Введение к работе
Актуальность проблемы. Na.K-АТФаза плазматических мембран клеток животных представляет собой систему активного транспорта На+ и К*. Используя энергию гидролиза АТФ фермент осуществляет трансмембранний перенос одновалентных катионов против градиента их электрохимических потенциалов, обеспечивая таким образом постоянство неравновесного распределения этих ионов ие.вду клеткой и средой /Болдырев, 1990/.
Многочисленные исследования природы Жаг-насоса привели к достаточно полному представлению о структуре и механизме действия фермента. Фермент является интегральным белком плазматической мембраны клеток и находится в тесной пространственной и функциональной взаимосвязи с другими мембранными.белками. Так, были получены доказательства взаимодействия Йа,К-АТФазы с периферическим белком мембранного скелета анкйрином / Nelson et al.f 1991/, установлена связь с анионным переносчиком - белком полосы 3 / Janoshazi, . 1989/, а также виявлено рёгуляторное влияние на активность фермента спектрин-актинового комплекса /Казеннов', Маслова, 1991/.
В последние годы было высказано мнение, что На,К-АТФаза может являться клеточным рецептором и мишенью действия эндогенных дигоксин-подобных факторов /ЭДФ/, циркулирующих в плазме крови животных и людей. Повышенное содержание ЭДФ было Найдено при различных патофизиологических состояниях, включая артериальную ги~ пертензию различного происхождения /Мао Gregor, dewardener, 1984/. Было обнаружено, что ЭДФ-являются специфическими, высокоафинными ингибиторами работы На,К-АТФазы и могут регулировать работу фермента разных клеток при этой патологии. Данные о наличии этих ингибиторов в организме животных и людей в нредгипертензивный период / Bosohi et al.,1989/ подразумевают изменение активности фермента уже на начальных этапах формирования этого заболевания.
С другой стороны, рядом исследователей были получены доказательства наличия определенных структурных и функциональных нару-иений в мембранном скелете эритроцитов при первичной АГ. В частности, было показано увеличение содержания белка полосы 3 в мембране эритроцитов у крыс shr /гулак и соа'вт., 1984/ и белков
_ 4 -
п.4.5 и 6 в мембране эритроцитов больных гипертонической болезнью /ГБ/ / Loginov et al., 1989/, выявлены изменения в процессах фо сформирования белка п.4.1 в мембране оригроцитов у крыс .г 1-і R / Postnov et al., 1986/. ;
- Исходя из вышесказанного, представляется вероятным существо
вание взаимосвязи между белками мембранного скелета и На,К-АТФазой,
которая, по-видимому, нарушена при АГ, что может приводить к опре
деленным изменениям в работе фермента при этой патологии. Все это
вызывает несомненный интерес к изучению активности и свойств Ыа,К-
АТФазы при первичной АГ и определило наши цели и задачи исследо
вания. '
Цели и задачи исследования. Цель данной работы - исследование регулирующего влияния белков мембранного скелета эритроцитов на функционирование Ша,К-АТФазы. Были поставлены следующие задачи:
-
Поиск оптимальных условий для выявления наибольшей активности На.К-АТФазы в мембранных препаратах эритроцитов с различным полипептидным составом.
-
Исследование регулирующего влияния периферических белков мембранного скелета на активность и свойства На.К-АТФазы.
Помимо изучения особенностей работы На.К-АТФазы в норме, было предпринято исследование активности и свойств этого фермента при первичной АГ. В связи с этим были поставлены следующие задачи:
1. Изучение активности и свойств На,К-А'і^зн в цельных эритро
цитах у лиц с пограничной артериальной гипертензией /ПАР/
и у людей с наследственной предрасположенностью к гипертонической болезни /ГБ/.
2. Исследование активности и свойств На,К- , Са- и Мо.~АТФаз в
мембранных препаратах эритроцитов с различным полипептидным
составом у крыс со спонтанной гипертензией / SHR /, у лиц
с НАГ и у больных ГБ. Научная новизна. Впервые проведено изучение активности и свойств На.К-АТФазы в 'мембранных препаратах эритроцитов с различным полипептидным составом: тени эритроцитов, "бесспектриновые" везикулы /мембраны, лишенные спектрина и актина/ и везикулы со "снятши1паяосами~спектрша"й актина"," белка п.2.1 и 4.1."Показано, чтб"Удаление этих периферических белков из мембраны эритроцитов сопровождается онижением активности На.К-АТФазы и потерей чувстви-
тельности фермента к модуляторам его работы.
