Введение к работе
Актуальность проблемы. Согласно современным представлениям иенам Са принадлежат исключительно важная роль в обеспечении контроля сократительной активности гладких мышц, в че.стнвети, миокетрия. В связи с атим принципиальное значение приобретает изучение путей и механизмов регуляции концентрации ионизированного кальция б глйдкокьигеч-ных клетках (ГМК).
В клетках гладких мынц и других возбудимых тканей концентрации ионизированного Са не 'k порядка ниже, чем по внеклеточной среде, в связи с чем для клвточноЯ мембраны характерен большой электрохимический кальциевый градиент, направленный внутрь миоцитов. Очевидно, что с целью поддержания низкой концентрации свободного Са в цитозоле в течение длительного времени необходима компенсация входящего через плазматическую мембрану (ИМ) кальциевого тока выходящим потоком этого катиона, т.к. Са-аккукулирувщая способность внутриклеточных орга-нелл ограничена.
Плазматической менйроне принадлежит важная роль в поддержании кальциевого гомеостаэа миоцитов матки» Этой мембране присуща базальная кальциевая проницаемость, проявляющаяся в наличии транссарколем-мального медленного диффузионного входа Се в шбциты, а такме проницаемость, обусловленная функционированием специфических белковых структур - Са -селективных каналов, регулируемых мембранным потенциалом и физиологически актирными веществами. Кроме того в отой субклеточной структуре локализованы системы знергозависимого транспорта Са , обеспечивающие его перенос из миоцитов в межклеточное пространство - Мд ,АТР-затасимый кальциевый насос и Na+-Ca +~обмєнник, использующий энергию электрохимического градиента Ыа+ для антипортной транслокации Саг+(Р.К.ОгоУеґ, C.Y. Kvra.h , I987;L.M.ftip«scu,R!3gnay985).
И если сегодня для миометрия имеются определённые данные о хе-, рактеристиках и роли кальциевых каналов, то представления о свойствах других Са -транспортирующих систем, их функциональной роли в поддержании внутриклеточной концентрации ионизированного Са, чувствительности к действию физиологически активных и фармакологических веществ - регуляторов сократительной ективности матки - далеки от сколь-нибудь законченных.
В опытах, проведенных на везикулах сарколеммы миометрия, было показано, что система 1\Га+-Са +~обмена ПМ ГМК имеет низкое сродство к Са (Kj(p30-5O мкМ), на основании чего было предположено, что она
- 2 -не способна регулировать концентрации субстрата переноса при физиологических значениях последней. В то же время система Мр,,АГР-занионного транспорта Са сарколеммы ГМ обладает высоким сродством к субстрату переноса (Ки=0,3-0,6 мкМ) (С.А.Костерин и др.,1965,1988), Поэтому считают, что Именно оно является фактором прецизионной регуляции физиологически знечимоЕ концентрации Са в ГИК. Однако парциальный вклад каждой ив систем в регуляцию концентрации ионизированного Са в миоцитах матки неизвестен.
Установлено, что неряду с быстрым фазным сокращением, контролируемым входом Са в ГМК по потеициалзашсимым кальциевым каналам, для гладких мышц матки харбктерко также медленное тоническое сокращение. Между тем, механизм кальциевого контроля миогенного тонуса, тонического сокращения не исследован. Логично Предполагать, что сеоГі вклад и.реализаций такого мехенизма могут вносить медленный диффузионный базальний вход Са в ГМК и система Jig +,АТР-зависимого выброса Са из Клеток миокетрия, для которой свойственна небыстрая кинетика транссарколеммального переноса Са . Необходимо подчеркнуть, что свойства медленного пассивного переноса Са через плазматическую мембрану гладкомашечных клеток (действие ингибиторов, потенци-алзоіїюимость, чувствительность к влиянию физиологически активных и фармакологических веществ - регуляторов сокращения-расслабления ГМ) не изучены. Мало что известно и о фармакологической регуляции активности кальциевого насоса плазматической мембраны. Имеющиеся данные о том, что окситоцин, стимулирующий сокращение матки в родах (М.Я&-xandrwa,M.SoEof^ ,1960), может виступать в роли эффектора, непосредственно влияющего на систему Энергоэависимого транспорта Са + в матке (L.M.PopeSCu, 1985; fl.Enyecli, чХ ol., 1989), неполный допускает различное толкование.
