Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 15
2.1 Покоящееся состояние клеток M. tuberculosis и латентная туберкулезная инфекция. Патогенез латентного ТБ у человека 15
2.2. Модели латентного ТБ in vivo 20
2.3. Модели латентного туберкулеза in vitro 30
2.4. Методы изучения бактериальных транскриптомов 39
2.5. Механизмы адаптации M. tuberculosis к персистенции и латентному состоянию инфекции. 47
2.6. Реактивация латентного ТБ и факторы, влияющие на «оживление» покоящихся клеток M. tuberculosis 59
2.7. Ингибирование покоящихся клеток M. tuberculosis и предотвращение активации латентной инфекции 72
3. Методы исследования 82
3.1. Объект исследования и условия культивирования 82
3.2. Оценка культивируемости бактерий 82
3.3. Pеактивация «некультивируемых» клеток микобактерий 83
3.4. Микроскопические исследования 83
3.5. Включение радиоактивно меченного урацила в клетки 84
3.6. Определение концентрации АТФ в клетках 85
3.7. Активность эндогенных ДФИ-редуктаз 85
3.8. Транскриптомный анализ методом гибридизации на чипах (microarray) 86
3.9. Полный транскриптомный анализ методом RNA-seq 87
3.10. Количественная ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени (qPCR) 89
3.11. Нозерн-блоттинг 89
3.12. Метод удлиннения праймера 89
3.13. Создание штаммов с гиперэкспрессией малых некодирующих РНК 90
3.14. Определение минимальной ингибирующей концентрации соединений 90
3.15. Оценка антибактериальной активности соединений методом диффузии в агаре 91
3.16. Оценка бактерицидного действия соединений 92
3.17. Определение цитотоксичности соединений 93
3.18. Определение содержания меди в клетках микобактерий. 93
3.19. Экстракция комплексов гидроксопиридинтионов с ионами Cu2+ и их метаболитов из культуры M. tuberculosis 94
3.20. Детекция комплексов НРТ с ионами Cu2+ 94
3.21. Выделение и характеристика резистентных к соединению TP053 мутантных клеток M. tuberculosis 95
3.22. Клонирование, экспрессия и очистка белка Rv2466c 95
3.23. Определение оксида азота NO. 96
3.24. Метаболическая трансформация соединения TP053 в клетках M. tuberculosis 97
3.25. Определение внутриклеточной активности соединений 97
4. Результаты и обсуждение 99
4.1. Модель покоящегося состояния M. tuberculosis в условиях отсутствия калия in vitro и характеристика покоящихся клеток 99
4.1.1. Разработка экспериментальной модели перехода M. tuberculosis в покоящееся состояние in vitro 99
4.1.2. Характеристика покоящихся клеток M. tuberculosis 103
4.2. Изучение профиля транскрипции клеток M. tuberculosis при переходе в состояние покоя в условиях дефицита калия in vitro 112
4.2.1. Транскрипционный профиль клеток M. tuberculosis в состоянии покоя методом гибридизации РНК на микрочипах 112
4.2.2. Транскрипционный профиль клеток M. tuberculosis, утративших способность к колониеобразованию, полученный методом RNA-seq 118
4.2.3. Некодирующий транскриптом 132
4.2.4. Возможные функции малых некодирующих РНК MTS0997 и MTS1338 в метаболизме M. tuberculosis 133
4.3 Изучение профиля транскрипции покоящихся клеток M. tuberculosis при их реактивации и реверсии к росту 140
4.3.1. Метод предельных разведений и его применение для количественной оценки числа реактивировавшихся клеток 140
4.3.2. Реактивация покоящихся НК клеток в культуре 141
4.3.3. Определение уровня метаболической активности в процессе реактивации покоящихся НК клеток M. tuberculosis 146
4.3.4. Изменения транскрипционного профиля реактивируемых клеток M. tuberculosis 147
4.3.5. Верификация изменения уровня транскрипции на ранней стадии реактивации клеток M. tuberculosis из состояния покоя 158
4.3.6. Восстановление целостности 23S рРНК в процессе реактивации покоящихся клеток M. tuberculosis 164
4.4. Поиск ингибиторов покоящихся клеток M. tuberculosis 170
4.5. Активность производных нитротиазолов в отношении покоящихся клеток M. tuberculosis 175
4.6. Активность производных тиазолидинов в отношении покоящихся клеток M. tuberculosis 180
4.7. Активность производных триазеноиндолов в отношении покоящихся клеток M. tuberculosis 184
4.8. Активность производных 1-гидрокси-5-R-пиридин-2 (1H) тионов (НРТ) в отношении покоящихся НК клеток M. tuberculosis и механизм их действия 187
4.8.1. Бактерицидная активность производных гидроксипиридин-тионов в отношении активных и покоящихся клеток M. tuberculosis 187
4.8.2. Особенности профиля транскрипции клеток M. tuberculosis в присутствии НРТ-2b. 196
4.8.3. Аккумуляция Cu2+ в клетках микобактерий в присутствии НРТ 200
4.9. Активность производных тиенопиримидинов (ТР) в отношении покоящихся НК клеток M.
