Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы. роль свободнорадикального окисления в живых системах
1.1 Свободные радикалы и их биологическая роль 9
1.2 Система антиоксидантной защиты организма 14
1.2.1 Ферментативное звено антиоксидантной системы 14
1.2.2. Низкомолекулярные антиоксиданты 19
1.3 Липидпероксидация и окислительная модификация белков 24
1.4 Процессы свободнорадикального окисления в послеродовый период крупного рогатого скота 30
Основная часть 35
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования 35
2.1 Общая характеристика объектов исследования 35
2.2 Методы исследования
2.2.1 Хемилюминесцентный метод 37
2.2.2 Определение биохимических параметров 40
2.2.3 Статистический анализ 43
ГЛАВА 3. Результаты исследований 44
3.1 Свободнорадикальные процессы крови коров при эндометрите
3.1.1 Хемилюминесцентный анализ плазмы крови коров 44
3.1.2 Интенсивность процессов липидпероксидации эритроцитов и плазмы крови коров
3.1.3 Уровень спонтанных и индуцированных карбонильных производных белков крови коров 58
3.2 Процессы свободнорадикального окисления молока коров при эндометрите 63
3.2.1 Хемилюминесцентный анализ молока коров 63
3.2.3 Показатели липидпероксидации молока
3.2.3 Окислительная модификация белков молока
3.3 Компоненты антиоксидантной защиты крови и молока коров 79
Заключение 88
Список сокращений и условных обозначений 110
Список литературы
- Ферментативное звено антиоксидантной системы
- Хемилюминесцентный метод
- Интенсивность процессов липидпероксидации эритроцитов и плазмы крови коров
- Окислительная модификация белков молока
Введение к работе
Актуальность работы. Одним из сдерживающих факторов интенсивного воспроизводства крупного рогатого скота являются часто возникающие у коров функциональные расстройства органов репродуктивной системы, ведущие к длительному или постоянному бесплодию. Важным звеном патогенеза акушерско-гинекологических заболеваний сельскохозяйственных животных является дисбаланс про- и антиоксидантов и нарушения в системе гормональной регуляции (Нежданов А.Г. и др., 2012).
При развитии воспалительных процессов матки в послеродовый период повышение
концентрации монооксида азота связывают с резким возрастанием продукции активных форм
кислорода фагоцитами (O. Kizil et al, 2010; Сафонов В.А. и др., 2014). Клинические
проявления острого послеродового эндометрита сопровождаются повышением
прооксидантной и снижением антиоксидантной активности, высоким уровнем малонового диальдегида крови, что указывает на развитие окислительного стресса (Степанова И.П., 2009).
Развитие окислительного стресса у таких животных сопровождается снижением содержания в крови неферментных компонентов антиоксидантной защиты – витаминов А, Е, С, и -каротина, при котором в патологический процесс вовлекаются не только репродуктивная система, но и печень, почки, сердце (Сафонов В.А и др., 2014).
У животных с острым послеродовым эндометритом наблюдается компенсаторное
включение механизмов ферментативного звена антиоксидантной защиты, которое
выражается в повышении активности супероксиддисмутазы, каталазы,
глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы (Близнецова Г. Н., 2010)
Патологические процессы, возникающие в репродуктивных органах коров в послеродовый период, отрицательно действуют на функцию молочной железы (Макаров А.В., 2008), нарушается аминокислотный и жирно-кислотный состав молока, что может приводить к активации липидпероксидации и окислительной деструкции белков.
Несмотря на отдельные данные об увеличении интенсивности свободнорадикальных
процессов при эндометрите коров отсутствуют комплексные исследования
свободнорадикального повреждения различных биомолекул, для уточнения патогенеза этого состояния необходима сравнительная характеристика процессов липидпероксидации и окислительного повреждения белков крови и молока коров в послеродовый период.
Цель работы: выявить особенности свободнорадикального окисления липидов, белков крови и молока коров при эндометрите.
Задачи:
-
Исследовать интенсивность хемилюминесценции плазмы крови и молока коров при разном течении эндометрита.
-
Изучить показатели, характеризующие интенсивность пероксидации липидов плазмы крови, эритроцитов и молока коров при остром послеродовом и хроническом эндометрите.
