Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 9
1. Структура Na,K-ATPазы. Изоформы - и -субъединиц 9
2. Механизм гидролиза АТР и транспорта ионов Na,K-ATPазой 16
3. Катионсвязывающие центры Na,K-ATPазы 18
4. Регуляция активности Na,K-ATPазы 19
5. Олигомеризация Na,K-ATPазы 21
6. Конформационные изменения Na,K-ATPазы 22
7. Na,K-ATPаза – рецептор кардиотонических стероидов 24
8. Связывание Na,K-ATPазы с кардиотоническими стероидами 27
9. Биосинтез кардиотонических стероидов 10. Токсический эффект кардиотонических стероидов 35
Физиологические эффекты кардиотонических стероидов 37
Цель и задачи исследования 41
Материалы и методы 42
1. Материалы 42
2. Методы
2.1. Получение фракции микросом из солевых желез утки 42
2.2. Очистка Na,K-ATPазы из микросом солевых желез уток 43
2.3. Определение концентрации белка 44
2.4. Определение активности Na,K-ATPазы 44
2.4.1. Определение активности Na,K-ATPазы по накоплению Pi 44
2.4.2. Определение активности с использованием системы сопряженных ферментов 45
2.5. Исследование ингибирования Na,K-ATPазы под действием КТС и расчет IC50 46
2.6. Одномерный электрофорез в полиакриламидном геле 47
2.7. Вестерн-блоттинг 47
2.8. Методы регистрации конформационных изменений, индуцированных
связыванием Na,K-ATPазы с кардиотоническими стероидами 48
2.8.1. Включение флуоресцеинизотиоцианата (ФИТЦ) в препараты Na,K ATPазы из солевых желез утки 49
2.8.2. Включение 5-иодацетамидфлуоресцеина (5-ИАФ) в препараты Na,K-ATPазы, полученные из солевых желез утки 50
2.8.3. Измерение флуоресценции ФИТЦ- и 5-ИАФ-меченных препаратов Na,K-ATPазы, полученных из солевых желез утки 50
2.8.4. Регистрация конформационных переходов при связывании различных лигандов методом изотермической калориметрии титрования 51
Устройство прибора VP-ITC Micro Calorimeter. 51
Изотермическая калориметрия титрования 54
2.9. Молекулярное моделирование 55
Результаты и их обсуждение 57
1. Характеристика препаратов Na,K-ATPазы, полученных из солевых желез утки 57
2. Ингибирование Na,K-ATPазы уабаином и маринобуфагенином 61
3. Изучение взаимодействия Na,K-ATPазы с уабаином и маринобуфагенином с помощью измерения флуоресценции ковалентно связанных с ферментом меток 64
4. Изучение взаимодействия Na,K-ATPазы с уабаином и маринобуфагенином методом изотермической калориметрии титрования 69
5. Моделирование участка -субъединицы Na,K-ATPазы, связанного с молекулой маринобуфагенина 75
6. Изучение взаимодействия Na,K-ATPазы с AMP, ADP и АТР методом изотермической калориметрии титрования 78
7. Изучение взаимодействия Na,K-ATPазы с уабаином и маринобуфагенином в присутствии ADP и ATP методом изотермической калориметрии титрования 86
Заключение 89
Выводы 93
Список цитируемой литературы 94
- Катионсвязывающие центры Na,K-ATPазы
- Определение концентрации белка
- Регистрация конформационных переходов при связывании различных лигандов методом изотермической калориметрии титрования
- Изучение взаимодействия Na,K-ATPазы с уабаином и маринобуфагенином с помощью измерения флуоресценции ковалентно связанных с ферментом меток
Катионсвязывающие центры Na,K-ATPазы
Изоферменты Na,K-ATPазы. Как и многие присутствующие в клетке белки, каждая субъединица Na,K-ATPазы представлена в виде нескольких изомерных форм, которые могут сочетаться друг с другом в различных комбинациях. Доказательство существования изоферментов Na,K-ATPазы, состоящих из разных изоформ, было получено, в частности, в экспериментах по ее связыванию с уабаином. Оказалось, что разные по составу изоформ изоферменты Na,K-ATPазы демонстрируют различную чувствительность к этому кардиостероиду (КТС).