tuberculosis и механизм их действия 210
4.9.1. Бактерицидная активность производных тиенопиримидинов отношении активных и покоящихся клеток M. tuberculosis 210
4.9.2. Роль белка Rv2466c M. tuberculosis в антимикобактериальной активности соединения TP053 218
4.9.3. Образование NO в процессе восстановления TP053 219
4.9.4. Особенности профиля транскрипции клеток M. tuberculosis в присутствии TP053 221
4.9.5. Метаболическая трансформация соединения TP053 в клетках M. tuberculosis 227
5. Заключение 232
Приложение 1. Транскриптом покоящихся клеток M. tuberculosis, полученный методом гибридизации на чипах 235
Приложение 2. Транскриптом покоящихся клеток M. tuberculosis, полученный методом секвенирования РНК 237
Приложение 3. Транскриптом клеток M. tuberculosis, реактивирующих из состояния покоя 287
Приложение 4. Гены M. tuberculosis с существенно повышенным уровнем экспрессии в присутствии НРТ-2b 351
Приложение 5. Гены M. tuberculosis с существенно повышенным уровнем экспрессии в присутствии ТР053 362
Список литературы 368
Благодарности 400
- Модели латентного ТБ in vivo
- Разработка экспериментальной модели перехода M. tuberculosis в покоящееся состояние in vitro
- Бактерицидная активность производных гидроксипиридин-тионов в отношении активных и покоящихся клеток M. tuberculosis
- Метаболическая трансформация соединения TP053 в клетках M. tuberculosis
Модели латентного ТБ in vivo
Исследования патогенеза латентного ТБ у человека могут быть существенно облегчены при помощи моделей с использованием животных, таких как мыши, морские свинки, кролики и приматы. Сразу необходимо отметить, что ни одна существующая на сегодняшний день модель in vivo не иллюстрирует все аспекты патогенеза заболевания из-за значительных различий в сопротивляемости / восприимчивости к инфекции между этими животными и человеком. Кроме того, на характер развития заболевания влияют: широкий спектр видов животных, штаммов M. tuberculosis, использованных для заражения, а также способов инфицирования и доз патогена (Singh & Gupta, 2018). Тем не менее, моделирование инфекционного процесса in vivo несомненно внесло огромный вклад не только в разработку лекарств и вакцин против ТБ, но и идентификацию биомаркеров инфекции, а также в понимание иммунопатогенеза туберкулеза и генетического воздействия организма-хозяина на инфекцию. Остановимся на наиболее популярных в настоящее время моделях латентного туберкулеза in vivo, обсудим их преимущества и недостатки.
Модели на мышах
Мышиные модели латентного ТБ описаны лучше других моделей in vivo, и используются наиболее широко при изучении патогенеза M. tuberculosis, так как позволяют исследовать все механизмы иммунной защиты организма-хозяина, что имеет важнейшее значение для изучения латентной инфекции у человека.
