Содержание к диссертации
Стр.
ВВЕДЕНИЕ 6
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
ГЛАВА I. СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ АТФазного КОМПЛЖСА И .
ОТДЕЛЬНЫХ ЕГО КОМПОНЕНТОВ 9
Субъединичный состав АТФсинтетазы 9
Аминокислотный состав субъединиц АТФсинтетазы . . 13
Пространственная структура АТФазного комплекса . 23
Функции субъединиц АТФсинтетазного комплекса . . 27
Связывание нуклеотидов с АТФазой 31
ГЛАВА П. СТРУКТУРНЫЕ ПЕРЕСТРОЙКИ МОЛЕКУЛЫ АТФазы 34
Конформационные изменения фактора Fj 34
Изменения структуры мембрансвязанной АТФазы ... 42 ГЛАВА Ш. МЕХАНИЗМ АТФсинтетазной РЕАКЦИИ 47
Транслокация протонов . . 47
Катализ АТФсинтетазной (АТФазной) реакции .... 48
Сопряжение трансмембранного переноса протонов с катализом АТФсинтетазной (АТФазной) реакции ... 55
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ I. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Препаративные методы
Выделение митохондрий из сердца быка ...... 60
Выделение субмитохондриальных частиц 61
Получение S-субмитохондриальных частиц .... 62
Выделение сопрягающего фактора Fj 63
Выделение природного белкового ингибитора АТФазы 67
6. Обработка фактора Fj бифункциональными
сшиващими реагентами 69
Аналитические методы
1. Электрофорез в полиакриламидном геле в
отсутствии денатурирующих агентов 70
Седиментационннй анализ 72
Определение АТФазной активности 75
Изучение АТФазной реакции под давлением .... 79
Измерение скорости обратного переноса электронов по дыхательной цепи на НАД4" 80
6. Ферментативные препараты и реактивы 81
П. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
ГЛАВА I. ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРНЫХ ПЕРЕСТРОЖ В РАСТВОРИМОЙ
МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ Н+-АТФазе . 82
1. Инактивация фактора Pj в присутствии
субстрата АТФазной реакции 83
2. Влияние гидростатического давления на
скорость АТФазной реакции 94
ГЛАВА П. КИНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ГИДРОЛИЗА АТФ
РАСТВОРИМОЙ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ Н+-АТФазой .... 109
2+
Взаимодействие фактора Fj с АДФ и ионами Ма . 109
Зависимость скорости АТФазной реакции
от температуры 115
ГЛАВА Ш. СЕДЙМЕНТАЦИОННЫЕ СВОЙСТВА РАСТВОРИМОЙ .
МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ Н+-АТФазы . 121
1. Метод седиментации активного фермента
для фактора Fj 122
2. Определение коэффициента седиментации раство-
римой митохондриальной Н+-АТФазы 128
ГЛАВА ІУ. ИЗУЧЕНИЕ ГИДРОЖЗА АТФ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ
Н^АТФавой ПРИ ЭНЕРГИЗАЩИ МЕМБРАНЫ
СУБМИТОХОНДРИАЛЬНЫХ ЧАСТИЦ 135
Способ регистрации в препаратах субмито-хондриальных частиц фракции с высоким потенциалом д і|н* на мембране . 136
Исследование кинетических характеристик гидролиза АТФ при энергизациж мембраны субмитохондриальных частиц 144
ВЫВОДЫ 159
ЛИТЕРАТУРА .......... 161
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО
ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 190
СОКРАЩЕНИЯ
д/'н+- разность электрохимических потенциалов ионов водорода;
АТФаза - аденозин-б'-трифосфатаза (ЕС 3.6.1.3);
Pj-АТФаза - растворимая митохондриальная аденозин-б'-трифосфатаза;
СМЧ - субмитохондриальные частицы;
АТФ - аденозин-5 -трифосфат;
АДФ - аденозин-5 -дифосфат;
АМФРНР - аденилил-5 -имидодифосфат;
АТФ-Ж - смешанный ангидрид АТФ и мезителенкарбоновой кислоты;
І -АТФ - 1,К6-этено-АТФ; ГТФ - гуанозин-51-трифосфат; ИТФ - инозин-5 -трифосфат;
НАД4" - никотинамидадениндинуклеотид окисленный; НАД'Н - никотинамидадениндинуклеотид восстановленный; Трис - триоксиметиламинометан;
НЕРЕ5 - 2-(П'-2-оксиэтил1шперазин-Ж-ил)-этансульфоновая кислота; ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота; СІ-ССР - карбонилцианидтрихлорметоксифенилгидразон; Фн - неорганический фосфат; ФЕП - фосфоенолпируват.