В настоящее время известны 4 изоформы -субъединицы (1, 2, 3 и 4) и 3 изоформы -субъединицы (1, 2 и 3) Na,K-ATPазы, которые кодируются различными генами. 1-Изоформа обнаружена во всех клетках и является преобладающей во всех сегментах почек. 2 представлена в нейрональной ткани, желудочках сердца и является основной изоформой -субъединицы Na,K-ATРазы в скелетных мышцах. 3-Изоформа встречается главным образом в мозге. Четвертая изоформа (4) обнаружена лишь в семенниках [1], [24], [25], [26]. Для изоформ -субъединицы также характерна тканеспецифичность. 1-Изоформа Na,K-ATРазы встречается во всех типах клеток животных. 2-Изоформа характерна, главным образом, для нервной ткани, но встречается также в скелетных мышцах. 3-Изоформа обнаруживается в тканях семенников, печени и легких [1].
Субъединицы семейства FXYD. В составе очищенных препаратов Na,K-ATPазы почек помимо - и -субъединиц присутствует белковый компонент, ассоциированный с ферментом, который был назван -субъединицей. Forbush впервые продемонстрировал, что данный гидрофобный пептид имеет отношение к Na,K-ATPазе [27]. Эта субъединица является трансмембранным белком семейства FXYD и, взаимодействуя с Na,K-ATPазой, выполняет регуляторные функции [28], [29]. FXYD-семейство – это семь низкомолекулярных белков (FXYD1-7), которые, помимо взаимодействия с Na,K-ATPазой, формируют каналы и взаимодействуют с другими белками, например, с Na/Ca-обменником. Они состоят из 60-160 аминокислотных остатков и кодируются генами с 6-9 экзонами, их экспрессия тканеспецифична [30]. Эти белки имеют два консервативных остатка глицина и один остаток серина в трансмембранном домене [31]. -Субъединица почки овцы представляет собой небольшой полипептид, состоящий из 58 аминокислот с молекулярной массой около 7,2 кДа и электрофоретической подвижностью, соответствующей белку с молекулярной массой 10 кДа. Такое значение электрофоретической подвижности обусловлено наличием в структуре – субъединицы большого количества положительно заряженных аминокислотных остатков. Эта субъединица пронизывает мембрану один раз, причем С-конец полипептидной цепи располагается внутри клетки, а N-конец – снаружи. Трансмембранный домен содержит 19 аминокислотных остатков (21-39) [32]. Считается, что присоединение -субъединицы к комплексу - влияет на сродство Na,K-ATPазы к переносимым катионам и АТР [28], [33]. Кроме того, существует предположение, что -субъединица может стабилизировать Na,K-ATPазу [23]. В препаратах Na,K-ATPазы из других тканей вместо –субъединицы могут находиться другие белки семейства FXYD. Например, в сердце с Na,K-ATPазой взаимодействует белок этого семейства, фосфолемман. Фосфолемман обеспечивает связывание комплекса -субъединиц с микротрубочками. Показано, что некоторые члены семейства FXYD способны фосфорилироваться [23], [34], [35]. Например, фосфорилирование фосфолеммана протеинкиназами А и С влияет на его взаимодействие с микротрубочками [36].
В начале 60-х годов прошлого века Albers и Post предложили модель, описывающую механизм функционирования фермента (рис. 6) [37], [38]. В этой схеме каталитический цикл фермента представлен последовательным чередованием двух основных конформационных состояний, Е1 и Е2, которые различаются по сродству к переносимым катионам. Помимо этого, каждое конформационное состояние может быть в фосфорилированной и дефосфорилированной по активному центру форме. Наличие переходов Е1-Е2 впервые показал Jorgensen, который использовал для этой цели метод ограниченного протеолиза Na,K-ATPазы под действием трипсина [19]. Он обнаружил, что в присутствии ионов Na+ -cубъединица фермента расщепляется трипсином на 2 фрагмента с молекулярными массами 48 и 64 кДа, а в присутствии ионов К+ - на три фрагмента: 30 кДа, 76 кДа и низкомолекулярный N-концевой пептид. Эти данные подтвердили идею о том, что связывание разных катионов индуцирует различные конформационные состояния Na,K-ATPазы [19].
