Введение к работе
Актуальность проблеми: Исследованиями последних десятилетии установлено, что молозиво и молоко яиватішх и человека содержит комплекс специфических (ищункых) и неспэцифичэских аНТИМИКрОбйЬЛ компонентов, которые выполняют защитную функции в сргашзме новорожденного. Неспецифяческие антимикробные фактори молока (НАФМ), - зто ферменти ксанташоксвдаэа, лактонероксидаза, РНК-азы, ДНК-азы, лизоцим; некоторые другие белки и фактори пебалковой прароди; фагоцптцруицио клеткч. Они оказазаит собственный немедленный антимикробный эффект во временном промежутке между поступлением антигена и собственным иммунным ответом ребенка, а такке усиливают действие антител (Relter В., 1978). НА.ЗМ необходимы для защиты новорожденного при попадании в его организм антигена, к которому отсутствуют антитела в молоке матери.
Известно, что в организме существует универсальный механизм антимикробной защиты, связанный с активацией фагоцитов м
генерацией активных форм кислорода {Oj, 'о2, HgO,, ОН"), в котором участвуют НАДФН-оксидазя и миелопероксадаза фагоцитов (Роговин В.В. и др., 1977; Rosen Н.. КІеЬапоїї S.J., 1977; Del Maestro R.F., 1980 и др.). Представляется возможным, что молоко обладает подобным механизмом защиты, т.к. имеет в своем составе аналогичные меточные и ферментные системы перекисного окисления, в частности,
кеангдаоксидазу (КО), генерирующую 0, и лактопероксидазу (ЛП), действувдую аналогично миелопероксидазе.
Изучение этой проблеми представляет значительный интерес в связи с тем, что КО и ЛП оказывают антимикробный эффект на многие виды возбудителей кишечных инфекций. Показано антибактериальное действие ЛП на стрептококки, антеропатогенше серотилы кишечных палочек, сальмонеллы, псевдомонада, клебсиеллы, шигеллы. КО оказывает антимикробный эффект в отошенвн стафилокогашв, Eacherlcla coll, Vibrio cholerae.
Несмотря на то,что структура и функции ферментов КО и ДТІ в определенной степени изучены, возможность функционального объединения антибактериальных ферментов молока - КО и ЛП - в единую систему до сих пор не рассматривалась. Отсутствуют в литературе и данные о взаимодействии этих ферментов с
антиоксидантної* защитой бактерий, вызываниях кишечные инфекции.
Целью настоящей работа явилось экспериментальное обоснована свободно-радикального механизма действия антибактериальной систем ферлевтов молока ~ ксантиноксвдазы и лактопероксидазы.
Для реализации указанной цели были поставлены следувдш задачи:
1. Разработать способы выделения ксантиноксвдазы і
лактопероксидазы и получить очищенные ферменты длі
экспериментальных исследований.
2. Изучить взаимодействие ксантиноксвдазы и лактошроксидазі
с ферментом актиоксвдактной защиты оактерий - супероксиддисмутазо!
(СОД) - в модельной системе.
3. Определить супероксиддисмутэзную активность интактнш
клеток энтеропатогенных штаммов Escherichia coll и Salmonellj
typnlBiurlUffl.
4. Исследовать In vitro антимикробное действш
ксантиноксидазы, лактопероксидазы и их комплекса ні
антеропатогенныв штаммы Escherichia coll и Salmonella typhlnrurlum,
5. Изучить протективное действие комплекса ферментої
ксантиноксидазы и лактопероксидазы на модели сальмонеллезноі
инфекции у экспериментальных животных In vivo.
Положения, выносимые на защиту:
- Разработаны способы наделения ферментов молока
ксантиноксидазы и лактопероксидазы высокой степени чистоты J
активности; разработан метод определения лактопероксвдазво!
активности в растворах, биологических кидкостях и полиакриламидны:
гелях.
- Антимикробная система ферментов КО и ЛП молока образуется і
реализует свое действие при наличии сушроксиддисмутазы
источником которой могут быть патогенные бактерии.
- В опытах Ш vitro ферменты КО и ЛП оказываю'
антибактериальное действие в отношении энтеропатогенных штамш
Escherichia coll и Salmonella typhlmurlum, усиливавдвеся пр:
объединении этих ферментов в систему.
- В опытах In vivo комплекс ферментов КО и ЛП обладав
протактивным действием, о чем свидетельствует снижение степей
тяжести течения экспериментальной сальмонеллезной инфекции
степени инфицированности подопытных животных.
- 4 -Научная ноілізпа: В результате проведенных исследований юлучены ноше факты, имеющие --существенное значение для расчфытйа ібхакшзмов антимикробного действия неспещирпчаскпх компонентов юлока. Разработаны нсьые аффективные и простыв способы получения (чищенных ферментов КО и ЛП. Разработан новый метод определении іактопероксидазной актиі .ости в растворах, биологических жидкостях t полиакриламидшх гелях. Разработана модель свободно-радикального юханизма взаимодействия антимикробных фермзнтоз КО и ЛП молока с 'частивм фермента СОД в единой системе. Механизм действия гвепецифической антимикробной систеші КО и Ш молока подтвержден жепериментально в опытах in vitro на энтероыатогетшх штаммах юзбудйтелей кишечных инфекций и In vivo на модели сальмонеллезной тфекцки.
Теоретическая и практическая значимость работы: теоретически збоснован и экспериментально доказан свободно-радикальний механизм азаимодейстзия ферментов КО и ЛП, осуществляющих антибактериальную функцию в молоке, что дает возможность рассматривать комплекс антимикробных 'факторов молока как единое целое, а механизм генерации активных форм кислорода - как одно из связуюшнк звеньев зтогс комплекса. Результаты работы послужили основанием для планирования новых разработок по обогащению препарата лактеглобулина ферментами неспоцифической защиты молока и по созданию новых биологически активных добавок к детскому гштшшю. Технологии получения очищенных ферментов КО и ЛП войдут ь документацию на обогащенный препарат лактоглосулина.
Апробация работы: материалы диссертации доложены на Всесоюзной конференции "Методы получения, анализа и применения ферментов" (Юрмала, декабрь 1990 г.); международной шиола "Кислородные радикалы в химии, биологии и медицине" (С.-Петербург, сентябрь 1991 г.); 1-ом Российском Национальном контрэссе "Человек и лекарство" (Москва, апрель 1992 г.); 4-й Всесоюзной конференции "Биоантиоксидант" (Москва, шгаъ 1992 г.); Международной конференции "International conference on critical aapecta of ґге« radloala In chemistry, biochemistry and medicine" (Австрия, Вена, февраль 19 г.). Апробация диссертации проведена но заседании ученого совета НПО "Биопрепарат" 15 января 1993 г.
Публикация материалов исследования; по теме диссертации опубликовано 7 научных работ, из них I в международной, 6 в
- Б -
центральной печати.
Структура и объем работы: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов з методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Работа изложена на 136 страницах машинописного текста, иллюстрирована 15 рисунками и 13 таблицами. Список литературы включает 27 отечественных и ІОО зарубежных источников.