Введение к работе
з Актуальность проблемы
По данным ВОЗ, уровень заболеваемости и смертности от чумы в последние годы не имеет тенденции к снижению. Наличие природных очагов этой инфекции в России и опасность ее заноса из других стран обусловливают необходимость совершенствования специфической профилактики и лечения чумы. Успешное решение указанных проблем невозможно без знания механизмов пато- и иммуногенеза чумы и роли отдельных антигенов Yersinia pestis в этих процессах. Особый интерес в данном плане представляет "мышиный" токсин (МТ), который, несмотря на давность его открытая и длительность изучения, остается малопонятным для исследователей, занимающихся вопросами вирулентности и иммуногенности чумного микроба (Brabaker, 1979; Ефременко, 1983; Исин, Тугумбаев, 1987; Наумов и др., 1995; Куклева и др., 1996). Обширные исследования Т.С. Montie et al. (1970-1982) по структурной организации токсина не привели к окончательному решению затронутых вопросов. Исследования Т.Д. Черкасовой и др. (1988-1992) и П.А. Черепанова и др. (1991) указывают на необходимость уточнения многих моментов патогенетического действия МТ и его структурно-функциональной характеристики.
Одним из серьезных препятствий на пути углубленного изучения биологических свойств МТ, выяснения его физиологической значимости для бактериальной клетки и поиска мишеней его действия является отсутствие в распоряжении исследователей необходимых количеств гомогенного препарата токсина Использование препаратов различной степени очистки затрудняет понимание механизмов патогенетического действия МТ из-за возможного потенцирующего влияния других факторов вирулентности возбудителя. В связи с этим большой интерес представляют генноинженерный путь конструирования штамма-продуцента МТ, его характеристика, а также подбор условий выделения и очистки, обеспечивающих получение МТ в препаративных количествах.
4 Благодаря доказательству внехромосомной локализации гена,
детерминирующего синтез МТ на собственной плазмиде pYT чумного микроба
(Проценко и др., 1983), его клонированию в составе различных векторов и
изучению особенностей экспрессии в разных хозяевах (Марченков и др., 1989;
Черепанов и др., 1991; Дармов и др., 1992), а также секвенированию
нуклеотидной (НК) последовательности гена МТ (Черепанов и др., 1991)
появилась возможность более углубленного изучения этого биологически
активного вещества с использованием современных молекулярно-
биологических подходов. Одним из таких подходов, широко используемых в
последние годы для характеристики различных белков, является исследование
их первичной НК и соответствующей аминокислотной (АК)
последовательностей для предсказания биологических свойств с последующей
экспериментальной проверкой. Однако в отношении МТ такой анализ не
проводился.
Достигнутые в последние годы успехи в изучении молекулярной
организации гена МТ позволяют подойти к этому биологически активному
веществу с позиций его априорной полифункциональности. В частности,
можно предположить наличие у него нескольких ферментативных
активностей. Однако исследования, подтверждающие точку зрения на МТ как
полифункциональный белок, до настоящего времени не проводились. Другим
современным бодходом к пониманию роли МТ в патогенезе чумы является
поиск у него суперантигенных свойств, которыми обладают многие
бактериальные экзотоксины: Pseudomonas aeruginosa, токсины Staphylococcus
aureus (А,В,С 1, С 2, С 3, D, Е), toxic shock syndrome toxin I (TSST-I),
staphylococcal exfoliative toxin, streptococcal pyrogenic toxin А и др. (Y^P, 1990;
Callahan, 1990; Carlsson, 1988; Flusher, 1989; Bauer, 1989). Суперантигены
оказывают мощное воздействие на иммунную систему, дезорганизуя ее работу,
что приводит к формированию иммунопатологических реакций, в том числе
токсического шока Выявление суперантигенных свойств у МТ позволило бы
по-hobomv взглянуть на механизмы его участия в патогенезе чумы.
5 В связи с тем, что исход заболеваний, вызываемых внутриклеточными
паразитами, к которым относится и Y. pestis, во многом зависит от
взаимодействия возбудителя с клетками фагоцитарной системы, представляет
интерес влияния МТ на этот процесс, что до сих пор остается малоизученным.