Каталитический цикл Na,K-ATPазы начинается со связывания с ферментом трех ионов Na+ с цитоплазматической стороны мембраны. Это конформационное состояние фермента носит название E1, оно характеризуется высоким сродством к АТР и ионам Na+. После связывания этих ионов происходит перенос терминального фосфорильного остатка АТР на остаток аспарагиновой кислоты активного центра -субъединицы фермента (Asp369) с образованием ацилфосфатной ковалентной связи. В результате фосфорилирования молекулы образуется интермедиат Е1-Р, а ADP высвобождается из активного центра и возвращается в цитоплазму. Фосфорилированный фермент переходит в такое состояние, когда ионы Na+ не способны высвобождаться ни в цитоплазму, ни во внеклеточное пространство, т.е. они окклюдированы в мембране [22].
Затем Na,K-ATPаза спонтанно переходит в новое конформационное состояние Е2, которое характеризуется низким сродством к ионам Na+ и высоким – к ионам К+. Этот переход существенно активируется ионами Mg2+, хотя специфических центров связывания Mg2+ на молекуле Na,K-ATPазы не обнаружено. Предполагается, что за связывание Mg2+ отвечают аминокислотные остатки Asp443 и Asp710 [39]. В результате происходит освобождение трех ионов Na+ c внеклеточной стороны и связывание двух ионов внеклеточного K+. Связывание К+ активирует гидролиз ацилфосфатной связи, вследствие чего освобождается неорганический фосфат. Затем, в свою очередь, происходит окклюзия ионов К+ и их последующее освобождение в цитоплазму. После того как произошла диссоциация ионов К+ от центра связывания, конформер Е2 медленно превращается в конформер Е1. Этот процесс значительно ускоряет АТР, который, связываясь в центре низкого сродства, повышает сродство фермента к Na+ и снижает его сродство к К+ [22], [40]. Благодаря этим последовательно происходящим процессам осуществляется активный транспорт ионов Na+ из клетки и ионов К+ в клетку.
Исходной конформацией фермента можно считать Е1, поскольку обычно около 70% молекул фермента находится в этой конформации в среде, где отсутствуют ионы Na+ и К+ [41]. Кроме того, конформации Е1 и Е2 различаются и по чувствительности к специфическому ингибитору уабаину. Дело в том, что центр связывания молекулы кардиотонического стероида образуется на конформере Е2, при этом с конформацией Е1 он связывается очень плохо. По этой причине уабаин и другие КТС гораздо эффективнее связываются с нефункционирующими молекулами фермента в конформации Е2, связывание с функционирующими молекулами Na,K-ATPазы происходит менее эффективно [42].
Определение концентрации белка
Несмотря на то, что строение и механизм действия КТС в настоящий момент довольно подробно изучены, до конца остается неясным, как осуществляется биосинтез этих соединений. Как уже говорилось ранее, различные КТС обнаружены во многих тканях млекопитающих (плазма крови, гипоталамус, сердце, надпочечники). Целый ряд данных свидетельствует о том, что биосинтез кардиостероидов происходит в коре надпочечников [119], [120], [121], [122]. Согласно классической схеме синтеза стероидов, для образования молекулы эндогенного уабаина, который относится к семейству карденелидов, требуется отщепление боковой цепи холестерина (превращение холестерина в прегненолон) [120]. Ингибирование следующего этапа стероидогенеза (превращения прегненолона в прогестерон) снижает синтез эндогенного уабаина клетками коры надпочечников [119]. Таким образом, прегненолон и прогестерон являются предшественниками эндогенного уабаина.
Синтез буфадиенолидов также осуществляется в клетках коры надпочечников. Однако прогестерон не является предшественником маринобуфагенина. При этом мевастатин, являющийся ингибитором 3-гидрокси-3-метилглутарил-CoA редуктазы, снижает уровень синтеза маринобуфагенина, что свидетельствует о том, что для биосинтеза буфадиенолидов необходим холестерин [123].
