Свойства и вероятные функции обратной транскриптазы эндогенных ретровирусов в дифференцированных клетках млекопитающих Томсонс, Вера Петровна

Введение к работе

Актуальность проблемы. Одной из. важнейших задач современное биологии является изучение механизмов функционирования генетического аппарата клетки. Вплоть до 70-го года существовало представ лепие о том, что генетическая информация передается только в направлении ДНК—«-РНК—-белок. Открытие в 1970 г. обратной транс-

Крпптазв Нарушило ЭТУ ДОГМУ ( Teoin, Mizutani, 19?С;' Baltiraore,

1970). Было показано, что обратная транскриптаза представляет собой ДНК-полимеразу, которая использует в качестве матрицы не тол* ко ДНК, но и РНК и обеспечивает таким образом перенос информации о РНК на ДНК. Обратная транскриптаза бнла открыта в составе онкс-генных РНК-содержащих ротрозирусов. Ввиду уникальной способности этих ретроЕЯрусов репродуцироваться через стадию ДНК-прокируса, они привлекли внимание спецгалистов разных разделов биологическое науки. Особое место среди ретровируссв эангдааят непатегашые эндогенные ретровирусы, геном которых также содержит ген рої , кодирующий обратную траяскриптазу, и синтезируемая при участии этого фермента кДНК эндогенного ретровируса встраивается в клеточчня геном, образуя проретровирусные ДКК, которые обчаруурны у з с ex изучении: в этом отношении эукарпот.

ЭКСПреССИЮ ОТДеЛЬНЫХ ГЄН03 ПрореТрСВИруСОВ, ТШГИТ КРК РЯ5С ,т

env, в неопухолевюс клетках удастся регзетр^рйг-ать ртіг<члтєяьно чшцв, чем появление цель" вирусов (Gtt,j.:, 1982). Лодоб?:гх "Г.ппь.-.г практически не? в отношении продукта гена nol . .Прнныз ирчг.'¹?. л середины 70-х годов о налячял обратяоЛ транг-триптвс'-' з иор-'^лню? клетка уже к кончу 70-х голов на раасгат\\'»-алксь как убглЕтельяк? Дело в том, что до 1970 г. о сущеетзеванал и эуаарйогачемях- клег ках нескольких ДНК-завпсшых ДНК-полатарг.з В" O'hjiv ;;я-чгопю, кт. естественно, и о свойствах втих ферментов, ^нсгио крлтеркч выявления активности обратной транскриптаэл в зупардогичес^кх ялотгя? о позицій приобретаемых знаний были уязвташ. Тажм сбрааоч, зг чекие десятилетия, последовавшего за оггрнтяем обратной троне-криптазн, падежных фактов, подтверждающих участие ртого фермента в процессах, происходящих в нормальной вдетое і п» ояярчттих с реялякацяей рстровирусов, получено не бШІО,

Значительным ербктиом явилось открытие в начале ОР-х годов в геноме эукар^тют структур, чрезвычайно подобии* прорптіар"ртс*" и пряняцпетащч.т иобмы'.та дарч^ргирок⁴¹';!''" п»[<пм (Г»^,"^,ртп'^,і " лт>

і Зої; Ильин, IS82). В этст зе период вреыыш при исследовании структуры некоторых типов повторяющихся последовательностей генома эукариот было обнаружено, что онп возникли скорее всего в результате обратной транскрипции псяя(А)⁺мРНК и последующей интеграции коїшй ДНК в геном ( Bogero, 1985 )

Следовательно, поток информации от ДНК к РНК и обратно в ЦНК, обнаруженный в случае ретровирусов, по-видимому, обеспечивает также амплификацию и невирусішх последовательностей. Представлялось вероятным, что наличие обратной транскриптазы в норыальных клетках взрослых животных могло бы обеспечивать ее физиологические функции, так как синтезированные с ее помощью с транскриптов индуцированных генов кДНК могли бы, с одной стороны, за. счет амплификации такого гена или его регуляторних последовательностей увеличить экспрессию данного гена (тзшіп, 1971), с другой стороны, сами эти кДНК или кодируемые ими РНК могли бы выступать в роли антисмысловых молекул, ингибируя трансляцш) индуцировшшых РНК (МоСаггау, Higgs, 1986).