Системы, обеспечивающие вход Са в ГМК и выброс катиона в межклеточное пространство исследуются в настоящее время главным образом на везикулированных препаратах ПМ (С. Van Б>геШ1Пео^-Д986), а также на миоцита.х (в суспензии и в культуре)(і>.\хЛ-ЕКі.агоб,Р.Ра^, 1986). Безусловно, особый интерес представляют результаты экспериментов, проведённых на изолированных клетках гладких иышц - экспериментальной модели, в наибольшей степени приближённой к физислогическим условиям (^.Smtthgto! ISB9). По-видимому, именно комплексное изучение Са -транспортирующих систем ГМ как нь фракциях субклеточных структур, так и гепосредствон-ко в миоцитах, позволит сделать полные и окончательные выгоды о молекулярных механизмах работы указанных систем.
Цель и задачи работы. Целью настоящей работы было исследование пассивного и энергозависимого транспорта Са в суспензии клеток и во фракции везикул сарколеммы миометркя, изучение влияния на этот транспорт некоторьх физиологически активных (окситоцин) и фармакологических веществ (сигетин,хинин) - регуляторов сократительной активности матки.
При атом решались следующие задачи{
-
с использованием Са +-чувствительных флуоресцентных зондов Q.WW-2 и FMRA-2 определить концентрацию Са в миоцитах матки, исследовать динамические закономерности кальциевого обмена в них, идентифицировать роль натриевого градиента в регуляции концентрации Са + в миоцитах;
-
изучить свойства пассивного транспорта Са + во фракции везикул1 сарколеммы миометрия (чувствительность к органическим и неорганическим блокаторам кальциевой проницаемости, мембранному потенциалу);
-
исследовать влияние фармакологических веаесгві используемых в медицинской практике в качестве стимуляторов сокращения матки, на Mg ,АТР-зависимый транспорт Са во фракции везикул сарколеммы миометрия.
Научная новизна работы. В экспериментах, проведенных на суспензии изолированных миоцитов и фракции везикул сарколеммы шіометрия с использованием Са -чувствительных, потенциалчувствительных и дрН-чувствитвльных флуоресцентных зондов, а также изотопного ( Са ) метода показано, что для ПМ клеток миометрия характерны трі компонента пассивной кальциевой проницаемости: базальНЫЙ диффузионный (ненасыщаемый по субстрату переноса), потенииалчувствительный (насыщаемый по субстрату переноса) и арН-зйвисимый, Впервые показано, что в нормальных физиологических условиях Na+-Ca -обменник ПМ не вносит вклад в регуляцию концентрации свободного Са в клетках миометрия. Показано, что стимуляторы сократительной активности матки пептидный гормой окситоцин (Ю М) й сигетин (5*10 М) ингибирова-ли Ид +>АТР-зависимый транспорт Са в сарколемме' миометрия женщин и животных, не влияя при этом на пассивную проницаемость ПМ.
Теоретическое и практическое значение работы. В теоретическом отношении проведенные исследования расширяют имевшиеся представления о роли систем пассивного и энергозависимого транспорта Са +, локализованных в сарколемме, в регуляции его концентрации в клетках миометрия, сб особенностях кальциевого контроля тонического сокращения гладкой мышци матки. В практическом отношении полученные результаты
_ і, _
обосновывают использование в практичаокой медицине лекарственных препаратов (окситоодн, сигетин), корректирующих сократительную активность ГМК матки при патологических нарушениях её контрактильного ответа.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуэдены на Международном симпозиуме "Проблемы современной биохимии и биотех-нологии"(Еига, 1965), на Международном симпозиуме "ёиэиологая и фармакология гладких мышц" (Варна,І9Є5; Варна,1988), 5-й и 6-й Всесоюзных конференциях по биохимии мышц (Телави,1985; Тбилиси, 1969), 5-м Всесоюзном биохимической съезде (Киев,1986), 5-м Украинском биохимическом съезде (Ивано-Франковск,1987), Всесоюзной конференции "Биохимия-медицине" (Ленинград,1988), научных конференциях и конкурсе молодых исследователей Института биохимии им.А.В.Палладина АН Украины (Киев,19Є7;1988).
Структура и объём работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (3 главы), результатов экспериментальных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (ЗА отечественных и 193 зарубежных источников). Работа изложена на 150 страницах машинописного текста и иллюстрирована 2 таблицами и 34 рисунками,