Модель хронического ТБ. В отличие от латентного ТБ у человека, классическая мышиная модель хронической инфекции ТБ характеризуется достаточно высокой бактериальной нагрузкой с прогрессирующей патологией легких и преждевременной смертью животного (Manabe & Bishai, 2000). Традиционно, стабильное количество бацилл в легких мышей в хронической стадии инфекции рассматривается как статическое равновесие, исходя из свидетельства о том, что бактерии в этом состоянии имеют сниженную метаболическую активность и реплицируются крайне медленно (Muoz-Elas et al., 2005). Экспериментальный подход к формированию хронической ТБ инфекции заключается во внутривенном заражении мышей различными дозами M. tuberculosis, после чего при их попадании в легкие начинается процесс деления бактериальных клеток, скорость которого не меняется приблизительно в течение 2-х недель, после чего число клеток в легких стабилизируется остается на одном уровне на протяжении приблизительно 80 дней. Этому состоянию соответствует количество бактерий примерно 4.104 – 4.106 КОЕ в зависимости от начального количества клеток, взятых для инфекции; предполагается, что бактерии находятся в состоянии, близком к покоящемуся. Вероятно, переход в неактивное состояние обусловлен иммунным ответом организма хозяина на инфицирование M. tuberculosis (Sever & Youmans, 1957, Yamamura et al., 1960). Очевидно, что клетки M. tuberculosis при хроническом туберкулезе сохраняют способность к дальнейшему делению. Так, Орм и соавторы (Orme, 1988, Orme, 1995, Cooper et al., 1995) проводили аэрогенную инфекцию мышей низкой дозой бактерий (КОЕ 10) и затем следили за развитием инфекции в течение жизни животных. Сначала наблюдалось деление бактерий в легких, которое сменялось переходом в неделящееся состояние, и на протяжении нескольких месяцев бактерии пребывали в неактивном состоянии. По достижении мышами возраста 18-месяцев туберкулезные бациллы начинали размножаться, что приводило к смерти мышей. Активация размножения бактерий у 18-месячных мышей совпадала с изменениями в иммуном ответе, связянными с возрастом (Cooper et al., 1995, Orme, 1988). Интересно, что микобактерии туберкулеза в легких мышей с хронической инфекцией продолжают размножаться (Gill et al., 2009). Было обнаружено, что специально сконструированный штамм M. tuberculosis содержащий плазмиду, при хронической инфекции терял ее со временем подобно клеткам патогена в процессе деления при отсутствии селекции с использованием антибиотика. Изучение транскрипционного профилиля M. tuberculosis при хроническом ТБ легких у мышей позволило сделать вывод, что бактерии в этом состоянии сохраняют метаболическую активность (Talaat et al., 2007). Тем не менее, в модели хронического ТБ у мышей M. tuberculosis демонстрирует существеную устойчивость к антибиотикам. В частности, резко снижается бактерицидная активность ИН в случае, когда лечение мышей начинается через 42 дня после инфицирования по сравнению с началом лечения в острой стадии инфекции (в интервале от 0 до 14 дня после инфицирования) (Karakousis et al., 2008)
Корнеллевская модель. Маккун и Томпсет из Корнеллевского университета разработали модель олигобациллярной инфекции, в которой мыши, инфицированные M. tuberculosis, получали противотуберкулезные препараты ИН и пиразинамид в комбинации, что приводило к исчезновению бактериальных клеток из легких и селезенки (лечение начиналось в день внутривенного инфицирования мышей и продолжалось 30 дней). Однако, через три недели после окончания 30-ти дневного курса лечения, примерно у трети мышей в тканях вновь появлялись жизнеспособные бактерии (McCune & Tompsett, 1956, McCune et al., 1966). де Вит с соавторами (de Wit et al., 1995), используя большие дозы M. tuberculosis для заражения и низкие дозы пиразинамида для лечения мышей (меньшие, чем в классической Корнеллевской модели), обнаружили, что в течение 12 недель после окончания антибиотикотерапии число культивируемых бацилл снижается примерно в 107 раз (по результатам высевов из органов зараженных мышей на плотные питательные среды).
Однако, при этом количество клеток M. tuberculosis, оцененное по концентрации ДНК, измеренной с помощью ПЦР, уменьшалось всего лишь в 30 раз и оставалось на постоянном уровне в течение 16 недель, что что может указывать на то, что большинство клеток находится в НК состоянии. К сожалению, отсутствуют эксперименты, в которых покоящиеся бактерии в Корнеллевской модели могут быть "реактивированы" in vitro, затрудняет интерпретацию полученных результатов, поскольку можно допустить, что продукт ПЦР образовался благодаря наличию ДНК мертвых клеток, а не покоящихся, и последующее увеличение числа КОЕ при отмене антибиотикотерапии лишь отражает рост и размножение очень небольшого числа жизнеспособных клеток M. tuberculosis, которые сохранились после ее окончания (Kell et al., 1998).