-
Определить особенности окислительной деструкции белков плазмы крови и молока коров при остром послеродовом и хроническом эндометрите.
-
Определить активность компонентов антиокислительной системы крови и молока коров при остром послеродовом и хроническом эндометрите.
Научная новизна. В результате проведённого комплексного исследования установлены особенности нарушений свободнорадикального окисления липидов, белков крови и молока коров при разном течении эндометрита. Снижение антиокислительной активности и повышение способности компонентов плазмы крови и молока подвергаться свободнорадикальным процессам выявлено у коров в большей степени при хроническом эндометрите, чем у животных с острым послеродовым эндометритом.
Впервые обнаружено повышение содержания гептан- и изопропанол-растворимых продуктов липидпероксидации плазмы крови у коров как при остром послеродовом, так и
при хроническом эндометрите. Более выражены процессы липидпероксидации при хроническом эндометрите в эритроцитах, чем в плазме крови коров. В молоке коров уровень продуктов перекисного окисления нейтральных липидов выше при хроническом эндометрите, чем у коров с острым послеродовым эндометритом.
Впервые выявлено повышение уровня карбонильных производных белков при спонтанной и индуцированной окислительной модификации в плазме крови и молоке коров как с острым послеродовым, так и с хроническим эндометритом. Образование карбонильных производных белков происходит преимущественно за счет спонтанного окисления остатков аминокислот, обладающих основными свойствами. Более выраженная индуцированная окислительная модификация белков плазмы крови выявлена в группе коров с хроническим эндометритом, в противоположность спонтанной окислительной модификации белков, нарушения которой более выражены в плазме крови коров с острым послеродовым эндометритом. В молоке наблюдалось наибольшее повышение уровня показателей как спонтанной, так и индуцированной окислительной модификации белков у коров с хроническим эндометритом.
Установлено снижение функционирования антиоксидантной системы крови и
молока коров при остром послеродовом и хроническом эндометрите.
Научно-практическая значимость.
Полученные новые научные факты дополняют представления о патогенезе
эндометрита коров, патогенетической значимости активации процессов
свободнорадикального окисления, роли метаболических нарушений, вызывающих изменение реактивности организма. Нормализация показателей у животных группы без клинических признаков эндометрита после лечения, свидетельствует об эффективности терапии и подтверждает тезис о важной роли активации свободнорадикального окисления в патогенезе эндометрита коров.
Продолжительная активация процессов липидпероксидации и повышение уровня карбонильных производных при спонтанной и индуцированной окислительной модификации белков крови и молока коров с хроническим эндометритом свидетельствует об информативной значимости определения показателей липидпероксидации и окислительной деструкции белков.
Внедрение результатов исследования. Результаты исследований внедрены в учебный процесс на кафедре диагностики, внутренних незаразных болезней, фармакологии, хирургии и акушерства Института ветеринарной медицины и биотехнологии ФГБОУ ВО Омский ГАУ
Методология и методы исследования. Исследования выполнены в летний период на
базе хозяйств Омской области ФГУП ОПХ «Омское» и ООО «Лузинское молоко».
Исследование проведено согласно дизайну «случай-контроль» и носит характер открытого, контролируемого.
Изучение метаболических нарушений у коров при эндометрите проведено на базе
ФГБОУ ВО «Омского государственного аграрного университета имени П.А. Столыпина».
Интенсивность свободнорадикального окисления определяли биофизическими методами,
биохимические методы служили для оценки активности антиокислительной системы
организма животных. Статистическая обработка материалов осуществлялась с
использованием программных пакетов анализа Statisticа 6.0 с использованием методов описательной и вариационной статистики. Для сравнения количественных показателей двух независимых групп использовали непараметрический U-критерий Манна-Уитни.
Положения, выносимые на защиту:
-
При эндометрите коров повышена интенсивность хемилюминесценции плазмы крови и молока.
-
У животных с хроническим эндометритом свободнорадикальное повреждение липидов и белков выражено в большей степени и имеет особенности в сравнении с показателями коров с острым послеродовым эндометритом.