Цель и задачи работы. Цель настоящей работы состояла в том, иобы выяснить, происходит ли экспрессия гена рої в нормальных клетках взрослых животных, регистрируется ли в таких клетках обратная транскрипция. Если атот процесс имеет место, то каковы свойства и источник обратной транскриптазы, а также можно ли получить какие-либо данные, указывающие на роль обратной транскриптазы в физиологических функциях клеток.

Для того, чтобы ответить на эти вопросы представлялось необходимым поэтапно решить следующие задачи :

1. Выяснить наличие РЖ-зависимой ДНК-полимеразной активности в нормальных клетках и тканях животных.

2. Из дифференцированных клеток животных выделить фермент, обладающий РНК-зависимой ДНК-полимеразной активностью, охарактеризовать его свойства и установить, соответствует ли он критериям, применяемым для идентификации обратных транскриптаз.

3. Выявить источник РНК-зависимой ДНК-полимеразной активности б нормальных дифференцированных клетках. Если это эндогенный ретровирус, то охарактеризовать его.

4. Исследовать, присутствуют ли проретровирусные гены в геноме айвотного и зкспрессируется ли ген рої в нормальных клетках

ВЗРОСЛОГО ЖИВО'СНОГО,

5. Иссярдойпть наличие корреляции м*5«ду FHK-завлсимой ДНК-

- р ..

полямеразной активностью и такими физиологическими процессами, как индукция экспрессии генов в клетках животного под действие».-гормонов, субстратов, в ходе иных физиологических процессов, а также в процессе онтогенеза.

6, Оценить возможные пути регуляции РНК-зависимой ДНК-полі'-
меразной активности в ходе физиологических процессов.

Научная новизна работа. Перечисленные ниже результати отнс оятся к числу наиболее ванных :

5. В нормальных клетках печени, мозга и других тканей взрос дых крыс регистрируется РНК-зависимая ДІК-полимаразная активності Впервые из дифференцированной ткани взрослого интактного животного (печень крыс) выделена РНК-зависимая ВШ-полимераза, способна копировать гетерополимерную РНК. Исследованы йэ свойства.

6. В печени крыс РНК-зависимая «НК-полимзразнзя активность обнаружена в цитозоле и в составе частиц фракции макросом.

7. Во фракции микросом печени крыс выявлены ретрозпрусопо-добные частицы, которые по морфологические признакам сходны о ретровируоогодобннми частицами А-тяпа. С помощью дої-гибридигацш' установлено, что они представляют собой пнтрздистерпальнне А-чзс-типы (МЧ), относяциеоя к группе зндогенних ретровируссъ тяна К. Таким образом, впервые показано наличие частиц эндогенных ратр-v-вирусоз в нормальных тканях взрослнх крнс.

8. Из фракции микросом печени крнс, обогащенной ШЧ, п'—уч? на РНК-зависимая ДНК-полимераза, подобная РКК-завискмой дИК-попи-неразе из гомогената печени крыс, котсрся по основним чссладсзан-кем сройствагл : по способности копировать гг?ерестоликоркуп ^РШ\, оптимуму рН, отношению к Me к Йе .'^чувствительности К ЇТ-ЗТИІ малеимиду, овдпментациониой характеристико л сродству v «o^oorf-кеннчкам, аналогична обратным транскраптазда ретровируоов. Среди продуктов синтеза обнаружены гибридные РНГС-ДНК-молекулн.

9. Показано, .что такие ирорзтроварусние гены, как jrug я р.о., содержатся в составе геномной ДНК ряда исследованных тканей Kpw.

8. Впервые установлено, что в нормапьннх тканях взрослых крыс происходит экспрессия pol-гена 1ІАЧ на уровне транскрипции « трансляции. Cyi/wa полученных данных позволяет заютештт-, что о" ним из основных источников обратной трапокритгазк ц wiv">wiv-$ прчечп взросята крнс являются НАЧ.

