Введение к работе
Актуальность темы. Медь входит в состав ферментов, контролирующих __ такие __ жизненно ___важные „функции . _ организма,._ как окислительное фосфорилирование, синтез гормонов, формирование соединительной ткани, деятельность центральной нервной системы и многие другие (Brown et al. 1994). В то же время, ионы меди, являясь мощными окислителями, при прямом контакте повреждают все типы биомолекул. Поэтому многоклеточные организмы, в том числе и млекопитающие, должны на молекулярно-генетическом уровне решать вопросы, связанные как с упаковкой ионов меди в "безопасные оболочки", так и с их транспортировкой по межклеточным и внутриклеточным пространствам организма через мембранные барьеры клеток и внутриклеточных ксмпзртментов. Нарушения работы любого звена в этом транспортном цикле, в зависимости от локализации поломки, приведет или к дефициту, или к накоплению токсических количеств меди в различных частях организма, что, по-видимому, является причиной разнообразных медьзависимых микроэлементозов, природа которых не ясна (Авцин и др., 1994).
Выяснение молекулярно-генетических основ таких заболеваний, и, следовательно, их лечение, может быть успешным только при полном знании кругооборота меди в организме. Однако, сведения о молекулярном механизме поступления, распределения и выведения меди в различных организмах и особенно у млекопитающих отрывочны.
Почти не вызывает сомнений, что универсальным транспортером меди по каналам межклеточных коммуникаций является медьсодержащий гликопротеин сыворотки крови - церулоплазмин (ЦП), белок, синтезирующийся в гепатоцитах (Ettinger, Darwish, 1986). К тому же, на поверхности некоторых клеток негепатоцитарного ряда обнаружен специфический рецептор ЦП (Harris, 1991 ). В то же время, о молекулярном механизме взаимодействия ЦП с его рецептором почти ничего не известно.
Изучение этого взаимодействия поможет понять механизм, обеспечивающий поступление ионов меди в клетку.
Целью данной работы является изучение молекулярного механизма взаимодействия ЦП со специфическим рецептором плазматических мембран и исследование клеточноспецифичной экспрессии гена рецептора ЦП в организме млекопитающих.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи. 1.Изучить связь между содержанием ЦП в среде роста и количеством рецептора ЦП на поверхности клеток, рост и функционирование которых в целом организме зависит от меди, доставляемой ЦП;
2. Проследить перемещение ЦП после его связывания с клеточной поверхностью;
3. Исследовать экспрессию гена рецептора ЦП в организме млекопитающих; 4.Сопоставить перемещение ЦП и импульсно-меченного рецептора ЦП в фибробластах и реконструировать в опытах на различных клеточных линиях межорганный маршрут пептидной части молекулы ЦП.
Научная новизна. В ходе работы установлено, что рецептор ЦП синтезируется только в клетках негепатоцитарного ряда, а количество его на клеточной поверхности регулируется по типу обратной связи уровнем ЦП в среде роста. Фибробласты интернализуют связанный с клеточной поверхностью ЦП, и, после трансклеточного переноса в составе мембранных везикул, освобождают его в культуральную среду. Выделяемый фибробластами ЦП приобретает способность связываться с клеточной поверхностью гепатоцитов, которые, интернализуют его и затем секретируют. В ходе трансклеточного переноса через гепатоциты ЦП значительно деградируется. Динамика и внутриклеточный маршрут 1251-ЦП и импульсно-меченого рецептора ЦП полностью совпадают. На основе полученных данных предлагается гипотетический молекулярный механизм, лежащий в основе межорганного транспорта ЦП и обсуждается возможный вариант взаимодействия между ЦП, рецептором ЦП и медьтранспортной АТР-азой Р1-типа, продуктом гена болезни Вильсона.
Научно-практическое значение. Полученные в диссертации данные о клеточно-специфической экспрессии гена рецептора ЦП и регуляции его экспрессии по обратному типу могут быть использованы для описания новых нозологических форм медных микроэлементозов наследственного и приобретенного происхождения. К тому же, антитела к рецептору ЦП, полученные в ходе выполненной работы, являются диагностическим тестом для установления молекулярной природы специфических нарушений экспрессии гена рецептора ЦП.