3. При остром послеродовом и хроническом эндометрите снижена активность
антиоксидантной системы крови и молока коров
Апробация работы и публикации. По теме диссертации опубликованы 12 научных работ, из них 5 статей - в журналах, включенных в перечень изданий, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ для публикации диссертационных материалов. Результаты исследований доложены на Международных и Российских конференциях: на VIII научно-практическойя конференции аспирантов и соискателей «Методология в науках агропромышленного комплекса» (Омск, 2012); на Межвузовской научной конференции «Свободнорадикальные повреждения тканей и продуктов питания» (Омск, 2013); на VII Международной научно-практической конференции «Технология и продукты здорового питания» (Саратов, 2013); на Международной научно-технической конференции молодых ученых "Современный взгляд на производство продуктов здорового питания", посвященной 95-летию ФГБОУ ВПО ОмГАУ им. П.А. Столыпина (Омск, 2013); на II Всероссийской научной интернет-конференции с международным участием «Химическая наука: современные достижения и историческая перспектива» (Казань, 2014); на I Международной научно-практической конференции магистрантов, аспирантов и молодых ученых «Инновации в развитии сельскохозяйственного производства в современной России и Казахстане», посвященной Дню российской науки, секция «Ветеринария и зоотехния» (Омск, 2015)
Личный вклад автора. Участвовала в планировании диссертационного
исследования, непосредственно проводила литературный поиск, биохимические
исследования крови и молока крупного рогатого скота, осуществляла статистический анализ. Материал, представленный в диссертации, собран, обработан и проанализирован лично автором.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 135 страницах. Диссертация включает разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований, заключение, выводы, список литературы. Работа содержит 22 таблицы, 3 рисунка, 2 схемы и 5 приложений. Список литературы включает 184 источников, в том числе 75 работ на иностранных языках.
Ферментативное звено антиоксидантной системы
В настоящее время проблема свободнорадикального окисления в живых организмах привлекает внимание не только биологов, медиков, ветеринаров, но и исследователей пищевых отраслей. Это обусловлено тем, что активные формы кислорода, продуцируемые при многих ферментативных и неферментативных реакциях, участвуют в разнообразных физиологических и метаболических процессах, от которых зависят гомеостатический уровень всех функциональных систем организма [21].
В 1958 году Н. М. Эммануэль высказал предположение, что в возникновении и развитии злокачественных новообразований свободнорадикальные повреждения могут играть важную роль [109]. Исследования, проведенные в последнее десятилетие показали, что свободные радикалы (СР) являются ключевыми элементами регуляции многих физиологических процессов на всех уровнях: от регуляции активности внутриклеточных ферментов до нервной регуляции сократительной функции желудка и внешнего дыхания. Участие одних и тех же молекул в повреждении клеток и тканей, в их защите от внешней агрессии и в процессах внутри- и межклеточного взаимодействия заставило исследователей по-новому взглянуть на биологическую роль радикалов и их участие в патологических процессах [76] .
Основная масса потребляемого человеком молекулярного кислорода вовлекается в митохондриях в реакции окислительного фосфорилирования. Однако в результате транспорта электронов около 5% кислорода превращается в его активные формы (АФК): О2-, 1О2, Н2О2, НО, ОСl- и др. [41, 46, 110]. Часть этих соединений относятся к свободным радикалам, имеющим неспаренные электроны.
Свободные радикалы, образующиеся в клетках - это радикалы кислорода, монооксида азота, ненасыщенных жирных кислот и радикалы других соединений. Некоторые активные формы кислорода нерадикальной природы такие, как пероксид водорода, синглетный кислород, гипогалогениты взаимодействуют с биомолекулами через радикальные механизмы [32]. Для объединения данных соединений в одну группу введено понятие «активные кислородные метаболиты» (Схема 1), которым обозначают высокореакционные соединения радикальной и нерадикальной природы, образующиеся в клетках в результате неполного восстановления О2 или изменения спина электрона, на внешней орбитале [51, 76]. Свободные радикалы Кислородные радикалы Гипогалоиды GS, R, NO , RO, R02, О, H02, OH, H202, !02, НОСІ, HOBr, HOI Активные формы кислорода Активные кислородные метаболиты Схема 1 Свободные радикалы и активные кислородные метаболиты Согласно современным представлениям все СР можно разделить на три группы в зависимости от происхождения и биологического действия.