Одной из вариаций Корнеллевской модели является модель с применением мышей с различной генетически обусловленной восприимчивостью к ТБ. Низкодозовая инфекция, вызываемая внутривенным введением мышам около 70 КОЕ M. tuberculosis H37Rv, приводит к хроническому течению заболевания у генетически резистентных мышей линии B6, и к фатальному патологическому процессу в легких генетически восприимчивых мышей линии I/St, что позволяет исследовать как медленно прогрессирующее заболевание с летальным исходом (I/St), так и хроническое заболевание в течение всей жизни (B6) на основе идентичного экспериментального подхода к генетически отличным животным (Radaeva et al., 2005). В модельных условиях, подобных Корнеллевской модели, у мышей обоих линий были продемонстрированы как временное исчезновение культивируемых бактерий из легких и селезенки в результате химиотерапии, так и их повторное появление в органах после ее прекращения. Однако, у мышей линии I/St реактивация происходила значительно раньше, чем у мышей линии B6, и мыши линии I/St продемонстрировали 100% рецидив туберкулеза после отмены лечения и 100% смертность, тогда как, тогда как у мышей линии B6 смертность не превышала 50%, и у некоторых животных микобактерии не были обнаружены после отмены антибиотикотерапии. Таким образом, мыши линии I/St с их генетически обусловленной восприимчивостью к ТБ представляют собой инструмент для моделирования рецидива ТБ после отмены антибиотикотерапии.
Несмотря на применение Корнеллевской модели для изучения механизмов иммунного ответа при латентном ТБ (Scanga et al., 1999), более точно ее можно описать как модель персистенции M. tuberculosis, поскольку в данном случае инфекция с низкой бактериальной нагрузкой достигается применением антибиотиков, а не механизмами иммунного регулирования.
Модель иммунного сдерживания инфекции. В последние годы активно разрабатывалась мышиная модель сдерживания инфекции M. tuberculosis посредством иммунитета хозяина, в которой можно было бы избежать проблемы высокой бактериальной нагрузки на легкие, приводящую к преждевременной смерти инфицированных мышей. В наиболее успешном варианте данной модели мышам вводили рекомбинантный штамм БЦЖ с гиперэкспрессией основного секреторного белка 30 кДа в форме аэрозоля (Horwitz & Harth, 2003), а через 6 недель заражали вирулентным M. tuberculosis (Zhang et al., 2009), что приводило к стабильному содержанию бацилл в легких на уровне 104, т. е. бактериальной нагрузке, соответствующей латентному ТБ у человека (Opie & Aronson, 1927). Позднее эта модель была перенесена на мышей линии C3Heb/FeJ, у которых развиваются некротические гранулемы легких, и инфекция может повторно активироваться под действием антител к фактору некроза опухолей- (Dutta et al., 2014). Несомненно, данная модель отличается от латентного ТБ человека тем, что для иммунной регуляции и наличия олигобациллярной, бессимптомной инфекции мышам была необходима предварительная вакцинация БЦЖ.
Разработка экспериментальной модели перехода M. tuberculosis в покоящееся состояние in vitro
Для изучения особенностей персистенции M. tuberculosis необходимо было разработать надежную и адекватную модель перехода клеток M. tuberculosis в состояние покоя in vitro, которая была бы свободна от недостатков, характерных для уже известных к настоящему времени моделей покоя, а свойства получаемых покоящихся клеток в данной модели были бы максимально приближены к свойствам возбудителя туберкулеза в состоянии латентной инфекции в организме хозяина. Эти свойства включают: существенно сниженную способность покоящихся клеток культивироваться на стандартных средах, низкий уровень метаболической активности, значительную их резистентность к противотуберкулезным препаратам, а также морфологические отличия по сравнению с вегетативными клетками M. tuberculosis. В ходе длительной работы по подбору условий для получения покоящихся клеток in vitro, характеризующихся вышеперечисленными свойствами, было протестировано большое количество разнообразных стрессовых факторов.