7. Исследовано паличко корреляции чр*яу ин^у»№!?!* итопе^гоп
инт?исивн"1 чкепрвесич гепої- и yT^'mT'ww FHK- -тч^-ічигА уж. ц>-

- .1 -

.іьіеразной ыдцшюсте. Показано, что повшаеяие РНК-зависіїмоіі ДНК-«олимеразной активности в регенерирующей печени крцо совпадает по ир-мзнц с усилением ДКК-давикоюго синтеза РНК, но не о периодом интенсивной репликации ДНК. Усиление РНК-зависимой ДНК-полимераз-ной активности сопровождает экспрессию генов, кодирующих адаптмв-ішь ферменты, индуцированные введением животным индукторов . ірааскрипции ' Возрастание ДНК-зависимого синтеза РНК в гип-імкампе крыс в периог консолидации шмяти при обучении совпадает с усилением РНК-зависимой ДНК-полимеразной активности. Полученные дашие указывают на наличие взаимосвязи между интенсивностью обратной транскрипции и экспрессией генов в дифференцированных клыках взрослых животных, хотя и не позволяют пока говорить о конкретной роли ее в этом процессе.

На защиту выносятся следующие положения:

10. Определенный уровень экспрессии эндогенных ретровирусов характерен не только для эмбриональных и дифференцирующихся клеток, но и для дифференцированных клеток взрослого животного.

11. В печени взрослых интактных крыс присутствует обратная гранскриптаза, источником которой являются эндогенные ретровируоы.

12. Существует корреляция между индукцией экспрессии генов и ґНК-зависишй ДНК-полимеразной активностью.

Практическая значимость работы. Выполненная работа носит теоретический характер. Полученные данные углубляют и расширяэт знания об эндогенных ретровирусах *і их белках, функциях, которые они могут выполнять в нормальной клетке. Результаты могут быть использованы в работах ряда институтов, занимающихся вопросами регуляции экспрессии генов, ролью обратной транскриптазы в жизнедеятельности нормальной клетки (Институт цитологии и генетики, Инсіитут молекулярной биологии, Институт общей физиологии, Институт молекулярной генетики и др.). Результаты работы используются при чтении курса лекций по молекулярной биологии в Новосибирском юсу царственном университете.

Апробация работы. Представленные б диссертации результаты доло*ени на 4- ы и 5- м Всесоюзных биохимических съездах (Ленинград, 1979; Киев, 1986), на 16-ом съезде Европейских биохимичео-ких .збщесги (Москва, I9S4), на 4-'м и 5-,м съездах ВОГиС им. Н.И. Вавилова (Кишенев, 1Ь82; Москва, 1987), на Международном симпозиуме "Оціанизация и экспрессия тканеспецифичеоких генов" (Новосибирск, 198:2), на Всесоюзных симпозиумах "Макромолекулы клетки :

. 4 -

структура, функции, взаимодействие" (Москва, IS79; IS84), на Все союзном симпозиуме "Виротерапия и искусственная гстерсгенизация опухолей" (Рига, 1977), на 9-м Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Черноголовка, 1987), на 5- м и 6- м Всесоюзных симпозиумах "Молекулярные механизмы генетических процессов (Москва, 1983; 1987), на Международных рабочих совещаниях "Ревертаза-оякоген" (Юрмала, 1982; Любицы, ЧССР, 1984;-Варна, Болгария, 1985).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 8 глав, выводов и списка цитируемой литературы (554 источника). Главы I и 2 представляют обзор литературных данных, главы с З- й по 7-ю - описание и обсуждение собственных результатов, глава 8 - общее обсуждение основных результатов исследования. Работа изло явна на 2SI странице и включает 15 таблиц и 49 рисунков.

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики СО АН СССР, в лаборатории молекулярной генетики, возглавляемой чл.-кррр. АН СССР Р.И. Салгаником, которому глубоко признательна за постоянный интерес, вникание и систематическую помощь. Настоящая работа является обобщением результатов экспериментов, проведенных мною ляч но и совместно с коллегами, возглавляемой .мной группы: ВсревклиоР К.Н., Пыриновой Г.Б., Короховым Н.П., Куприяновой О.А., а такгто совместно с коллегами нашей лаборатории.Древі'.ч П.Ф., Кнорре В.Л. и Соловьевой Н.А., с коллегами других .лабораторий Института: Иль-ницкой СИ., Киселевой Е_еВ., Матиенко II.А., Ншсолвлым В.П., Рома-щенко А.Г., Христолюбовой Н.Б., Шуйской К.А., с коллегам Ногоси-бирского института биоорганической химии СО АН СССР: Віїлішезіки'; С.Н, и Мертвецовым Н.П., котором выраглю искчоннеп прирнат&ш'оотт-и благодарность.