В настоящее время точные причины, объясняющие цитотоксический эффект кардиотонических стероидов, неизвестны. Существуют лишь некоторые предположения о возможных механизмах, лежащих в основе данного явления. Установлено, что деполяризация плазматической мембраны, возникающая в результате ингибирования Na,K-ATPазы уабаином и родственными ему соединениями, не является причиной цитотоксичности [79]. Напротив, способность мембраны деполяризоваться рассматривается в данном контексте как защитный механизм, позволяющий избежать смерти клеток. Известно, что обработка чувствительных к уабаину (MDCK) этим КТС приводит к увеличению уровня фосфорилирования тирозиновых остатков, при этом данный эффект не наблюдается в культуре клеток Ma104, нечувствительных к уабаину. Кроме того, уабаин приводит к увеличению уровня экспрессии мономерного G-белка Ras. Считается, что оба этих явления имеют отношение к токсическому эффекту уабаина. Известно также, что в присутствии уабаина происходит генерация активных форм кислорода, которые принимают участие в активации Ras-сигнального пути, приводящего к клеточной смерти. Также было показано, что восстановленный глутатион GSH способствует деполяризации плазматической мембраны и ингибирует фосфорилирование тирозиновых остатков, тем самым способствуя предотвращению клеточной смерти (рис. 9).
Схема, описывающая возможный механизм токсичности уабаина и регуляторную роль восстановленного глутатиона GSH. ДПМ – деполяризация плазматической мембраны; АФК – активные формы кислорода. 11. Физиологические эффекты кардиотонических стероидов
Среди физиологических эффектов, обеспечиваемых связыванием уабаина и маринобуфагенина с Na,K-ATPазой, можно выделить минимум шесть, для которых характерны несколько различные механизмы. Во-первых, при взаимодействии Na,K-ATPазы с уабаином, маринобуфагенином и их аналогами в концентрациях, ингибирующих активность 2-изоформы в сердце, наблюдается положительный инотропный эффект, в результате которого происходит увеличение силы сокращения сердечной мышцы. Это усиление сокращения возникает вследствие возрастания концентрации ионов Na+ внутри клетки, что влечет за собой повышение уровння внутриклеточных ионов Ca2+ за счет активации Na,Ca-обменника, что, в свою очередь, усиливает сократительный ответ [101], [124], [125], [126], [127], [128], [129].
Во-вторых, связывание Na,K-насоса с уабаином и маринобуфагенином приводит к гипертрофии сердечной мышцы. Дело в том, что взаимодействие фермента с КТС активирует Src-киназу, которая принадлежит к семейству Src-киназ, не связанных с клеточным рецептором тирозинкиназ с молекулярной массой 52-62 кДа, и участвует в процессах эмбрионального развития и клеточного роста [130], [131]. Ранее было показано, что Src-киназа и 1-субъединица Na,K-ATPазы могут осаждаться в комплексе при иммунопреципитации, причем уабаин способен регулировать взаимодействие между этими белками в клетке [132], [45], [133], [134], [135]. Изменение характера взаимодействия Src-киназы с Na,K-ATPазой после связывания с последней уабаина активирует фосфорилирование Src-киназой рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), причем по центрам, отличным от центров автофосфорилирования. После этого запускаются сигнальные каскады с участием белков Ras/Raf/ERK1/2, а также начинается продукция митохондриями активных форм кислорода [45], [134]. Последнее происходит за счет активации фосфолипазы С под действием ионов Ca2+, который попадает в саркоплазму сердечной мышцы за счет активации Na,Ca-обменника [101]. Таким образом, развитие гипертрофии под действием уабаина связано, с одной стороны, с влиянием уабаина на конформацию Na,K-ATPазы и активацией за счет белок-белковых взаимодействий пути, приводящего к экспрессии определенных генов (каскад уабаин - Ыа,К-AТРаза - Src-киназа - фосфорилирование EGFR - Ras/Raf/ERK1/2). С другой стороны, этот эффект усиливается за счет влияния уабаина на ионные потоки, т.е. за счет снижения скорости транспорта ионов Na+ и последующей активации входа Ca2+ в клетку. По всей видимости, маринобуфагенин при связывании с Na,K-ATPазой запускает аналогичный сигнальный каскад.
