Введение к работе
Актуальность проблемы. Одной из актуальных задач совремэтшой эндокринологии является исследование молекуляр'шх механизмов действия инсулина, играющего ключевую роль в регуляции анаболических процессов в организме. Помимо теоретического интереса эта проблема имеет большое практическое значение для медицины. Ее решение будет способствовать выявлению молекулярных дефектов, лежащих в основе патологии инсулиновой системы.
Как известно, в ходе эволюционного процесса у эукариот появились инсулин и группа родственных ему пептидов, которые по своим структурно-функциональным признакам объединяются в одно общее инсулиновое суперсемейство. Согласно эволюционной концепции Стей-нера (Stelner et al., 1984), все пептиды инсулшового супврсемей-ства являются продуктами генов, возникших в результате дивергенции от общего анцестрального гена, и могут быть сгруппированы в три кластера : 1) инсулина и инсуликоподобнае факторы роста (ИФР) позвоночных, Оомбиксиш насекомых; 2) релаксины рыб и млекопитающих; 3) инсулшюподооныэ пептида (ИШ) моллюсков, в том числе ИЛИ моллюска Modcnta cygnea, выделенный и охарактеризованный в наямй лаборатории (Русаков и др., 1991).
К настоящему времени достигнуты значительные успехи в изуче
нии структурной функциональной организации рецепторов инсулина и
родственных ему пептидов, а также механизмов функционального соп
ряжения этих рецепторов с различными эффекторшми системами (Oil-
rich, Schlesainger, 1990; Cheatham, Калл, 1995). Так, показано,
что большинство биологических эффектов инсулина реализуется через
каскад фосфоридарования белков по тирозину, катализируемого тиро-
зинкияазой, присущей рецепторам этих пептидов. Установлено также,
что з процессы трансдукции инсулинового сигнала вовлечены и дру
гие сигнальные системы, з том числе включающие гетеротривдрные
ГТФ-связыЕаюшкэ белки (G-белки), например, связанные с обменом
фосфоинозитолгликанов, фосфатидилхолина и др. (Перцева и др.,
1996). .
Однако, несмотря на известный прогресс в современных представлениях о механизмах регуляторного действия инсуг'на и других пептидов инсулиноЕого суперсемейства остается много брешей и нерешенных вопросов.' Одним из них является возможность участия в
реализации эффектов этих пептидов вденилатциклазной сигнальной системы (АЦС), роль которой в механизмах действия гормонов, активирующих рецепторы родопсинового типа (РРТ) (семь раз пронизывающих мембрану), может считаться доказанной. Эта система включает, по крайней мэре, три функциональных блока: первый - рецептор, расположенный на поверхности клетки, второй - трансдуктор, представленный G-Селком стимулирущаго (Gs) или интибирующего (G^) типа, который осуществляет сопряжение рецептора с третьим, каталитическим компонентом АЦС, представленным ферментом аденилатцкк-лазой (АЦ) (Перцева, 1989; Simon et al., 1991; Neer, 1994, 1995).
Накогоюннне за прошедший период весьма противоречивые данные о влиянии инсулина на активность АЦ свидетельствовали либо -об отсутствии такового, либо об ингибирупцем его действии (Houslay, 1991; Wakino et al., 1992). Согласно современным представлениям, регуляция активности АЦ, осуществляемая через РРТ (катехоламины, глюкагон), происходит за счет прямого взаимодействия рецептора с Ga или G^-белками, ведущего к их активации. В первичной структуре этих рецепторов идентифицированы участки, обеспечивающие указанное взаимодействие (Savarese, Fraaer, 1992; Шпаков, 1995а, 1996).
В отношешш рецепторов-тирозинкиназ, вовлеченных в действие инсулина и некоторых ростовых факторов показано участие G-белков в реализации рецепторних и псстрецепторных стадий трансдукции гормонального сигнала. Однако, вопрос о том, происходит ли при втом прямое взаимодействие между рецептором-тирозинкиназой и G-белгсами, или оно носит опосредованный характер, остается открытым. Гак, но осуществлен в полной мере поиск в первичной структуре рецепторов инсулина и родственных пептидов молекулярных детерминант, которые могут ооеспечивать процесо связывания и вкгивации G-белков, в частности, Gs и Gj-белков - регуляторов АЦС. Имеются лишь единичные работы (ukamoto et al., 1993; Jo et al., 1993; Sun et al., 1995), в которых были предприняты попытки идентифицировать отдельные участки первичной структуры рецепторов инсулина и зпидермалыгого фактора роста (ЭФР), включенные в специфическую активацию различных классов G-белков. Не проводился также широкий сравнительный анализ первичных структур рецепторов инсулина и
родствэа пептидов о таковыми РРТ, сопряженных с G-болками,
необходимы* для обнаруквния потенциальных G-оелок-связцвьицкх участков в мал&кулах рецептороз-тирозинкиназ.