Впервые определены оптимальные условия для выявления наибольшей активности Яа,К-АТФазы в мембранных препаратах эритроцитов с различным полипептидннм составом. Показано, что для определения наибольшей активности фермента необходимо.одновременное воздействие на эритроцитарную мембрану хелаторов и детергентов.
При изучении активности На.К-АТФазы в мембранных препаратах эритроцитов с различным полипептидным составом у спонтанно гипер-т.ензквных крыс и у людей на разных стадиях развития ГВ показано участие белков мембранного скелета эритроцитов в нарушении работы йа.К-АТФазы при первичной АГ.
. Впервые получены данные, свидетельствующие о пониженной активности ЯаД-АТФазы в эритроцитах у лиц с ПАГ и с наследственной отягощенностыо по ГБ.-Показано, что снижение активности Жа,К-АТФазы у людей в период развития АГ обусловлено присутствием у них в плазме крови эндогенных дигоксин-подобных факторов, ингиби-рущих активность На,К~АТФаэы в мембране.
Научно-практическая значимость работы. Полученные данные, свидетельствующие о важной роли белков мембранного скелета эритроцитов в функционировании интегральных мембранных ферментоз, позволяют углубить наши представления о механизмах регуляции транспортных АТФаз и, в частности, двухвалентными катионами, метаболитами и регуляторними белками.
Результаты исследований влияния мембранотропннх соединений на активность и свойства транспортных АТФаз в эритроцитах позволили выработать. подходы выявления высокой активности На.К-АТФазы В мембранных препаратах эритроцитов с различным полипептидным составом.
Изучение активности Яа.К-АТФазы у лиц в различные периоды развития гипертонической болезни позволило выявить определенные отличия в работе На.К-АТФазы у лиц с пограничной артериальной ги-яертензией и разработать "Способ диагностики предрасположенности к развитию гипертонической болезни". Подана заявка на признание метода изобретением и получен приоритет за № 1833220114, 60471 от 31.09.1990 г.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Установлено разное активирующее влияние детергентов и хела-торсв на активность На.К-АТФазы в мембранных препаратах эритроцитов с различным полипептидным составом.
-
Показана важная роль мембранного скелета эритроцитов в функционировании систем активного транспорта катионов /На.К-АТФазы
и Са-АТФазы/ в передаче модулирующего действия внутриклеточных регуляторов активности ферментов - Щ , Са и АТФ.
-
Продемонстрировано, что у людей с наследственной отягощен-ност'ью по ГБ и с пограничной артериальной гипертензией /ПАГ/ имеет место пониженная активность На.К-АТФазы в целых эритроцитах по сравнению с нормотензивными лицами .без Генетической предрасположенности к этому заболеванию.
-
Установлена высокая ингибирующая На.ІС-АТФазную активность способность плазмы крови лиц о ПАГ по сравнению-с плазмой контроля, что обусловлено присутствием у лиц с ПАГ повышенного содержания эндогенных ингибиторов фермента, очевидно ЭДФ, и свидетельствует о важной патогенетической роли ЭДФ на начальном периоде заболевания.
Апробация диссертации. Результаты работы докладывались на: Рабочих совещаниях по проблеме "Тонус" /1992, 1993 Санкт-Летербург/; № симпозиуме по проблемам патогенеза артериальной гипертензии и атеросклероза /Новосибирск, 1992/; на рабочем совещании по государственной общеакадемической програмгле "Обеспечение жизнедеятельности человека в процессе трудовой деятельности на основе вскрытий фундаментальных физиологических закономерностей" /Санкт-Петербург, 1990/; на заседании Санкт-Петербургского кардиологического общества им. Г.Ф.Ланге /Санкт-Летербург, 1991/; на годовых итоговых научно-практических конференциях больницы $16 и клиник Санкт-Петербургского Педиатрического Медицинского Института /Санкт-' Петербург, 1991/. '
Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы /3 главы/, описания методов исследования, экспериментальной части /3 главы/, заключения, выводов и списка литературы. Работа содержит 186 страниц машинописного текста, 3 таблицы и 18 ри-.суцков. Библиография включает 180 литературных источников, в том числе 155 иностранных.