Третий физиологический эффект уабаина наблюдается на культуре гладких мышц сосудов (аорты). Оказалось, что уабаин, ингибируя Na,K-ATPазу клеток сосудов, может предотвращать развитие апоптоза, вызванного отсутствием факторов роста [136], [137]. Детальное исследование этого эффекта показало, что он обусловлен исключительно изменением внутриклеточной концентрации ионов Na+ и связан с экспрессией ряда генов, например, гена, кодирующего белок морталин. В настоящее время работы по исследованию механизма осуществления этого физиологического эффекта уабаина связаны с поиском Na-сенсора.
Еще один физиологический эффект наблюдали на культуре клеток почечного эпителия собаки C7-MDCK. Было показано, что при добавлении к клеткам уабаина наступает смерть последних, причем путь передачи этого сигнала не зависит от внутриклеточного соотношения Na+/K+ и Са2+. Предполагается, что генерация сигнала, приводящего к клеточной смерти, основывается исключительно на конформационных перестройках -субъединицы фермента, что приводит к связыванию с последней других сигнальных белков, которые в конечном итоге активируют ERK-киназу [138], [139], [140], [141].
Регистрация конформационных переходов при связывании различных лигандов методом изотермической калориметрии титрования
Для определения различий в связывании уабаина и маринобуфагенина с Na,K-АТФазой мы использовали метод ITC, который позволяет определять термодинамические параметры взаимодействия молекул напрямую без использования меток и модификации белка. Используя ITC мы оценили константы связывания Ka, изменение энтальпии Н, изменение энтропии S при связывании уабаина и маринобуфагенина с Na,K-ATPазой, находящейся в трех различных состояниях: Е2Р (10 мМ имидазол, 1 мМ ЭДТА, 0,1 мМ ДТТ, 3 мМ MgCl2, 3 мМ трис/Pi, рН 7,5), Е1/Е2 (10 мМ имидазол, 1 мМ ЭДТА, 0,1 мМ ДТТ, 130 мМ NaCl, 20 мМ KCl, pH 7,5) и Е1 (10 мМ имидазол, 1 мМ ЭДТА, 0,1 мМ ДТТ, 3 мМ NaCl, pH 7,5).
Как уже говорилось ранее, Е2Р-конформация Na,K-ATPазы обладает высоким сродством к уабаину, в связи с этим сначала изучение связывания проводили в среде, содержащей Mg2+ и Pi. Типичная экспериментальная ITC-кривая для связывания уабаина приведена на рисунке 20.
Реакция связывания Na,K-ATPазы из солевых желез утки с уабаином при температуре 25С характеризуется следующими термодинамическими параметрами: изменение энтальпии H = -11,5 ккал/моль, изменение энтропии TS = -2 ккал/моль, константа диссоциации Kd = 0,1 мкМ. Основной вклад в изменение энергии Гиббса G вносит энтальпийный фактор, т.е. изменение энтальпии H. Отрицательная величина изменения энтальпии свидетельствует об образовании большого количества водородных связей или Ван-дер Ваальсовских взаимодействий между ферментом и уабаином. Таким образом, связывание уабаина с Na,K-ATPазой – это энтальпийно выгодный процесс. Время, мин 10
Анализ взаимодействия Е2Р-конформации Na,K-ATPазы с уабаином методом изотермической калориметрии титрования (ITC). Верхняя панель – ITC-кривая титрования Na,K-ATPазы из солевых желез утки уабаином при рН 7,5 и температуре 25С; нижняя панель – изотерма связывания, полученная интегрированием ITC-кривой, и оптимизированная аппроксимация изотермы связывания с помощью модели одного типа участков связывания (сплошная линия). Аналогичным образом мы исследовали особенности взаимодействия Na,K ATPазы с другим КТС – маринобуфагенином. Кривая связывания фермента с этим соединением также аппроксимировалась наилучшим образом с использованием модели одного участка связывания (рис. 21). Термодинамические характеристики этой реакции следующие: изменение энтальпии H = -1,3 ккал/моль, изменение энтропии TS = 6,6 ккал/моль, константа диссоциации Kd = 1,7 мкМ. Реакция связывания маринобуфагенина характеризуется значительным положительным изменением энтропии, т.е. в этом процессе доминируют перегруппировка молекул растворителя и гидрофобные взаимодействия. Положительная величина изменения энтропии говорит о том, что в результате взаимодействия фермента с маринобуфагенином происходит снижение количества гидрофобных групп, экспонированных в раствор. Таким образом, связывание маринобуфагенина с Na,K-ATPазой – это энтропийно выгодный процесс.