Введение к работе
В соответствии с хемиосмотической теорией Р.Митчела, получившей в последние годы убедительное экспериментальное обоснование, при работе дыхательной цепи на митохондриальной мембране образуется разность электрохимических потенциалов ионов водорода aJWh+ (Mitchell, 1966). Энергия ДЙн+ затем может быть использована для транспорта метаболитов через мембрану, совершения механической работы, синтеза АТФ и так далее (Скулачев, 1972). В митохондриях, хлоропластах и бактериях преобразование энергии AJWh* «.** АТФ катализируется специальным ферментом -Н+-АТФазой (АТФсинтетазой) (Mitchell, 1966, 1974, Скулачев, 1972, Skulachev, 1981, Kozlov, Skulachev, 1977, 1982).
АТФазный комплекс представляет собой сложную систему с высоким молекулярным весом, состоящую из нескольких типов субъединиц. Эту систему можно разделить на три функционально различных компонента: фактор FQ, фактор Fj и эндогенный белковый ингибитор АТФазы - I. Фактор F - гидрофобный компонент комплекса, связанный с энергопреобразущеи мембраной и осуществляющий перенос протонов между Бнемитохондриальным пространством и фактором Fj. Фактор Fj представляет собой водорастворимый каталитический компонент АТФазы, непосредственно осуществляющий- синтез (гидролиз) АТФ. Ингибитор I является регуляторним белком, предотвращающим гидролиз новосинтезированного АТФ в условиях, когда на мембране по каким-либо причинам снизился потенциал ДсДн+. Несмотря на большие успехи, достигнутые в исследовании структуры и функций отдельных компонентов АТФазного комплекса, молекулярный механизм функционирования этой системы остается
до сих пор не выясненным.
Цель настоящей работы заключалась в изучении роли сложной четвертичной структуры растворимой митохондриальной Н+-АТФазы (фактора Pj) в процессе функционирования фермента, а также в исследовании с помощью специальных ингибиторов АТФазнои реакции в условиях энергизации митохондриальной мембраны.
В работе подробно изучен процесс инактивации Fj-АТФазы, индуцированной субстратом АТФазнои реакции. Показано, что этот процесс обусловлен значительными конформационными перестройками, затрагивающими четвертичную структуру молекулы белка (Результаты и обсуждение, гл. I).
Впервые в работе изучалось действие гидростатического давления на гидролиз АТФ. Полученные данные позволяют заключить, что умеренное гидростатическое давление (до 150 атм) вызывает ускорение инактивации фермента в присутствии субстрата АТФазнои реакции. Этот процесс сопровождается значительным уменьшением удельного парциального объема белка и, вероятно, изменением площади гидрофобной поверхности молекулы фермента (гл. I). Разработанный способ изучения функционирования Pj-АТФазы под действием гидростатического давления может быть использован для изучения механизма действия других сложных ферментов.
В работе проведено изучение влияния эффекторов (АДФ и ионов Мо +) и некоторых воздействий (понижение температуры реакционной среды до 0С) на АТФазную активность фермента. Показано, что АДФ и ионы Мсг+ вызывают, по-видимому, значительные перестройки молекулы Fj-АТФазы, включающие изменения четвертичной структуры белка (гл. П). Полученные данные свидетельствуют о том, что при понижении температуры реакционной среды происходит смена лимити-
рующей стадии АТФазной реакции (при 18-20С) (гл. П).
Методом седиментации активного фермента определены коэффициенты седиментации нативной Fj-АТФазы и фактора Fj, обработанного диметилсуберимидатом, при гидролизе АТФ (гл. Ш).
В работе разработан новый метод регистрации АТФазной активности мембрансвязанного фермента при энергизации мембраны. Метод основан на применении специальных ингибиторов АТФазы, блокирующих ее активность в условиях деэнергизации и практически не влияющих на нее при наличии потенциала &jjH> на митохондриа-льной мембране (гл. ІУ). С помощью этого метода исследованы кинетические характеристики гидролиза АТФ в условиях генерации д йн* на мембране субмитохондриальных частиц и показано, что связывание субстрата в активном центре фермента является uj\n+ -зависимой стадией АТФазной реакции, (гл. ІУ).
Предложенный способ определения АТФазной активности при генерации aJMh+ на мембране субмитохондриальных частиц позволяет изучать процесс функционирования фермента в условиях, близких к нативным, а также АТФ-зависимые процессы, протекающие лишь в энергизованной мембране.