Введение к работе
Актуальность проблемы
Проблема организации и функционирования генетических систем, особенно таких сложноорганизованных как геном эукариот, является в настоящее время одной из центральных в современной биологии. Благодаря применению новых высокоэффективных методов исследования ДНК уже достигнуты значительные успехи в изучении не только структуры и функции генома эукариот в целом, но и тонкой структуры отдельных генов и регуляции их экспрессии.
Насекомые - самый представительный класс животного царства, характеризующийся . исключительным многообразием. Такие насекомые, как дрозофила и тутовый шелкопряд, давно приобрели статус лабораторных животных, использование которых в качестве биологических моделей привело к ряду выдающихся открытий в области структурной организации генома эукариот (Георгиев и др., 2000; Spradling, 1986; Ashburner, 1989; Adams et al., 2000).
Тутовый шелкопряд Bombyx mori L. (отр. Lepidoptera) проходит в своем развитии четыре фазы метаморфоза - яйцо (грена), личинка, куколка, бабочка, что позволяет использовать его в качестве объекта для изучения дифференцировки и морфогенеза. Необходимость всестороннего изучения генома тутового шелкопряда диктуется важностью данного биологического объекта как сельскохозяйственного животного, продуцирующего огромное количество экскретируемого белка. Клетки стенки шелкоотделительной железы обладают колоссальным политенным геномом, включающим в свой состав 5x10і гаплоидных геномов. Задний отдел шелкоотделительной железы тутового шелкопряда вырабатывает 140 мг фиброина в сутки (38x10й молекул в минуту), что не сопоставимо ни с одним изученным в этом аспекте биологическим объектом (Бродский, Нечаева, 1988). Всё это выдвигает тутового шелкопряда в ряд важнейших модельных объектов для биохимии, молекулярной биологии и биотехнологии (Jean-Pierre Garel, 1982; Филиппович и др., 1992; Корочкин, 2002; Wu, Сао, 2004).
В гаплоидном геноме тутового шелкопряда у дикого типа содержится 27 хромосом, у домашнего типа - 28; большинство из них являются мелкими образованиями, трудно поддающимися генетическому и цитогенетическому анализу (Астауров и др., 1959; Tazima, 1964; Murakami, Imai, 1974). ДНК из семенников тутового шелкопряда характеризуется температурой плавления, равной 69,7С, что соответствует 38,6% ГЦ-пар. Масса гаплоидного генома тутового шелкопряда составляет 0,53 пт (Gage, 1974; Gage et al., 1976), и он насчитывает около 700 млн. п.н., 75% которых в настоящее время секвенированы (Koike et al.,2003; Mita et al., 2003; 2004).B геноме тутового шелкопряда 54,7% составляют уникальные последовательности, 20,8% относятся к умеренным повторам и 24,5% - к часто повторяющимся последовательностям (Gage, 1974; Адо, 1986).
Очень важен, но наименее изучен вопрос об изменении генома в процессе онтогенеза тутового шелкопряда. При изучении динамики содержания ДНК в грене тутового шелкопряда в процессе её развития были зафиксированы значительные изменения, отражающие, по-видимому, специфику отдельных
периодов эмбриогенеза насекомого (Коничев, 1974; Родина, 1988). В этой связи определенный интерес представляют данные о степени сблоченности пиримидиновых олигонуклеотидных последовательностей в ДНК грены тутового шелкопряда в процессе её развития. Этот косвенный метод определения первичной структуры ДНК (Мазин, 1972) дает вполне определенную информацию не только о характере распределения пиримидинов в полинуклеотидной цепи ДНК, но и позволяет установить различия в структурной организации ДНК как у далеко-, так и у близкородственных организмов (Критский и др., 1980). Сравнительная характеристика блочной структуры ДНК у пород и гибридов тутового шелкопряда на стадии яйца представляет несомненный практический интерес, поскольку именно на самых ранних этапах развития организма закладываются будущие основы его продуктивности.
Повторяющиеся последовательности генома эукариот привлекают повышенное внимание в связи с их возможным участием в регуляции генной активности и жизнедеятельности клеток. Из повторяющихся последовательностей генома эукариот следует особо выделить гены рибосомных РНК (р-гены), которые представляют интерес в двух аспектах: с одной стороны они являются удобной моделью для изучения структуры, функции и эволюции мультигенных семейств (Носиков, Брага, 1982) , с другой стороны, благодаря своей гетерогенности и высокому уровню полиморфизма, могут быть использованы для решения практических задач селекции. Большой интерес представляет определение соотношения в генотипе пород и гетерозисних гибридов р-генов со вставками и без них, так как потенциально это явление может быть связано с предопределением уровня продуктивности пород и гибридов шелкопряда.
