Введение к работе
Актуальное! проблемы. Проблема направленного транспорта
лекарств, была впервые поставленна еще в начале столетия номеціом ученым Паулем Эрлихом, который предложил концепцию гипотетической "?.іаптческой пули". Такая пуль должна находить пораженное место в организме и воздействовать только на него (Ehrlich Р., 1956К
Особое внимание обращают на себя селективные цитотоксины -препараты проявляющие избирательную киллорну» активность. Эти препарата направленного действия представляет собой гибридные молекулы, состоящие из двух частей: токсического и адресного фрагментов.
В качестве адресного фрагмента в таких молекулах используют антитела и их РаЪ-фрагменты, лектины, гормоны. В качестве токсического фрагмента используют токсины растительного и бактериального происхождения (абрин, рицин, модецин и др.), ферменты (глюкозооксидаза) и лекарственные препараты, ^антиметаболиты, алкилирующие агенты, некоторые антибиотики).
Довольно перспективным направлением в этой области исследований является использование низкомолекулярных генераторов активных форм кислорода для направление го разрушения кяеток-мишеней (Arohakov & Baohmanova, 1990).
Известно, что в организме активные формы кислорода осуществляют окислительную модификацию и деградацию структурных и транспортных белков, ферментов, нуклеиновых кислот, инициируют перокчеиое окисление ненасыщенных лииидоэ, выбывают поврокдение биологических мембран (Fligiel el al., 1994; HalliwellA CuUeridgo,l984; Frldovich. 1986; Hun et al., 1966; Arohakov . Baohmanova, 1990). Довольно хорошо изучено цитотоксичоское
действие активных форм кислорода на различные вида kjiqtqkJ і фагоциты, эпителиальные клетки, эритроциты, культуры опуходэвд клеток И Т.Д. (Sadwey & Karnovsky, 1980; Nathan 4 Colin, tg8Q{ Weiss & Lobuglio, 1982; Whorton et al., 1985; Voanesenskil ot ai., 1991).
Таким образом, использование низкомолекулярных генератором активних форм кислорода для направленного разрукзная клеток-мишеней позволяем сочэтать широкий спектр ВОЗМСІІЯЩ повреждений с точной клеточной адресацией. Кроме того, несомненным преимуществом низкомолекулярных генераторов ЯВЛЯЙСЯ то, что они могут работать в каталитическом решаю, испольрул присутствующие в организме восстановительные агенти (аскорбквойуа кислоту, глутатион и др.), и непрерывно шрабатішать актщщэ формы кислорода вплоть до полного разрушения клетки-мишени.
В качестве ниэкомолекулярного генератора активных ррм кислорода нами был выбран антибиотик блеомищш, относящийся к классу гликояептидов. Блеомищш, хелатируя металлы перемелюй валентности, генерирует активные формы кислорода ,в окислительно-восстановительном цикле, подобном нонсюксигвназ^ому шилу цитохрома Р-450 (Burger et al., 1983; Murugesan et aj.,, 1983). Мишень» в клетке для Олеомицина является молекула ДЩ: интеркалируя в ДНК, блеомицин генерирует разрушающие эту молекулу активные формы кислорода (Stubbe.1988). Помимо разрывов ДНК, блеомищш оказыеает повреадащее действие на мембранные структуры клеток за счет инициации перекисного окисления липвдов, ~ с последующей агрегацией белков (Glri et ai.., 1983; Omayo epd ?appei, 1984; fiosan et al., 1983).
Цель исследования: Предаолагалось нутем связывания блеомицпяа
с адресными белками t .здать гибридные молекули, обледащію большей цитотоксмческой активностью Г чем свободный блоомищш:
В связи с поставленной целью необходимо было решить следаЮПИ6 задачи:
-
Исследовать говрездащее действие блеомицина на тимоциты мышей с целью вияснення роли различных форм кислорода в этом процессе.
-
Разработать метод ковалентного связывания блеомицина с белком с сохранением его способности активировать молекулярный кислород.
-
Получить активные коныогаты блеомицина с конканавалином А, инсулином и кальцитонином - белками, обладающими высоким сродством к поверхности тимоцитов.
-
Сравнить тимоцитолитическое действие полученных коньюгатов блеомицина с активностью свободного блеомицина.
ВІ!Ш52-Н21Изна_и_!Щактическая_значі^сть^а
Научная новизна предлагаемой работы состоит в том, что в качестве киллерного фрагмента при создании цитотоксинов предлагается использовать ниэкомолекулярный генератор активных форм кислорода - блеомицин.
В результате проводенных исследований обнаружено, что комплекс блеомицина с железом, генерируя активные Формы кислорода, способен повреждать мембраны тимоцитов. Комплекс блеомицина с железом работает в каталитическом рекиме, получая необходимые для этого электроны от эндогенных и экзогенных восстановителей.
Подобраны условия ковалентного связывания блеомицина с белками, при которых блеомицин сохраняет' способность хелатировать железо и разрушать клеточные мембраны.
Получены коныогаты блеомицина с адресными фрагментами: конканавалином А, инсулином и кальцитонином, обладающие более
высокой тимоцитолитической активностью по сравнению со свободным блеомицином.
Апробация диссертации состоялас ь 23.12.92 на совместном
заседании учебно-научного комплекса кафедра биохимии ЧЕЛ РГМУ и Института биологической и медицинской хжш РАМН.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на