Первичные - образуются при одноэлектронном окислении молекул при участии металлов переменной валентности. К ним относится супероксид-анион-радикал (02), монооксид азота (NO), убихинон (коэнзим Q). Первичные радикалы обладают малой мембранотоксичностью и не оказывают на организм патогенного действия, быстро переходя в молекулярные продукты. Они участвуют в процессе жизнедеятельности здоровой клетки и их устранение может привести к негативным последствиям. Вторичные свободные радикалы образуются из первичных в результате цепных реакций процессов перекисного окисления липидов. К ним относят гидроксилъный радикал (ОН) и липидные радикалы. Образование свободных радикалов при разложении пероксида водорода и липидных перекисей под действием ионов железа (реакция Фентона), оказывает на клетку мутагенное действие, обладая высокой цитотоксичностью. Действие вторичных свободных радикалов приводит к развитию различного рода патологии - сердечно-сосудистые заболевания, сахарный диабет, злокачественные новообразования, атеросклероз и др.
При взаимодействии вторичных радикалов с молекулами антиоксидантов и других легкоокисляющихся веществ образуются третичные радикалы. Они обладают меньшей реакционной способностью, что приводит к замедлению процессов свободнорадикального окисления [25, 76].
Современные методы исследований позволяют выявить наличие в биологических системах до 800 различных органических радикалов. Характеристика наиболее реакционноспособных активных форм кислорода (АФК), играющих важную роль в организме животных и человека представлена ниже.
Супероксид-анион-радикал ГО?Ч образуется либо НАДФН-оксидазным комплексом цитоплазматической мембраны или мембраны эндоплазматического ретикулума [111, 112, 167, 168], либо в дыхательной цепи внутренней мембраны митохондрий [181]. Время жизни супероксид-анион-радикала (О2 ) составляет 10–6 с, что определяет радиус его действия - около 0,3 мкм [38]. Супероксидный анион-радикал важен для реализации микробицидного, цитотоксического и иммунорегуляторного действия фагоцита. [35]. Вследствие своей высокой гидрофильности, супероксид-анион-радикал не может покидать клетку и накапливается в цитоплазме. О2 обладает достаточно высокой реакционной способностью, за счет чего, с одной стороны, имеет бактерицидные свойства, с другой - повреждает клетки [10, 88].
Радикал, имеющий также большое значение в жизни клетки, - монооксид азота II (NO), непрерывно образуемый в реакции дезаминирования L-аргинина, при участии NO-синтаз [15]. Неспаренный электрон на внешней орбитали в NO -радикале делает его реакционноспособным в отношении других радикалов и молекул. Супероксид-анион-радикал (О2) способен уменьшать содержание NO -радикала в результате взаимодействия, с образованием токсичного пероксинитрита (ONOO ). В некоторых исследованиях NO рассматривают как антиоксидант, который взаимодействуя со свободными и связанными в геме ионами Fe+, тормозит окислительные реакции, ингибируя распад перекисей [113]
К первичным радикалам также относят убихинон (коэнзим 0\ выполняющий функцию переноса электронов в дыхательной цепи митохондрий. Он участвует в образовании АФК, в результате окислительно-восстановительных реакций, убихинон и его радикал могут переносить электроны на молекулярный кислород с образованием супероксид-анион радикала. При этом убихинон является не только основным прооксидантом митохондрий, но и главным антиоксидантом. Убихинон эффективно взаимодействует с кислородными радикалами О2 , ОН, RO и R02. Взаимодействие его с радикалами жирных кислот RO/ в митохондриях клеток эукариот и тромбоцитах человека, где выявлено низкое содержание витамина Е, убихинон выступает в качестве основного липофильного антиоксиданта [118, 169].
Отсутствие в сыворотке компонентов восстанавливающих убихинон позволяет использовать соотношение окисленной и восстановленной формы в качестве маркера развития окислительного стресса или окисленной модификации липопротеинов.