Изучение генетического разнообразия, индивидуальности и родства организмов на уровне анализа вариабельности структуры ДНК является одной из актуальных проблем современной биологии. Широкая распространенность М13-минисателлитоа в живой природе, их гипервариабельность, соматическая стабильность и ядерный тип наследования способствовали разработке универсального варианта геномной дактилоскопии для решения фундаментальных и прикладных проблем (Vassart et al., 1987; Джинчарадзе и др., 1987; Рысков, 1999 ; Рысков и др., 1988). Для тутового шелкопряда важным является выявление гипервариабельных маркерных локусов его генома, общих и специфических для каждой породы, особенностей их проявления у индивидуумов, в гетерогенной массе яиц (семейная кладка), наследование у гибридов и у потомков партеногенетических клонов, полученных с помощью разных типов партеногенеза, что способствует созданию предпосылок для научно-обоснованной селекции тутового шелкопряда.
Известно, что показателем активности генома является присутствие молекул ДНК, вовлеченных в процесс репликации и транскрипции и находящихся в данный .момент в деспирализованном виде (метаболически активная ДНК) (Дашкевич и др., 1968, 1972; Конарев и др., 1971; Habenes et al., 1970; Mizuno et al., 1971)v Поэтому, содержание этого вида ДНК представляется реальной характеристикой структурного состояния генома в онтогенезе
насекомого, его тканях и особенно у разных по продуктивности пород и гетерозисних гибридов тутового шелкопряда.
Наличие большого спектра коллекционных и промышленных пород, а также гибридов, характеристика структурной организации их геномов на уровне анализа суммарных препаратов ДНК по степени сблоченности пиримидиновых нуклеотидов, полиморфизма р-генов и мииисателлнтных последовательностей, определение активности генома в онтогенезе, а также в шелкоотделительной железе личинок V возраста может дать существенную информацию относительно молекулярных механизмов продуктивности и гетерозиса у тутового шелкопряда.
Цель исследования
Основной целью данной работы явилось изучение ' организации пиримидиновых олигонуклеотидных последовательностей в геноме тутового шелкопряда, характеристика полиморфизма р-генов в его геноме, выявление гипервариабельных локусов генома тутового шелкопряда с помощью МІЗ-минисателлитов для маркирования генома на уровне отдельных особей, семей, пород, гибридов и потомков партеногенетических линий, полученных с помощью разных типов партеногенеза, а также определение активности генома у пород, гибридов тутового шелкопряда на эмбриональной стадии развития и разработка на этой основе методов прогнозирования продуктивности и эффекта гетерозиса у тутового шелкопряда.
Задачи исследования
-
Исследовать блочную организацию пиримидиновых нуклеотидных последовательностей в ДНК грены периода постдиапаузного развития и ДНК личинки V-oro возраста тутового шелкопряда.
-
Осуществить сравнительное исследование блочной организации структуры ДНК грены пород и полученных при их скрещивании гибридов в период постдиапаузного развития грены тутового шелкопряда.
-
Определить дозу р-генов в геноме тутового шелкопряда в процессе эмбрионального развития; исследовать полиморфизм р-генов в рДНК тутового шелкопряда; выявить межпородный полиморфизм р-генов у различных пород и гибридов тутового шелкопряда; установить распределение и характер наследования повторов рДНК, прерванных элементом RIBm, в геноме тутового шелкопряда.
-
Изучить возможность маркирования генома тутового шелкопряда мечеными олигонуклеотидными зондами, а также М13-минисателлитами.
-
Провести маркирование генома особей, семей и пород тутового шелкопряда, определить характер распределения гипервариабельных фрагментов у индивидуумов, полученных путем амейотического и мейотического партеногенеза.
-
Определить периоды активного состояния генома тутового шелкопряда в процессе онтогенеза.
7. Сравнить содержание метаболически активной ДНК у различных по продуктивности пород тутового шелкопряда и полученных при их скрещивании гибридов.
Исследования, представленные в работе, выполнены в соответствии с Государственными целевыми программами, включавшими ряд проблем.