Анализ взаимодействия Е2Р-конформации Na,K-ATPазы с маринобуфагенином методом изотермической калориметрии титрования (ITC). Верхняя панель – ITC-кривая титрования Na,K-ATPазы из солевых желез утки маринобуфагенином при рН 7,5 и температуре 25С; нижняя панель – изотерма связывания, полученная интегрированием ITC-кривой, и оптимизированная аппроксимация изотермы связывания с помощью модели одного типа участков связывания (сплошная линия). Кроме того, были проведены эксперименты с использованием модели конкурентного связывания, в которых маринобуфагенин вытеснялся из комплекса с Na,K-ATPазой уабаином, и рассчитаны термодинамические параметры данной реакции. Типичная ITC-кривая связывания представлена на рисунке 22. Мы получили значение константы диссоциации Kd (0,08 мкМ), близкое тому значению, которое было получено в экспериментах с использованием модели одного типа участков связывания. Мы провели также эксперименты по вытеснению уабаина из комплекса с Na,K-ATPазой маринобуфагенином. Однако заменить молекулу уабаина в комплексе с ферментом, находящимся в Е2Р-состоянии, маринобуфагенином не удалось, поскольку связывание маринобуфагенина характеризуется на порядок меньшей константой диссоциации по сравнению с маринобуфагенином. Исходя из полученных данных, мы можем предположить, что связывание уабаина и маринобуфагенина с Na,K-ATPазой происходит в одном и том же участке белка.
В конформации Е2Р различия в константах диссоциации уабаина и маринобуфагенина при связывании с Na,K-ATPазой различаются в 17 раз (значения Kd составили 0,1 и 1,7 мкМ соответственно), при этом в отличие от энтальпийно-выгодной реакции связывания уабаина связывание маринобуфагенина – энтропийно-выгодный процесс. Определенное нами значение константы диссоциации для уабаина близко к значениям констант, описанным ранее [160].
Связывание уабаина с Na,K-ATPазой в Е1/Е2-состоянии характеризовалось уменьшением сродства почти на порядок (значение Kd составило 0,77 мкМ) и изменением термодинамического профиля: из энтальпийно выгодного (в Е2Р-состоянии) этот процесс стал энтропийно выгодным. Связывание уабаина с E1-конформацией Na,K-ATPазы зарегистрировать не удалось. Это означает, что связывание либо отсутствует, либо константа диссоциации Kd 10 мкМ. В то же время сродство маринобуфагенина к трем вышеописанным конформациям фермента практически не меняется, однако термодинамические профили этих трех реакций различны. При переходе от Е2- к Е1-состоянию происходит уменьшение энтропийной составляющей и увеличение энтальпийного вклада. Время, мин 10
Анализ взаимодействия комплекса Е2Р-конформация Na,K-ATPазы-маринобуфагенин с уабаином методом изотермической калориметрии титрования (ITC). Верхняя панель – ITC-кривая титрования комплекса Na,K-ATPаза-маринобуфагенин уабаином при рН 7,5 и температуре 25С; нижняя панель – изотерма связывания, полученная интегрированием ITC-кривой, и оптимизированная аппроксимация изотермы связывания с помощью модели конкурентного связывания (сплошная линия). Как уже упоминалось ранее, принято считать, что наибольшим сродством к уабаину обладает Е2Р-конформация Na,K-ATPазы [108]. Действительно, согласно нашим данным самое большое сродство демонстрирует уабаин при связывании с E2P-коформацией фермента. Однако сродство уабаина к Na,K ATPазе резко снижается при переходе к Е1-состоянию, в то время как сродство маринобуфагенина к ферменту почти не зависит от его конформации. При этом мы обнаружили, что значения концентраций полумаксимального ингибирования ферментативной активности Na,K-ATPазы уабаином и маринобуфагенином близки. Таким образом, когда фермент осциллирует между Е1- и Е2 состояниями (при измерении ферментативной активности в том числе), его сродство к различным КТС практически одинаково. Эти данные также объясняют явление расхождения между связывающей и ингибирующей способностями для большой группы кардиотонических стероидов, проанализированных в ранее опубликованной работе [115].