Гидуоксшьный радикал (ОН) Скорость окисления гидроксильным радикалом большинства органических соединений сравнима со скоростью диффузии молекул, а радиус миграции сравним с радиусом органических молекул, поэтому можно утверждать, что ОН реагирует с первой попавшейся молекулой без какой-либо субстратной избирательности [76]. В настоящее время доказано участие гидроксильных радикалов в микробицидном и туморицидном действии лейкоцитов. Цитотоксические свойства активных кислородных метаболитов на 50% связывают с гидроксильным радикалом [145].
Хемилюминесцентный метод
Определение продуктов липидпероксидации. Использовали методические приёмы, рекомендованные И.А. Волчегорским с соавт.( 2000). Метод основан на способности перегруппировки двойных связей при переокислении жирных кислот, с образованием диеновых конъюгатов [99, 138]. Подобная перестройка полиеновых ацилов сопровождается изменением спектра поглощения липидов в ультрафиолетовом свете, появляется достаточно очерченный максимум при 230 – 238 нм. Это обстоятельство позволяет судить о содержании гидроперекисей в липидном экстракте по величине его оптической плотности при этих длинах волн. Окислительная деструкция гидроперекисей сопровождается появлением еще одного максимума в спектре поглощения. Границы максимума находятся в диапазоне 260 – 290 нм. Наряду с триеновыми конъюгатами к веществам, обусловливающим поглощение в этой области спектра, относятся еще более 18 карбонильных интермедиатов перекисного окисления липидов [8].
Методика определения. К 0,5 мл исследуемого образца, эритроцитов, плазмы крови или молока, добавляли 5 мл смеси гептан-изопропанолового спирта (1:1), в течение 20 мин встряхивали в закрытых пробирках. Экстракт освобождали от белкового преципитата центрифугированием, разбавляли смесью гептан-изопропанола и смешивали с раствором соляной кислоты (рН=2). Через 30 минут осторожно декантировали верхнюю (гептановую фазу) и добавляли 1 см3 кристаллического NaCl к нижней (водно-спиртовой) фазе. Еще через полчаса декантировали освобожденную от воды изопропанольную фазу экстракта. Спектрофотометрию каждой фазы липидного экстракта проводили на спектрофотометре при трех длинах волн – 220, 232, 278 нм в кварцевых кюветах толщиной 1 см против соответствующего оптического контроля. Необходимость использования двух фаз вызвана особенностями экстрагирования, так в гептан экстрагируются в основном нейтральные, а изопропанол – полярные липиды, в том числе фосфолипиды, являющиеся важными субстратами свободно-радикального окисления липидов [99].
Результаты выражали в единицах индексов окисления (е.о.и.): Е232/220 относительное содержание первичных продуктов окисления (диеновые конъюгаты (ДК)), Е278/220 - относительное содержание вторичных продуктов окисления (кетодиены и сопряженные триены (КД/СТ)).
Спектрофотометрическое определение конечных продуктов липидпероксидации проводили по методическим рекомендациям Львовской Е.И. (1991) [59]. Содержание конечных продуктов липидпероксидации определяли при длине волны 400 нм по величине оптической плотности гептановых и изопропанольных фаз липидных экстрактов. Относительное содержание шиффовых оснований рассчитывали по отношению значения оптической плотности при 400 нм к поглощению при 220 нм (Е400/220). Последняя величина является показателем содержания изолированных двойных связей в экстрагированных липидах, которые являются субстратами свободнорадикального окисления. Определение уровня окислительной модификации белков Метод оценки окислительной модификации белков (ОМБ) основан на взаимодействии окисленных аминокислотных остатков с 2,4 динитрофенилгидразином (ДНФГ) - метод Reznick A.Z. & Parker L. В в модификации Дубининой Е.Е. [75].
Методика определения. Окислительную модификацию белков определяли по интенсивности окрашивания исследуемой пробы с 0,1 М 2,4-динитрофенилгидразином.