Было обнаружено, что большинство из них либо не приводили к индукции состояния покоя у микобактерий туберкулеза, либо вызывали необратимую гибель клеток. В частности, лимитирование M. tuberculosis по основным питательным компонентам – углероду, азоту и фосфору не вызывало переход бактерий в состояние покоя («некультивируемости»), а, как и ожидалось, вызывало их гибель. В ходе работы по подбору условий индукции покоящегося состояния у M. tuberculosis было обнаружено, что эквимолярная замена ионов калия на ионы натрия в стандартной синтетической среде Сотона вызывала постепенное снижение способности M. tuberculosis культивироваться на стандартных плотных средах. Из рис. 2 видно, что снижение числа КОЕ при высеве на плотные среды начинало происходить уже через 11-12 суток с момента начала культивирования M. tuberculosis на среде Сотона, не содержащей калия, а через 40 суток с момента начала культивирования M. tuberculosis на среде Сотона, не содержащей калия, и содержащей все необходимые ростовые добавки (рис. 2А), число КОЕ снижалось более чем на 4 порядка, то есть 99.99% клеток переходило в состояние покоя, в культуре полученных покоящихся «некультивируемых» (НК) клеток присутствовала субпопуляция активных клеток, соответствующая приблизительно 103 клеток/мл. Хотя эта минорная субпопуляция составляла не более 0.01% от общего числа клеток в культуре, была поставлена задача элиминировать ее и получить культуру покоящихся НК клеток M. tuberculosis, характеризующуюся полной утратой способности к образованию колоний (КОЕ=0).
С этой целью был использован подход, заключающийся во внесении антибиотика рифампицина в умеренной концентрации (5 мкг/мл) в культуру клеток M. tuberculosis, находящихся в условиях дефицита калия. Рифампицин, как известно, обладает значительной бактерицидной активностью в отношении клеток M. tuberculosis, являясь одним из препаратов первой линии для лечения туберкулезной инфекции, однако известно, что подобная невысокая концентрация не оказывает воздействия на покоящиеся клетки (Deb et al., 2009), что позволяет элиминировать вегетативные клетки микобактерий без ущерба для покоящихся клеток со сниженной способностью к колониеобразованию.
Через 15 дней культивирования, когда падение КОЕ при росте на среде, не содержащей калия, приобретало устойчивый характер, в среду роста вносился рифампицин в концентрации 5 мкг/мл (рис. 2Б). Через 10 суток в присутствии рифампицина (или 25 суток от начала культивирования) число КОЕ в культуре падало до нуля и клетки полностью теряли способность образовывать колонии при высеве их на питательную среду нормального состава. Полученная популяция покоящихся («некультивируемых») клеток с нулевым числом КОЕ сохраняла высокий потенциал реактивации при внесении калия в среду (Рис. 2Б). При проведении процедуры реактивации НК клеток с КОЕ=0 путем переноса их в свежую среду Сотона нормального состава (содержащую калий и другие ростовые добавки) и подсчете максимального числа жизнеспособных клеток в культуре покоящихся клеток с КОЕ=0 методом конечных разведений (МКР) наиболее вероятное число (НВЧ) жизнеспособных клеток составляло не менее 107 кл/мл (Рис. 2Б), что сопоставимо с концентрацией исходной культуры до перехода в покой.
Таким образом, удалось разработать экспериментальный подход in vitro для получения покоящихся клеток M. tuberculosis в условиях дефицита калия, характеризующихся полной потерей колониеобразующей способности (КОЕ=0) с высокой долей потенциально жизнеспособных, культивируемых клеток (не менее 107кл/мл). Данное состояние было обратимым – «некультивируемые» клетки восстанавливали способность расти и размножаться при внесении калия в среду. Полученная модельная система in vitro характеризуется хорошей воспроизводимостью, является достаточно экспериментально удобной и, учитывая то, что объект является медленнорастущим организмом, не требует значительных временных затрат.
Бактерицидная активность производных гидроксипиридин-тионов в отношении активных и покоящихся клеток M. tuberculosis
В ходе скрининга было обнаружено, что ряд оригинальных производных класса гидроксипиридинтионов (НРТ) обладал активностью в отношении клеток M. tuberculosis. Пять соединений из этой серии (рис. 30) характеризовались значениями МИК 4 мкг/мл, причем три соединения из этой серии, содержащих окисленный атом азота в пиридиновом кольце, показали значения МИК в интервале 0,25-0,75 мкг/мл в отношении активнорастущих клеток M. tuberculosis (табл. 8).