Изучение взаимодействия Na,K-ATPазы с уабаином и маринобуфагенином с помощью измерения флуоресценции ковалентно связанных с ферментом меток
Настоящая работа была посвящена изучению взаимодействия Na,K-ATPазы из солевых желез утки с двумя кардиотоническими стероидами – уабаином и маринобуфагенином, которые принадлежат к двум разным классам этой группы соединений. На сегодняшний день достоверно известно, что Na,K-ATPаза – это не только насос, обеспечивающий градиент ионов Na+ и K+ через плазматическую мембрану, но и рецептор, при связывании которого с КТС в некоторых типах клеток индуцируются различные сигнальные каскады [185]. Известно, что единственным рецептором для КТС является Na,K-ATPаза. До некоторых пор считалось, что эти соединения имеют экзогенную природу (т.е. синтезируются в растениях и в железах, производящих слизь у земноводных), однако на данный момент известно, что существует достаточно обширная группа эндогенных кардиотонических стероидов, которые синтезируются и в организме млекопитающих, включая человека [186]. Эндогенный уабаин был первым представителем этой группы, который удалось выделить из плазмы крови человека [187]. Позже в плазме млекопитающих были обнаружены компоненты, которые ингибировали ферментативную активность Na,K-ATPазы и взаимодействовали с антителами против некоторых гликозидов [188]. Сейчас известно, что один из таких компонентов имел буфадиенолидную структуру [189], [190]. Оказалось, что в плазме крови и моче человека содержится маринобуфагенин [191], [192].
Мы показали, что уабаин и маринобуфагенин обладают схожими ингибирующими свойствами в отношении Na,K-ATPазы: кривая ингибирования носит гиперболический характер; значения концентрации КТС, при которых наблюдается полумаксимальное ингибирование ферментативной активности Na,K-ATPазы, равны 1,3 мкМ для уабаина и 0,6 мкМ для маринобуфагенина. Полное ингибирование наступает при почти равных концентрациях обоих стероидов (5-6 мкМ).
В экспериментах с использованием ковалентно связанных с ферментом флуоресцентных меток (ФИТЦ и 5-ИАФ) нам удалось зарегистрировать различия в ответах, возникающих при связывании уабаина и маринобуфагенина с Na,K ATPазой. В обоих случаях маринобуфагенин обеспечивал больший флуоресцентный ответ. Возможно, это связано с тем, что маринобуфагенин вызывает более значительные или иные структурные изменения молекулы фермента по сравнению с уабаином.
Поскольку использование флуоресцентных меток не позволяет нам с большой достоверностью определить параметры, характеризующие реакции связывания Na,K-ATPазы с уабаином и маринобуфагенином, то на последующих этапах работы мы изучали взаимодействие фермента с лигандами с помощью метода изотермической калориметрии титрования. Мы показали, что связывание уабаина и маринобуфагенина происходит в одном и том же участке белка. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что сродство Na,K-ATPазы к маринобуфагенину в отличие от уабаина почти не зависит от того, в какой конформации пребывает фермент. Сродство же Na,K-ATPазы к уабаину больше у Е2Р-формы (в 17 раз), как и было установлено ранее другими авторами. Интересен тот факт, что, пребывая в осциллирующем между Е1- и Е2-формами состоянии, Na,K-ATPаза обладает практически одинаковым сродством как к уабаину, так и к маринобуфагенину. Связывание уабаина с Е1-формой Na,K-ATPазы зарегистрировать не удалось (либо это связывание отсутствует, либо характеризуется константой диссоциации Kd 10 мкМ), сродство же маринобуфагенина к трем различным конформациям фермента (Е2Р, Е1/Е2, Е1) почти одинаково. Термодинамический профиль реакций связывания Na,K-ATPазы с вышеупомянутыми лигандами меняется следующим образом: при переходе от Е2- к Е1-формам вклад энтропийной составляющей уменьшается, в то время как значение энтальпийной компоненты возрастает.