По проблеме: «Разработать биохимические основы и методы прогнозирования гетерозиса на модельных биологических системах посредством биохимических тестов и выдать практические рекомендации по подбору родительских пар для получения высокопродуктивных гибридов с максимальным гетерозисом», включавшей тему «Определить структурное состояние ДНК в грене различных по продуктивности пород и гибридов тутового шелкопряда» (Постановление ГКНТ СССР №373 от 11.07,1975г.);
По проблеме; «Разработать новые направления исследований генетического аппарата, биополимеров и структур клетки, осуществляющих важнейшие проявления жизнедеятельности, и внедрить достижения молекулярной биологии и молекулярной генетики в медицину, сельское хозяйство, микробиологическую промышленность и другие отрасли народного хозяйства», включавшей тему «Апробировать методы и принципы геносистематики на некоторых группах беспозвоночных животных (насекомые, моллюски, ракообразные); провести оценку филогенетического родства главных классов членистоногих; изучить структуру геномов представителей чешуекрылых и некоторых других отрядов насекомых (в том числе коконопрядущих) для выяснения степени их генетического сходства и возможности использования этих данных в селекционной работе (08.Н4). Постановление ГКНТ СССР и Президиума АН СССР №426/91 от 26.11.7бг.
По проблеме: 0.74,05 «Разработать новые направления исследований
генетического аппарата, биополимеров и структур клетки, осуществляющих
важнейшие проявления жизнедеятельности, и внедрить достижения
молекулярной биологии и молекулярной генетики в народное хозяйство»,
включавшей тему 08.НЗ «Апробировать методы и принципы геносистематики на
некоторых группах беспозвоночных животных. Исследовать структурную
организацию и активность генома насекомых» (Постановление ГКНТ СССР,
Госплана СССР, АН СССР №24/25/13 от 13.02.81г.);
По проблеме: 0.74.05, включавшей тему 07.НЗ «Исследовать структурно-
функциональную организацию хроматина и хромосом, её изменение при
активации генов» (Постановление ГКНТ СССР и АН СССР №26/13 от
03.02.87г.)
Тема «Изучение полиморфизма ДНК тутового шелкопряда методом
геномной дактилоскопии» выполнена в рамках программы «Приоритетные
направления современной генетики» (1992-1995гл\).
По проблеме «Создание центра коллективного пользования
«Эволюционная геномика животных» в рамках Федеральной целевой
программы «Государственная поддержка интеграции высшего образования и
фундаментальной науки». Государственный контракт №4 0064 ФЦП
«Интеграция», 2001-2003 г.г.
Научная новизна и теоретическая ценность диссертационной работы
В результате работы были впервые получены следующие данные:
Показано» что в процессе эмбрионального развития тутового шелкопряда происходит постепенное нарастание степени сблоченности пиримидиновых олигонуклеотидов в ДНК и обогащение их тимидиловой кислотой. Этот процесс в основном заканчивается к моменту завершения органогенеза зародыша и поддерживается на этом уровне в течение личиночного развития.
Гены 28S рРНК не сцеплены с половыми хромосомами, а локализованы на одной из аутосом. Количественное содержание повторов со вставкой RIBm наследуется по материнскому генотипу.
Разработана технология геномной дактилоскопии для тутового шелкопряда с использованием рестрикционной эндонуклеазы Mspl и меченой ДНК фага М13 в качестве зонда. Выявлено 4 молекулярных маркера для генома тутового шелкопряда и ряд минорных гибридизационных полос, соответствующих минисателлитсодержащим рестрикционным фрагментам ДНК, позволяющим маркировать геном на уровне индивидуума - семьи - породы. У потомков тутового шелкопряда, полученных мейотическим типом партеногенеза (самцы), обнаружен высокий индивидуальный полиморфизм на спектрах гибридизации, позволяющий выявить генотипическую изменчивость.
Образование метаболически активной ДНК (ДНК с деспирализованной вторичной структурой) в онтогенезе тутового шелкопряда происходит циклически, соответствуя основным фазам и этапам развития насекомого (начало и конец постдиапаузного развития грены, начало каждого личиночного возраста, 1-й день завивки кокона (в большей степени у самцов) и на 4-й день развития куколки (в большей степени у самок)).
Практическая значимость работы
Полученные данные позволяют:
- осуществлять тестирование продуктивности пород и гибридов тутового
шелкопряда по содержанию экспрессирующихся генов 28S рРНК в их геноме;
идентифицировать семьи и партеногенетические клоны, паспортизировать породы, выявлять генотипическую изменчивость, детектировать отдельные локусы различной копийности при анализе гибридных организмов.