Было обнаружено, что производные НРТ активны не только в отношении делящихся, но и покоящихся клеток M. tuberculosis, полученных в модели дефицита калия в среде и имитирующих персистирующую ТБ инфекцию. Так, инкубация НК клеток M. tuberculosis с 10 мкг / мл соединения 11026115 в течение 7 дней приводила к падению жизнеспособности более чем на 3 порядка хотя, как уже говорилось, НК клетки обладали существенной устойчивостью к РИФ и ИН даже при высокой их концентрации (до 50 мкг / мл) (рис. 33).
Для дальнейшего изучения эффективности производных НРТ в отношении M. tuberculosis в состоянии покоя было выбрано соединение 11026115 и изучена его активность в отношении покоящихся клеток, получаемых в двух ренее известных и наиболее популярных моделях покоя in vitro: модели гипоксии Вейна (Wayne & Hayes, 1996) и модели голодания Беттс (Betts et al., 2002). Покоящиеся клетки обрабатывали 10 мкг / мл соединения 11026115 в течение 7 дней, после чего оценивали число клеток, сохранивших свою жизнеспособность после антибиотикотерапии, методом НВЧ. Было обнаружено, что соединение 11026115 оказывало значительное бактерицидное действие не только на покоящиеся НК клетки M. tuberculosis, полученные в условиях недостатка калия, но и на покоящиеся клетки, полученные в модели гипоксии Вейна и в модели недостатка питательных веществ in vitro (рис. 34). Несмотря на то, что покоящиеся клетки в этих моделях были довольно восприимчивы к действию РИФ, обработка экспериментальным соединением 11026115 продемонстрировала более сильный эффект, чем РИФ в такой же концентрации во всех трех моделях M. tuberculosis in vitro, а его эффективность в отношении активно растущих клеток была сопоставима с эффективностью препаратов первой линии РИФ и ИН.
Таким образом, можно заключить, что оригинальные производные НРТ способны эффективно уничтожать делящиеся и покоящиеся бактерии M. tuberculosis.
На следующем этапе работы было продолжено исследование взаимосвязи химической структуры производных НРТ и активности в отношении клеток M. tuberculosis. Было проанализированы полученные нами данные по противотуберкулезной активности для 40 новых производных следующего поколения НРТ. В исследованиях «структура-активность» детально изучался эффект введения различных заместителей в положение 5 (R1) и тио-заместителей в положение 2 (R2) пиридинового кольца (табл. 9). Введение таких заместителей, как H и галогены, а также заместителей алифатического ряда в положение 5 пиридинового кольца (R1) приводило к снижению или даже полному отсутствию активности в отношении M. tuberculosis, тогда как наличие в этом положении электроноакцепторных заместителей, таких как этоксикарбонил, трифторметил и т.д., наоборот, приводило к ее увеличению. Что касается положения 2 пиридинового кольца, то наибольшей активностью обладали соединения, имеющие в своей структуре имидотиокарбаматный фрагмент, при этом их активность не сильно отличалась в зависимости от наличия в них алкильных заместителей (табл. 9). Исследование биологической активности следующего поколения НРТ обнаружило у них еще более выраженную активность в отношении как делящихся, так и покоящихся M. tuberculosis. В табл. 9 приведены наиболее перспективные производные, обладающие выраженной бактерицидной активностью как в отношении размножающихся, так и покоящихся форм. Видно, что новые высокоактивные производные НРТ характеризуются активностью в 5-10 раз большей, чем соединение 11026115, изученное на первом этапе.
Соединениями-лидерами являются производные 11126121 и 11126125, поскольку они обладают наименьшими значениями МИК (50 нг/мл) и оказывают наиболее сильное бактерицидное действие в отношении покоящихся клеток (снижение жизнеспособности на 4 и более порядка). Была проведена оценка их цитотоксичности. Из табл. 10 видно, что в отношении клеток гепатокарциномы HepG2 и особенно эпителиальных клеток карциномы легкого человека A549 они проявляли умеренную токсичность (индекс селективности 100), что делает их весьма перспективными для дальнейшей работы, в том числе – экспериментов in vivo.