Данные рентгеноструктурного анализа свидетельствуют, что молекула уабаина формирует пять водородных связей с аминокислотными остатками Gln111, Glu117, Asn122, Glu312, Thr797 и шесть гидрофобных контактов с остатками Leu125, Ile315, Phe316, Phe783, Phe786, Leu793, расположенными в трансмембранных участках -субъединицы Na,K-ATPазы (М1, М2, М5 и М6) [161]. Полученные нами методом молекулярного моделирования данные демонстрируют, что в комплексе с маринобуфагенином образуется одна водородная связь с остатком Glu312 и пять гидрофобных связей с остатками Ile315, Phe316, Phe783, Phe786, Leu793. Таким образом, мы видим, что в обоих случаях связывание фермента с молекулами лигандов происходит с теми же гидрофобными остатками фермента, но в случае маринобуфагенина происходит уменьшение количества водородных связей, образованных им с Na,K-ATPазой, при этом данное связывание осуществляется с помощью разных атомов самих кардиотонических стероидов. Кроме того, при связывании маринобуфагенина происходит уменьшение количества водородных связей. Моделирование связывания уабаина и маринобуфагенина с Na,K-ATPазой показывает, что стероидное ядро маринобуфагенина располагается на 5 ближе к выходу из полости участка связывания по сравнению с уабаином.
Таким образом, в настоящей работе мы впервые наиболее полно охарактеризовали реакции связывания уабаина и маринобуфагенина с Na,K ATPазой на разных стадиях каталитического цикла. Помимо того, данные по связыванию фермента с маринобуфагенином являются единственными, поскольку в имеющейся на данный момент литературе по этому вопросу, несмотря на его важную значимость, нет никакой информации. Полученные нами экспериментальные данные позволяют осознать важность существования множества различных кардиотонических стероидов и их взаимодействия с Na,K-ATPазой. Как нам удалось установить на примере двух соединений, связывание каждого из них характеризуется различными параметрами, хотя и происходит в одном и том же центре. По всей видимости, этим можно объяснить существование такого большого количества представителей этой группы соединений, в том числе и в нашем организме. Возможно, связываясь с Na,K-ATPазой, тот или иной КТС как бы фиксирует работающий фермент в определенной конформации. Это позволяет ему связываться с белками-партнерами и, таким образом, с одной стороны, инициировать различные сигнальные каскады, с другой, позволяет обеспечить взаимодействие с другими компонентами клетки, например, с цитоскелетом. Существенное многообразие кардиотонических стероидов также можно объяснить существованием изоформ Na,K-ATPазы, которые, как известно, различаются в том числе и сродством к этим ингибиторам, обладающим гормоноподобными функциями.
Как уже говорилось ранее, переход Na,K-ATPазы в Е1-состояние можно индуцировать не только ионами Na+, но также с помощью АТР и его аналогов. В данной работе нам удалось установить, что при образовании адениновых комплексов с ферментом (на примере AMP, ADP и АТР) важное значение имеет -фосфат молекулы. Появление у аденинового нуклеотида -фосфата обеспечивает структурные изменения молекулы фермента, подготавливающие его к фосфорилированию. Также мы показали, что присутствие ADP или АТР не оказывает влияния на связывание уабаина и маринобуфагенина с Е1-конформацией Na,K-ATPазы.
Взаимодействие Na,K-ATPазы с кардиотоническими стероидами – очень важная и актуальная проблема. Помимо фундаментальных аспектов, ее решение имеет ряд значимых практических перспектив. Лечение сердечной недостаточности карденелидами на данный момент является хорошо изученным вопросом. Однако существует еще несколько направлений применения КТС, актуальных в настоящее время. Известно, например, что использование сердечных гликозидов увеличивает эффективность противоопухолевой терапии [193], [194], также они обеспечивают снижение роста ряда злокачественных образований и их регрессию [195]. Кроме того, было обнаружено, что дигоксин подавляет репликацию ВИЧ-1, что позволяет рассматривать КТС в качестве потенциальных элементов антиретровирусной терапии [196], [197], [198].