Замеры оптической плотности обеих проб (опытной и контрольной) против дистиллированной воды проводили при длинах волн: 356, 370, 430 и 530 нм, что позволило определять алифатические альдегид-динитрофенилгидразоны, кетон-динитрофенилгидразоны нейтрального и основного характера. Определение активности каталазы по методу Королюка М.А. (1988) Инкубировали пробирки при 370С в течение 5 минут, после чего реакцию останавливали добавлением 1 мл 4% раствора молибдата аммония. Интенсивность окраски измеряли на спектрофотометре при длине волны 410 нм против контрольной пробы [67, 89]. Определение активности супероксиддисмутазы Определяли активности супероксиддисмутазы эритроцитов и молока коров по величине ингибирования реакции восстановления 2-(4-йодфенил)-3-(4 нитрофенол)-5-фенилтетразолиумхлорида в присутствии супероксидного радикала генерируемого реакцией ксантина с ксантиноксидазой. Исследования проведены на биохимическом анализаторе «ScreenMaster» производства фирмы «Hospitex» с использованием набора реактивов фирмы «RANDОX» (Великобритания). Для определения активности СОД использовали гемолизат отмытых эритроцитов крови и обезжиренное молоко. Определение активности глутатионпероксидазы Активность глутатионпероксидазы определяли по способности окислять глутатион при помощи гидроперекиси кумина. В присутствии глутатионредуктазы и НАДФ, окисленный глутатион восстанавливается с соответствующим окислением НАДФН в НАДФ+. Определяли снижение оптической плотности при длине волны 505 нм. Исследования проведены на биохимическом анализаторе «ScreenMaster» производства фирмы «Hospitex» с использованием набора реактивов фирмы «RANDОX» (Великобритания). Для определения активности глутатионпероксидазы использовали гемолизат эритроцитов крови и обезжиренное молоко. Содержание гемоглобина в пробе эритроцитов гНb/л определяли гемоглобинцианидным методом.
Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета программ Statistic 6.0 [86]. Проверка на соответствие признака нормальному закону распределения проведена по критерию Шапиро-Уилки. При несоответствии признака закону нормального распределения в группах определяли медиану (Ме) и межквартильные интервалы [Q1 и Q3]. Оценку статистической значимости различий проводили с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни (U). Критический уровень значимости при проверке нулевых гипотез был принят на уровне р=0,05.
Интенсивность процессов липидпероксидации эритроцитов и плазмы крови коров
Уровень индуцированных карбонильных производных белков нейтрального характера сохранялся повышенным и в плазме крови животных после лечения, без клинических проявлений эндометрита: содержание АДФГ (356 нм) - на 40%; КДФГ (370 нм) - на 34%. Наибольшее повышение определено для индуцированных карбонильных производных основного характера: АДФГ (430 нм) - в 1,6 раза и КДФГ (530 нм) - в 1,7 раза по сравнению с животными контрольной группы. Таким образом, если спонтанная окислительная модификация белков плазмы крови животных после лечения, группы БКПЭ не отличалась от контрольной группы коров, то индуцированная окислительная модификация сохранялась на высоком уровне, что может указывать на сохранение условий для активации свободнорадикального окисления белков и низком уровне резервно адаптационных возможностей. Наибольшее увеличение содержания индуцированных карбонильных производных у коров с хроническим эндометритом может указывать на снижение уровня антиокислительной системы. Повышение уровня карбонилированных производных при спонтанной и индуцированной окислительной модификации белков плазмы крови коров с острым послеродовым и хроническим эндометритом отражает развитие окислительного стресса при данном заболевании, а нормализация некоторых показателей у животных после лечения группы БКПЭ, подтверждает эффективность проведённого лечения. Процессы свободнорадикального окисления молока коров при эндометрите Молоко – секрет железистых клеток коров репродуктивного возраста, и его химический состав, физико-химические свойства отражают физиологическое состояние, особенности метаболизма целостного организма животных.
Интенсификация свободнорадикального окисления и разнонаправленных изменений антиокислительной системы организма животных сопутствует многим адаптивным или патологическим процессам [22, 49, 71]. В предыдущих исследованиях (глава 3.1 диссертации) нами установлены нарушения свободнорадикальных процессов в крови коров больных эндометритом в послеродовый период. Однако нельзя исключить изменения уровня отдельных компонентов молока крупного рогатого скота при патологии репродуктивных органов, о чем свидетельствуют данные А.В. Макарова с соавт. (2009) [61].
Так, изменение интенсивности метаболических процессов, активности ферментов крови при таких состояниях, по мнению автора, отражаются на химическом составе молока. В этих исследованиях [61, 63] выявлено увеличение ТБК-активных продуктов, белков плазмы крови и сывороточных белков молока коров больных хроническим эндометритом.