- использовать биохимический тест для раннего прогнозирования эффекта
гетерозиса у гибридов тутового шелкопряда по содержанию метаболически
активной ДНК в их геноме на стадии Д| постдиапаузного развития грены.
Инструкция по применению этого теста рекомендована Республиканской
научно-исследовательской станции шелководства (пос. Иноземцево
Ставропольского края), Среднеазиатскому НИИ шелководства (г.Ташкент) и
НПО «Укрплемгрена» (пМерефа Харьковской обл.).
На основании проведенных исследований разработаны методические прописи, предназначенные для постановки практикума и спецпрактикума по биохимии и молекулярной биологии (сборник «Методы анализа белков и нуклеиновых кислот» - М.: МГПИ им. В.ИЛенина, 1980, ч.1, с.96-101).
Результаты исследований используются при чтении курса молекулярной биологии и спецкурса «Организация генома эукариот», а также включены в семинарские и практические занятия по биохимии и молекулярной биологии для студентов биолого-химического факультета Московского педагогического государственного университета.
Положения, выносимые на защиту
-
Блочная организация пиримидиновых олигонуклеотидных последовательностей в ДНК грены и личинки V-oro возраста тутового шелкопряда представляется одним из реальных подходов к исследованию структуры генома в процессе индивидуального развития насекомого.
-
Для генома тутового шелкопряда характерен полиморфизм рибосомных генов, обусловленный наличием в структурной части 28S рДНК элементов RIBm н RJIBm. Рибосомные гены тутового шелкопряда не сцеплены с половыми хромосомами; содержание повторов р-генов со вставкой RIBm наследуется по материнскому генотипу.
3. М13-минисателлиты способны детектировать различные типы
гипервариабельных локусов генома тутового шелкопряда, что позволяет
маркировать геном тутового шелкопряда на уровне отдельных особей, семей,
пород и партеногенетических клонов.
4. Содержание метаболически активной ДНК (ДНК с деспирализованной
вторичной структурой) является реальным показателем активности генома у
тутового шелкопряда.
5. Степень сблоченности пиримидиновых олигонуклеотидов в
суммарном препарате ДНК грены тутового шелкопряда, содержание
экспрессирующихся р-генов, наличие общих и специфических минисателлитных
локусов в геноме, а также активность самого генома могут быть использованы
для характеристики геномов пород и гибридов тутового шелкопряда на стадии
грены.
6. Содержание экспрессирующихся р-генов в геноме может быть
рекомендовано в качестве перспективного молекулярно-биологического теста
для прогнозирования в процессе выведения пород и получения гибридов
потенциальной продуктивности, а содержание метаболически активной ДНК в
грене тутового шелкопряда в качестве биохимического теста оценки эффекта
гетерозиса в потомстве у гибридов тутового шелкопряда.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 99 работ, включая 1 монографию и 56 наиболее значимых и приоритетных публикаций.
Апробация диссертационной работы
Основные положения и результаты диссертации были представлены на XIII and XX International Congresses of Entomology, Moscow, 1968, Firenze, Italy, 1996; IX International Congress of Biochemistry, Stockholm, 1973; III Всесоюзном биохимическом съезде, Рига, 1974; VI съезде, Воронеж, 1970 и VII съезде, Ленинград, 1974 Всесоюзного энтомологического общества; на 7-ой, 9-ой, П-оЙ,
15-ой, 17-ой Конференциях ФЕБО (Varna, 1971; Будапешт, 1974; Копенгаген, 1977; Брюссель, 1983; Берлин, 1986), 2-ом Всесоюзном семинаре-совещании по генетике и селекции тутового шелкопряда и шелковицы, Ташкент, 1979; IX Всесоюзном симпозиуме «Структура и функция клеточного ядра», Черноголовка, 1987; Международном симпозиуме «Актуальные проблемы мирового шелководства», Харьков, 1991; координационном совещании шелководов стран СНГ, Мерефа, 1993; 5-th and 6-th European Congresses of Entomology (University of York, UK, 1994: Ceske Budejovice, Czech Republic, 1998); 2-ом съезде биохимического общества РАН, Москва, 1997, Ленинских чтениях в МГПИ им.В.ИЛенина, 1991,1996, научных сессиях по итогам научно-исследовательской работы МПГУ (1975, 1996,1999-2005).