Конверсия производных гидроксипиридинтионов в слабощелочных условиях При анализе полученных результатов (табл. 9) было отмечено, что активность НРТ не зависела от характера и свойств конкретного имидокарбамата (R2), его размеров, и была сходной для циклических и линейных алкильных и арильных заместителей. В ходе дальнейшей экспериментальной работы было обнаружено, что НРТ теряют свой имидокарбаматный фрагмент в слабощелочных условиях (рис. 36), возникающих при культивировании микобактерий in vitro (Shleeva et al., 2011). Были синтезированы три соответствующих производных НРТ (2a-c) – стабильных и растворимых в слабощелочных растворах, их МИК в отношении активнорастущих M. tuberculosis составила 0,05 мкг/мл. Для исследования механизма их действия на клетки M. tuberculosis было выбрано соединение 1-гидрокси-5-этоксикарбонилпиридин-2(1H)-тион (НРТ-2b).
Биодоступность и фармакокинетика соединения НРТ-2b в плазме крови мышей
Были изучены биодоступность и фармакокинетика соединения НРТ-2b у мышей. Мыши линии C57BL/6 (4 шт) получали НРТ-2b перорально в дозе 100 мг/кг (2 мг/мышь). Образцы крови собирали в двух временных точках: через 15 и 45 минут после введения препарата, пулировали, получали сыворотку. Образцы сыворотки (100 мкл) вносили на чашку Петри с газоном M. tuberculosis и инкубировали 7-10 дней до появления зон лизиса бактериальной культуры. Из табл. 11 видно, что уже через 45 мин после перорального введения НРТ-2b, сыворотка мышей была неактивна и не образовывала зон лизиса на газоне. Однако при внутривенном введении препарата в дозе 25 мг/кг (0,5 мг/мышь) сыворотка, собранная через 5 и 30 минут, проявляла заметную антимикобактериальную активность (табл. 11, рис 35). Для определения приблизительной концентрации НРТ-2b в образцах сыворотки готовили стандартные водные растворы исследуемого соединения НРТ-2b и измеряли диаметр соответствующих им зон лизиса, образуемых на газоне M. tuberculosis. Из рисунка 32 видно, что сыворотка мышей, собранная через 5 и 30 минут после в/в введения 25 мг/кг НРТ-2b, приблизительно соответствовала активности растворов НРТ-2b с концентрацией 10 мкг/мл и 5 мкг/мл, то есть образцы сыворотки мышей при внутривенном введении содержали около 20х и 10х МИК соединения НРТ-2b, соответственно (таблица 11). Сыворотка мышей C57BL/6 контрольной группы, не получавших препарат, зон лизиса не образовывала.
Метаболическая трансформация соединения TP053 в клетках M. tuberculosis
Логично было предположить, что высвобождение оксида азота NO может быть не единственным механизмом воздействия соединения TP053 на клетки M. tuberculosis, и что, являясь пролекарством, данное соединение может претерпевать более существенные метаболические изменения в клетках патогена. Для обнаружения биологически активных метаболитов TP053 был использован штамм M. tuberculosis с гиперэкспрессией активатора TP053 – белка Rv2466c. Культуру выращивали в отсутствие и в присутствии соединения TP053 (50 мкг/мл) в течение 48 ч.
Клетки лизировали и проводили экстракцию лизатов хлороформом. Полученные экстракты анализировали методом жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией (LC-MS). Сравнение спектров контрольной и опытной культур выявило в последнем соединение, предположительно являющееся основным продуктом метаболической трансформации TP053, с молекулярной массой 261 (рис. 51), и было высказано предположение, что он является основным продуктом метаболической трансформации TP053.
Параллельно очищенные хлороформенные экстракты анализировали методом тонкослойной хроматографии на силикагеле. В экстракте клеток опытной культуры были обнаружены 8 фракций (рис. 51А), тестирование активности которых на бактериальном газоне Mycobacterium smegmatis, выращенном на плотной питательной среде Миддлбрука 7Н9 выявило единственную фракцию, которая ингибировала рост клеток (фракция №5). Эту фракцию элюировали из силикагеля дейтерированным ДМСО. На основании протонных сигналов ЯМР-анализа (рис. 51Б), был сделан вывод, что элюированное соединение, обладающее антимикобактериальной активностью – 2-[4-меркапто-6-(метиламино)-2-фенилпиримидин-5-ил] этанол с массой 261.