Однако отсутствуют сведения об уровне показателей свободнорадикальных процессов молока при нормальном и патологическом функционировании репродуктивных органов животных. В этой связи является актуальным вопрос о состоянии свободнорадикального окисления (СРО) компонентов молока крупного рогатого скота, как критерия патологии, контроля безопасности и биологической ценности молочных продуктов. В следующей серии наших исследований методом хемилюминесценции определяли следующие параметры Fe2+ - индуцированной люминолзависимой хемилюминесценции молока коров: светосумма, спонтанная светимость, амплитуда медленной и быстрой вспышки. Инициировали СРО раствором сульфатом железа (II). Результаты исследований параметров хемилюминесценции представлены в таблице 9.
В проведенном исследовании установлены статистически значимые различия в показателях хемилюминесценции молока коров с клиническими признаками эндометрита. В группе животных с ОПЭ значение спонтанной светимости молока на 14,9% и у коров c ХЭ на 11,2% выше, чем в контрольной группе. Это свидетельствует, что в молоке уровень свободных радикалов без добавления инициирующих веществ выше как при остром послеродовом, так и при хроническом эндометрите. В группе животных после лечения, без клинических проявлений эндометрита (БКПЭ) интенсивность спонтанной светимости молока коров не отличалась от показателей контрольной группы.
Значение быстрой вспышки, отражающее содержание гидроперекисей в пробе, выше только в молоке коров больных ХЭ (на 19,9%). Изменений быстрой вспышки молока коров с ОПЭ и БКПЭ не установлено.
Показатели максимальной светимости молока животных больных ОПЭ и ХЭ, выше контрольной группы на 22,4% и 43,6%, соответственно, что указывает на повышенную способность компонентов молока к окислению в присутствии ионов двухвалентного железа. В группе животных без клинических признаков эндометрита после лечения значения максимальной светимости молока статистически не отличались от показателей контрольной группы.
Окислительная модификация белков молока
В настоящей работе исследована интенсивность процессов свободнорадикального окисления и антиокислительной защиты крови и молока коров в разные стадии воспалительного процесса послеродового периода. Полученные нами результаты согласуются с данными других исследователей об интенсификации свободнорадикального окисления при развитии патологии репродуктивных органов. В работах Н.В. Пасько (2009) показано изменение отдельных показателей хемилюминесценции плазмы крови коров с субинволюцией матки: установлено возрастание светосуммы и значений максимальной вспышки. Нами также определено возрастание этих параметров хемилюминесценции в плазме крови коров при различном течении эндометрита. При этом, уровень свободных радикалов без добавления инициирующих веществ в плазме крови коров выше при хроническом эндометрите в сравнении с острым послеродовым эндометритом. При сравнении показателей хемилюминесценции плазмы крови коров, определено, что наибольшая способность компонентов системы плазмы крови подвергаться процессам свободнорадикального окисления у коров больных хроническим эндометритом. На это указывает возрастание светосуммы хемилюминесценции животных с хроническим эндометритом на 21,1%, в группе коров с острым послеродовым эндометритом на 16,3%. Аналогичные изменения определены и в отношении максимально возможной интенсивности перекисного окисления липидов (максимальная светимость) плазмы крови коров - выше на 49,7% и 43,5% в сравнении с контролем. У животных после лечения (БКПЭ), показатели хемилюминесценции значимо не отличались от контрольной группы, кроме значения максимальной светимости, что указывает на повышенную возможность липидов плазмы крови подвергаться процессам свободнорадикального окисления. Это может быть вызвано увеличением ненасыщенных жирных кислот в составе липидов плазмы крови таких животных, окисление которых, главным образом, приводит к генерации свободных радикалов, взаимодействующих с кислородом и образующих пероксиды, которые рекомбинируют, излучая кванты света.
