Введение к работе
Актуальность проблеми. Внутриклеточная деградация белков является строго контролируемым процессом. В цитозоле, ядре и митохондриях эукариотических клеток и в цитоплазме бактериальных клеток этот процесс осуществляется, главным образом, мультимерными АТР-зависимыми протеиназами. Протеолитическая активность этих ферментов сопряжена с гидролизом АТР. Это свойство АТР-зависимых протеиназ выделяет их в особую группу среди протеолитических ферментов. В клетках Escherichia coli к настоящему времени обнаружены четыре АТР-зависимые протеиназы: Lon, CIpAP, HslVU и FtsH. Первые два фермента - сериновые протеиназы; каталитически активным остатком HslVU-протеиназы является треонин, a FtsH-протеиназа охарактеризована как Zn-зависимая металлопротеиназа. CIpAP и HslVU представляют собой гетероолигомеры и состоят из протеолитических (ClpP и HslV) и регуляторных АТР-азных (ClpA и HsIU) субьединиц. В Lon- и FtsH-протеиназах протеолитический и АТР-азный центры локализованы в одной полипептидной цепи, и эти ферменты функционируют как гомоолигомеры.
Первой описанной энергозависимой протеиназой явилась Lon-протеиназа из Exoti. К настоящему времени стало ясно, что ферменты субсемейства Lon-протеиназ присутствуют в клетках самых различных организмов от прокариот до эукариот. В Exoli Lon-протеиназа осуществляет селективную деградацию ряда короткоживущих регуляторных белков, а также освобождает клетки от дефектных, поврежденных и мутантных белков.
Lon-протеиназа отличается от классических сериновых протеиназ следующими характерными особенностями: (1) протеолиз сопровождается гидролизом АТР; (2) фермент проявляет высокую селективность по отношению к белкам-мишеням при отсутствии выраженной первичной специфичности; (3) фермент функционирует как гомотетрамер; (4) субъединица Lon-протеиназы состоит из трех функциональных доменов - N-концевого, АТР-азного (центральный домен) и протеолитического (С-концевой домен).
Несмотря на существенные успехи в исследовании энзиматических свойств Lon-протеиназы и других АТР-зависимых протеиназ, природа селективности и механизм сопряжения АТР-азной и протеолитической активностей у этих ферментов не выяснены. В связи с этим представляется актуальным изучение роли отдельных фрагментов молекулы фермента в его функционировании и в сопряжении АТР-азной и
протеолитической активностей. В настоящей работе такое исследование проведено на примере Lon-протеиназы из Escherichia coli.
Цели и задачи исследования. Формирование единой полипептидной цепью субъединицы Lon-протеиназы наряду с протеолитическим двух других доменов (N-концевого и АТР-азного) позволяет предполагать, что либо определенные элементы структуры последних доменов участвуют в формировании протеолитического центра, либо эти домены осуществляют регуляцию активности уже полностью сформированного протеолитического активного центра фермента. Выбор между этими двумя возможностями можно осуществить путем получения изолированного протеолитического домена и исследования его энзиматической активности. Таким образом, основной задачей работы явилось получение ответа на вопрос, функционирует ли как протеиназа изолированный протеолитический домен АТР-зависимой Lon-протеиназы Exoli. Кроме того, весьма актуальным и важным представлялось выявление роли N-концевого домена в активности фермента.
Решение поставленных задач включало этапы установления границ функциональных доменов в субъединице Lon-протеиназы, получение модифицированных форм фермента, содержащих АТР-азный и протеолитический домены или только индивидуальный протеолитический домен (с учетом вьивленных границ доменов), и исследование ферментативной активности полученных препаратов.
Научная новизна и практическая значимость. В данной работе было проведено сопоставление аминокислотных последовательностей Lon-протеиназ из эволюционно удаленных источников, на основании которого были установлены границы N-концевого, АТР-азного и С-концевого протеолитического функциональных доменов в субъединицах ферментов.
Методами генной инженерии получены модифицированные формы Lon-протеиназы, включающие 1) фрагмент, содержащий АТР-азный и протеолитический домены, 2) протеолитический домен, 3) мутантную форму протеолитического домена, содержащую замену каталитически активного остатка Ser679Ala, 4) Lon-протеиназу, содержащую тромбин-чувствительный линкер между АТР-азным и протеолитическим доменами.
Показано, что изолированный протеолитический домен практически не проявляет протеолитической активности, но обладает активностью по отношению к
пептидному субстрату - мелиттину, что позволяет рассматривать изолированный протеолитический домен как пептидазу.
Установлено, что укороченная форма Lon-протеиназы, не содержащая N-концевого домена, практически полностью утрачивает и АТР-зависимую протеолитическую и АТР-азную активности, на основании чего сделано заключение, что структура N-концевого домена имеет важное значение для проявления Lon-протеиназой обоих видов ферментативной активности.
Высказано предположение об участии N-концевого домена в олигомеризации Lon-протеиназы, в результате которой формируются АТР-азный центр, белок-связывающий участок протеолитического центра и система сопряжения протеолиза и гидролиза АТР.
Полученные данные в совокупности с результатами параллельных исследований, проводимых в лаборатории химии протеолитических ферментов ИБХ, открывают новые перспективы для дальнейшего исследования механизма функционирования Lon-протеиназы и, в частности, природы сопряжения АТР-азной и протеолитической активностей фермента.
Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на аницах
машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка используемой литературы, включающего/55фаботы.
Апробация работы и публикации. Результаты исследований докладывались на Международной конференции памяти академика А.А.Баева (Москва, 1996), IV Симпозиуме по химии протеолитических ферментов (Москва, 1997), П Съезде Биохимического общества Российской Академии Наук (Москва, 1997), 17 Международном конгрессе по биохимии и молекулярной биологии (Сан Франциско, 1997), 16 Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Санкт-Петербург, 1998), Международной конференции Biocatalysis-98 (Пушино на Оке, 1998).
По теме диссертации опубликовано 9 работ.