Проведенный нами детальний анализ современного состояния проблемы сигнальных механизмов действия инсулина и родственных пептидов, опосредуемого через рецепторц-тирозинкиназы, указывает на то, что одним из спорных и недостаточно изученных ее вопросов является возможность участия АЦС в реализации регуляторного действия этих пептидов. В связи с этим, основной целью настоящей работы было исследование участия АЦС в механизме действия пептидов инсулшювого суперсемейства, а также возможности взаимодействия рецепторов втих пептидов с G-белками, вовлеченными в регуляцию этой системы.
Основываясь на результатах многолетних исследований нашей лаборатории структуры инсулинов и ИПП различного происхождения, а также сигнальных механизмов- гормонального действия у позвоночных и беспозвоночных животных, мы в своей работе применили эволюционный подход. Он реализовался в двух направлениях: 1) исследозали участие АЦС в действии инсулина и ИФР млекопитающих, а также ИШ моллюска A.cygnea, животных, далеко отстоящих в филогенетическом плане; 2) в качестве тканей-мишнэй регулирующего действия этих, пептидов била избрана мышечная ткань как позвоночных (крысы), так и беспозвоночных (моллюски) кивотных.
Основные задачи работы состояли в следущем:
1. Провести теоретический анализ аминокислотных последовательнос
тей (АКП) рецепторов инсулина к родственных пегггидоз в сравнении
с таковыми PFT, функционально сопряженных о Сд и Gj-болками, с
целью обнаружения в АКП рецепторов пептидов иксулинового супэрса-
мейства участков, потенциально способных взаимодействовать о эти
ми G-бэлками.
2. Экспериментально исследовать влияние 'пептидов иясулинового
сушрсемейсгва на функциональную активность АЦС в мышечных тканях
представителей позвоночных и беспозвоночных животных.
3. Выяснить вопрос о вовлеченности G-белков в реализации регуля
торного действия инсулина и родственных пептидов на АЦС.
Основные результаты, научная новизна работы.
На основе разработанного алгоритма для попарного сравнения АКП в нерБИчной структура р-субъеднниц (р-СЕ) рецепторов инсулина (ИР) и ИФРІ впервые обнаружены АКП, гомологичные тэкоеым РРТ, включенным б связывание и активацию молекул Gg- и ...^-белков -компонентов АЦС. Эти АКП могут претендовать на роль молекулярних
детерминант, ответственных за прямое взаимодействие рецепторов пептидов инсулинового суперсемейства с этими G-белками.
Разработан новнй графический метод анализа АКП белков, предназначенный для поиска в их первичной структуре внутренней симметрии зеркального тина. Использование этого метода для анализа рецепторов инсулина и родственных пептидов позволило впервые обнаружить, что участки этих рецепторов, потенциально включенные во взаимодействие с Gs~ и Gj-бвлками, имеют симметричную структуру, что по современным взглядам может свидетельствовать об их важности для функциональной активности рецепторов.
Впервые показано, что инсулин, ИФРІ, ИГО моллюска A.cygnea и ЭФР оказывают ГТФ-зависимый стимулирующий эффект на базальную активность АЦ в мышечной ткани моллюска анодонты-и крысы. Обнаруженные эффекты были быстродействующими (максимальная стимуляция АЦ активности достигалась уже через 2.5 минуты) и осуществлялись в физиологическом диапазоне концентраций пептидов, что может указывать на присутствие этих эффектов в клетке. Обнаружено, что исследованные пептида наиболее эффективно стимулируют АГД в тканях rex животных, в которых они присутствуют: ИПП моллюска был наиболее эффективен в ткани анодонты, а инсулин и ИФРІ млекопитающих -в тканях крысы. На основании этого был сделан вывод о видоспеци-фичности действия пептидов инсулинового суперсемейства. Установлено, что стимулирующий АЦ эффект тштвдсв потенцируется (усиливается) гуашшовыми нуклеотвдами (ГН) (порядок эффективности ГОТ78>ГИДФ>ГТФ), что указывает на вовлеченность в реализацию этого эффекта G-балков и конкретно G-белка стимулирующего типа.
Сделано заключение об обнаружении ранее неизвестной системы транодукции сигналов, генерируемых инсулином и родственными пептидами, с участием АЦО.
Апробация работы проходила на заседании секции молекулярных основ эволюции и функций ИЭФиБ им.У,.М.Сеченова РАН. Результаты работы докладывались на Симл. стран СНГ "Пути передачи внеклет. сигнала", Звенигород, 1993, 7th Oonl. of Eur.comparative endocrinologists, Cordoba, Spain, 1994; IVth Symp. on Molluscan Neurobiology (Syraon IV), Amsterdam, 1994; Meeting "Tyrosine Phosphorylation ні-' Cell Signalling", Cold Spring Harbor, USA, 1995; Конф. "Биох. и биофиз. «еж-ми физкол. функций", С-ПотерОург, 1995; ІШ) Мвкд. совет, и школа но звол. физиол., С-Патарбург, 1996.
Публикации. По теме диссертации опуб.ликовеио 16 работ.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на ... страницах машинописного текста; состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и обсуждения теоретических и экспериментальных исследований, заключения, выводов, списка литературы (... источников). Материалы диссертации иллюстрированы .. рисунками и .. таблицами.