При определении антиоксидантной активности с использованием модельной системы, полученной из липопротеинов куриного желтка по методу Г.И. Клебанова, (2006), нами установлено снижение антиокислительной активности плазмы крови. В послеродовой период при развитии острого послеродового эндометрита антиокислительная активность снижается на 19,8%. Наименьшая способность угнетать хемилюминесценцию модельной системы, обнаружена у животных с хроническим эндометритом – 24,77%, что ниже значения контрольной группы на 37,5% и группы с острым послеродовым эндометритом на 22,0%. Антиокислительная активность плазмы крови группы животных без клинических признаков эндометрита (БКПЭ) после лечения повышается, но не достигает значений контрольной группы. Эти результаты подтверждают данные Н.Н. Горб и др. (2012) полученные методом Д.Н. Маянского (1996), где в качестве тест системы использовали лейковзвесь здоровых животных.
Повышение содержания лейкоцитов при эндометрите [62] может быть одним из факторов интенсификации процессов липопероксидации, которое сопряжено с активацией миелопероксидазы в лейкоцитах. Поэтому усиление свободнорадикального окисления можно рассматривать в качестве одного из звеньев патогенеза заболеваний репродуктивных органов крупного рогатого скота. В результате этого представляется в одинаковой степени возможность как интенсификации липидпероксидации, так и активации окислительной модификации белков.
По данным А.В. Макарова (2010), хронический эндометрит сопровождается повышением в плазме крови больных животных содержания малонового диальдегида (МДА) как вторичного продукта липидпероксидации [62]. Однако МДА находится в организме в достаточно высоких стационарных концентрациях и принимает участие в различных биохимических процессах, изменение его содержания, не может быть специфичным показателем интенсивности перекисного окисления липидов. Определение его содержания по реакции с тиобарбитуровой кислотой не дает объективной информации об изменении именно уровня малонового диальдегида в биологических системах, так как кроме него в эту реакцию вступает более 40 различных карбонильных производных. В работах Г.Н. Близнецовой (2010) и Н.В. Пасько (2009) определено содержание первичных, вторичных (МДА) и конечных продуктов липидпероксидации крови коров с субинволюцией матки в послеродовый период [9, 79], показано повышение уровня диеновых конъюгат и шиффовых оснований нейтральных липидов, определённых по методу В.С. Бузлама и др. (1997) [79].
Для уточнения механизма окислительной деструкции компонентов крови в настоящей работе определены продукты перекисного окисления липидов эритроцитов и плазмы крови коров, больных острым послеродовым и хроническим эндометритом с раздельной регистрацией липидов в гептановой и изопропанольной фазах липидного экстракта [108].
В нашей работе определение уровня первичных, вторичных и конечных продуктов перекисного окисления, проводили экстракционно спектрометрическим методом с раздельной регистрацией липопероксидов в гептановой и изопропанольной фазах липидного экстракта исследуемых проб. Необходимость использования двух фаз вызвана особенностями экстрагирования: так при использовании гептана экстрагируются в основном нейтральные липиды, а изопрапанола – фосфолипиды, которые являются важнейшими субстратами пероксидации липидов.
Для наиболее полной оценки свободнорадикального повреждения липидов крови коров в разные стадии воспалительного процесса нами определены показатели липидпероксидации плазмы крови и эритроцитов. При сравнении продуктов липидпероксидации плазмы крови в группах животных, нами установлено повышение в 1,5 раза содержания первичных продуктов окислительной деструкции нейтральных липидов (диеновых конъюгат) плазмы крови коров больных острым послеродовым эндометритом, что указывает на начальную стадию активации перекисного окисления липидов. Повышение в 3,5 раза конечных продуктов липидпероксидации гептановой фазы (шиффовых оснований) в этой группе обусловлено более интенсивными процессами свободнорадикального окисления липидов по сравнению с контролем. Активация процессов липидпероксидации у коров с хроническим эндометритом проявлялась увеличением в плазме крови в 2,1 раза уровня шиффовых оснований - продуктов окислительной деградации нейтральных липидов. У животных без клинических проявлений эндометрита после лечения наблюдается нормализация процессов перекисного окисления липидов: снижается в 2,1 раза содержание конечных продуктов липидпероксидации нейтральных липидов плазмы крови в сравнении с группой коров больных острым послеродовым эндометритом, но в сравнении с контрольной группой остается повышенным в 1,7 раза. Одновременно снижался уровень гептан-растворимых диеновых и кетодиеновых конъюгат, сопряженных триенов до соответствующих значений контрольной группы.