Введение к работе
Актуальность темы исследования. Диссертационная работа посвящена изучению структурно-функципальной организации генов системы рестрикции-модификащш Ecorii. За прошедшие со времени открытия явления рестрикции - модификации четыре десятилетия интерес исследователей к нему не ослабевает. Получены данные о роли метилирования ДНК в репликации, репарации ДНК, возникновения в ее структуре "горячих точек", в регуляции экспрессии генов. Ферменты рестрикции - модификации п-типа нашли широкое применение в научно-исследовательской практике,как инструменты для получения ре-комбинантных ДНК, при физическом картировании и определении первичной структуры ДНК. Исключительный интерес также представляет использование этих ферментов, отличающихся высокой специфичностью взаимодействия с ДНК, в исследовании такой фундаментальной проблемы молекулярной биологии, как механизм белок-нуклеинового узнавания. В связи с этим клонирование и определение первичной структуры генов, компьютерное моделирование, функциональный анализ ферментов рестрикции-модификации направлены на решение важных эволюционных и молекулярно-биологических вопросов. Полученная информация о структурно - функциональных свойствах ферментов и ее анализ открывают возможности разработки подходов к белковой инженерии ферментов рестрикции-модификации.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работа заключалась в изучении структурно-функциональной организации генов, входящих в состав системы рестрикции-модификации Eoorii. В задачу исследования входило определение первичной структуры гена рестри-кционной эндонуклеазы Ecorii, изучение экспрессии генов системы рестрикции - модификации , функциональный анализ делецион-ных вариантов метилазы, кошьютерный анализ первичных структур генов и построение на его основе модели модификации ферментов.
Научная новизна. В ходе выполнения диссертационной работы впервые была определена первичная структура гена рестрикциошюй эндонуклеазы R.EooRii и было показано, что система рестрикции-модификации Eoorii имеет конвергентный тип организации генов. Перед рестриктазным геном обнаружена трансляционная рамка для предполагаемого гена С. Изучена экспрессия генов ДНК- метилтрансферазы и эндонуклеазы в сопряженной прокариотической системе транскрипции-трансляции in vivo. Обнаружена строгая скоординировашюсть их экспрессии. Исходя из анализа первичной структуры рассмотрены возможные механизмы их согласованной регуляции. Получены деле-ционные варианты гена ДНК-метилтрансферазы u.EooRH, изучена их экспрессия в системах in vivo и in vitro. Проведен сравнительный анализ аминокислотных последовательностей генов системы рэстрик-
ции - модификации EcoRll. В ходе анализа вариабельных районов ме-тилгрансфераз M.EcoRii, M.dcm, М. NlaX, M.SPR и первичной структуры гена рестрикционной эндонуклеазы EcoRll обнаружены два района гомологии. Впервые среди систем рестрикции-модификации П-типа при сравнении генов EooRll системы обнаружен межмолекулярный район гомологии в составе тех аминокислотных участков, которые вовлечены в процесс сайт - специфического взаимодействия с ДНК. При анализе первичных структур гена r.Ecorii (ccwgg), а также ряда генов рестрикционных эндонуклеаз с близкой специфичностью R.Mspl (CCGG), R.smal (cccggg), R.cirBi (ccwwgg) найдены сходные амино-кислотные мотивы в их составе.
Научно-практическая значимость. Полученные в диссертационной работе данные расширяют современные представления о структурной организации и молекулярной эволюции генов, входящих в состав систем рестрикции-модификации. Результаты работы имеют также определенный практический интерес. Дальнейшее развитие современной биологической науки и ее прикладных аспектов во многом зависит от доступности широкого ассортимента ферментов рестрикции-модификации с различной субстратной специфичностью. В связи с этим весьма вероятно, что в ближайшие года белковая инженерия ферментов рестрикции-модификации будет магистральным направлением в решении проблемы белок-нуклеинового узнавания.Полученные данные по структурно-функциональной организации генов и ферментов системы рестрикции-модификации EcoRll, обнаружение консервативных аминокислотных остатков в составе ДНК-узнающих доменов позволяют построение модели модификации белков с целью изменения их специфичности.
Апробация. Основные положения диссертационной работы были представлены на конференции молодых ученых НЦ АН СССР (г.Пушино, 1987 г), на I Всесоюзном симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений" (1991 г.), на v-ой конференции Российской Федерации " Новые направления биотехнологии " (1992), FASEB Summer Research Conference, Restriction Endonucleases and Modification Methyl-transferases ;Structure and Mechanisms, Vermont, USA, (1993).
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано семь печатных работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 122 страницах , состоит из введения,обзора литературы.описания материалов и методов исследования , обсуждения реулыатов и выводов. Работа содержит 22 рисунка и 8 таблиц. Список цитируемой литературы состоит из 195 наименований.