Хотя молекулы, содержащие в своей структуре нитрогруппы, не являются приоритетным выбором при разработке лекарственных препаратов, главным образом из-за их возможного мутагенного их действия (Nepali et al., 2019), ряд противотуберкулезных препаратов содержат в своей структуре эту группу. Так, претоманид PA-824 и деламанид активируются нитроредуктазой Ddn (Singh et al., 2008, Matsumoto et al., 2006), в то время как макозинон (PBTZ-169) восстанавливается до промежуточного нитрозосоединения и ингибирует свою мишень DprE1 путем ковалентного присоединения к ней (Makarov et al., 2014).
В ходе данной работы было обнаружено, что белок Rv2466c является активатором соединения ТР053 и обеспечивает высвобождение оксида азота NO из этого соединения. Влияние NO на физиологию бактерии M. tuberculosis к настоящему моменту изучено достаточно хорошо (Voskuil et al., 2003, Schnappinger et al., 2003, Voskuil et al., 2011, Rhee et al., 2005). Известно, что NO ингибирует метаболические пути аэробного дыхания, что было обнаружено как у клеток M. tuberculosis, подвергшихся действию NO in vitro (Voskuil et al., 2011) и для клеток M. tuberculosis, находящихся под воздействием NO во внутрифагосомальной среде активированных макрофагов (Schnappinger et al., 2003), которые, как известно, продуцируют также ряд реакционно-способных промежуточных соединений азота (Nathan & Shiloh, 2000).
Ингибирование аэробного дыхания, сопровождающееся активацией транскрипции цитохром-bd-оксидазы (гены cydA и cydB) обнаруженной нами при изучении транскриптома M. tuberculosis в присутствие ТР053, также было продемонстрировано ранее для препарата PA-824, являющегося противотуберкулезным препаратом-донором NO (Singh et al., 2008). Во время перехода клеток M. tuberculosis в состояние покоя под действием снижающейся концентрации O2 и в присутствии NO, была обнаружена индукция генов Dos регулона (Voskuil et al., 2003). Более высокие концентрации NO вызывали плейотропный эффект в клетках микобактерий, включая активацию генов, ответственных за защиту от окислительного стресса, таких как katG (каталаза), ahpC (алкилгидропероксидредуктаза), trxC (тиоредоксин), trxB2 (тиоредоксинредуктаза) (Voskuil et al., 2003). Траскрипция этих генов также повышалась под действием TP053, также как и ряд генов, относящихся к Dos-регулону (приложение 5), подтверждая факт высвобождения NO при метаболической активации данного соединения.
Ранее был подробно изучен процесс высвобождения NO из 2-нитрофурана в восстанавливающих условиях путем превращения группы NO2 в группу ONO и деароматизации фуранового кольца (Grigoriev et al., 1999, Cogolli et al., 1979) Предположительно, преобразование группы NO2 в ONO также является начальным этапом активации TP053, поскольку с помощью LC-MS был обнаружен небольшой пик, отличный от TP053 с таким же молекулярным весом (М = 286) (рис. 51А), который, предположительно, может соответствовать ONO-производному TP053.
В отличие от PA-8244 (претоманида) и деламанида, которые становились неактивными после высвобождения NO, метаболит 2- [4-меркапто-6- (метиламино) -2-фенилпиримидин-5-ила ] этанол с массой 261 характеризуется присутствием высокореактивной SH группы, которая, по-видимому, ответственна за плейотропные эффекты в M. tuberculosis, наблюдаемые при помощи транскриптома (снижение уровня транскрипции 50S рибосомного белка (rpmB1), регуляторов транскрипции (mce1R, trcR), синтазы жирных кислот (fadD5, D11, D12, D34) и другие ферментов (galK, prpCD, speE, lipQ и т. д.) (приложение 5). К сожалению, малое количество конечного метаболита TP053, полученного после высвобождения NO в M. tuberculosis, препятствует дальнейшей характеристике этого соединения, а его химический синтез был чрезвычайно сложным из-за его высокой реакционной способности и сложной структуры.
Таким образом, исследования, проведенные в ходе настоящей работы, показали, что белок Rv2466c, являющийся микотиолзависимой редуктазой, трансформирует соединение TP053, являющееся пролекарством, в клетках M. tuberculosis (рис. 50). Эта трансформация включает в себя высвобождение NO и образование метаболита со свободной меркарптогруппой SH, способной ковалентно связываться с SH группами ферментов и других биомолекул, инактивируя их (рис. 52). Установленный механизм действия соединения ТР053 позволяет рассматривать его как неселективный ингибитор целого ряда метаболических реакций микобактерий.