их локализация в фоторецепторной клетке сетчатки. В связи с этой целью были поставлены следующие задачи:
I) решить вопрос о локализации на,К- , Ca,Mg -, Са-АТФаз в фоторецепторной клетке. Для этого нужно было получить различные по чистоте фракции НСП,а также,оценить эти фракции по их маркерам(для НСП -родопсин, для ВСП-СДТаза) и сравнить распределение маркеров по отдельным субфракциям с распределением в них транспортных АТФаз;
2)проверить наличие латентной формы Па,К-АТФазы в НСП и в случае отсутствия такой формы фермента, выяснить по возможности причину её выявления другими авторами.
3) изучить вопрос о наличии и локализации активного транспорта Са в фоторецепторной клетке, сопоставив эти данные с распределением в клетке Ca,Mg -АТФазы;
4) выяснить возможный механизм фотоиндуцированных изменений активности На,К-АТФазы в фоторецепторе.
Научная новизна определяется новыми подходами к изучению спорных вопросов о транспортных АТФазах фоторецепторной клетки. Эти подходы заключались в следующем был проведен подробный сравнительный анализ чистоты получаемых фракций: с их ферментативной активностью, что позволяло более точно оценить наличие фермента в отдельных фракциях было сопоставлено наличие фермента(Са,Mg-АТФазы) в отдельных фракциях с работой ионной помпы(Са-помпы) в них, что увеличивало степень достоверности исследований; на основе особенностей липидного состава фоторецепторных мембран и роли их отдельных компонентов в регуляции активности ряда ферментов был проанализирован вопрос о причинах фотоиндуцированных изменений Иа,К-АТФазы; методические приемы, применяемые при работе с латентной формой фермента, были тщательно проконтролированы для учета возможных ошибок.
В результате использования этих подходов удалось доказать, что На,К- , Ca,Mg - и Са-АТФазы в фоторецепторе локализованы в области ВСП.Эти ферменты в НСП не обнаружены.
В НСП отсутствует и латентная форма На,К-АТФазы;полученные ранее полошітельные данные по этому поводу(Hemminki ,1974,1975) объясняются различными методическими погрешностями. Показано, что в в области ВСП происходит АТФ-зависимое накопление иона кальция.
Фотоиндуцированные изменения активности На,К-АТФазы в условиях in vitro объясняются усилением при освещении образования продуктов ПОЛ в НСП,которые подавляют активность фермента,сосредоточенного в ВСП. Оказалось,что эти изменения могут быть предотвращены при добавлении в среду инкубапип антиоксидантов.
Таким образом,полученные данные в целом показали,с одной стороны,крайне выраженную биохимическую специализацию ПМ фоторе-цепторной клетки( Иа,К-АТФаза локализована в области ВС, в области НС-отсутствует) и, с другой,выявили возможность взаимодействия между внутренним и наружным сегментами фоторецептора(регуляция активности На,К-АТФазн в ВСП при помощи ПОЛ из НСП).Кроме того,полученные факты поставили под сомнение одан из основных постулатов " Са-гипотезы" возбуждения( Hagins ,1972) о наличии "Са-помпы" непосредственно в НСП.
Полученные результаты показали принцип распределения транспортных АТФаз в фоторецепторе сетчатки, что важно для расшифровки механизмов поддержания градиента концентраций в этой клетке и, соответственно, понимания основ их функционирования. Данные о биохимической гетерогенности наружной мембраны фоторецепторной клетки перспективны для изучения в этом плане и других экстраклеточных ферментов с целью выявления, возможно, общих принципов их биохимической организации. Выяснение значимости продуктов ПОЛ в качестве возможных регуляторов активности Иа,К-АТФазы и роли ПОЛ как компонентов, обеспечивающих передачу сигнала из одной области клетки в другую, конкретизируют и расширяют наши представления о роли липидных компонентов мембран в норме.
В целом, результаты настоящей работы представляют интерес для специалистов, работающих как в области биохимии и биофизики рецепторних процессов, так и в области исследования структуры и функции мембран. Полученные факты могут быть использованы в соответствующих курсах лекций.