Новейшие технологические достижения в области сиквенса первичных нуклеотидных последовательностей в сочетании с мощным информационным и программный обеспечением, позволяют создавать тест-системы на основе полимеразной цегаюй реакции (ПЦР) с высокоспецифичными праймерами не только для идентификации различных инфекционных агентов, но и известных детерминант и маркеров вирулентности. Однако до настоящего времени не разработан метод тестирования гена МТ при помощи ПЦР, который мог бы стать существенным дополнением схемы идентификации и характеристики атипичных бесфракционных штаммов Y. pestis.
Изучение перечисленных выше вопросов представляется актуальным, так как позволяет уточнить структурную характеристику МТ, прояснять его физиологическую значимость для бактериальной клетки, определить вклад в развитие чумной инфекции, предложить высокочувствительный и специфический тест для выявления генаМТ.
Цель работы.
Структурно-функциональная характеристика МТ чумного микроба, выяснение его роли и механизмов участия в патогенезе чумы, а также разработка метода тестирования гена МТ в системе ПЦР.
Задачи исследования.
1.Провести компьютерный анализ НК и соответствующей АК последовательностей белка МТ для прогнозирования и возможного объяснения его биологических свойств.
2.Получить очищенный гомогенный препарат МТ.
6 З.Исследовать ферментативные свойства МТ.
4.Выявить факторы, влияющие на летальный эффект МТ.
5. Определить влияние МТ на клетки фагоцитарной системы экспериментальных животных с разной восприимчивостью к этому биологически активному веществу.
б.Изучить действие МТ на клетки перевиваемых клеточных линий экспериментальных животных и человека.
7.Оценить наличие суперантигеныой активности у МТ.
8.Сконструировать высокоспецифичные праймеры для тестирования гена МТ при помощи ПЦР.
Научная новизна.
—Впервые выполнен компьютерный анализ НК и соответствующей АК последовательностей белка МТ Y. pestis, на основании которого предсказаны его ферментативные свойства и суперантигенная активность.
—Предложены продуцент МТ — штамм Escherichia coli DH 5а, несущий рекомбинантную плазмиду рМВ 188 с клонированным геном МТ, и выделенный из него очищенный препарат МТ.
—Доказано, что МТ представляет собой полифункциональный белок, обладающий несколькими ферментативными активностями.
—Выявлен ряд факторов, модулирующих летальный эффект МТ.
—Доказано, что МТ обладает суперантигенными свойствами и оказывает мощное воздействие на иммунную систему, дезорганизуя ее работу.
—Показано, что в патогенезе обусловленных МТ иммунопатологических реакций существенная роль принадлежит цитокинам (ИЛ-1 и ИЛ-2).
—Выявлен антифагоцигарный эффект МТ в организме чувствительных к нему экспериментальных животных.
—Предложен высокочувствительный и специфичный метод определения гена МТ при помощи ПЦР, позволяющий идентифицировать его наличие у типичных и атипичных штаммов Y. pestis.
Практическая значимость.
Впервые осуществлен компьютерный анализ НК и АК последовательностей гена и белковой молекулы МТ, позволивший составить представление о его пространственной структуре и локализации функциональных сайтов на полипептиде, провести моделирование взаимодействия отдельных доменов молекулы, объяснить ее поведение в различных условиях, а также предсказать ряд свойств МТ. Компьютерный пропюз дал возможность осуществить целенаправленный поиск наиболее существенных для МТ свойств. Экспериментально подтверждено, что МТ представляет собой белок, обладающий несколькими ферментативными активностями, и является суперантигеном, что важно для расшифровки неизвестных ранее механизмов участия этого биологически активного вещества в патогенезе чумы. Установлен антифагоцитарный эффект МТ в организме чувствительных к нему экспериментальных животных, играющий существенную роль в развитии чумной инфекции. Заложен теоретический фундамент для поиска новых подходов к профилактике и лечению чумы.
Практическая ценность работы заключается в получении высокоочищенного препарата МТ с использованием штамма-продуцента Б. coli DH 5а, несущего рекомбинантную плазмиду рМВ 188 с клонированным геном МТ, а также в разработке и внедрении в практику научных исследований высокочувствительного и специфичного метода тестирования гена МТ при помощи ГЩР. Предложенный метод может быть использован для идентификации гена МТ у типичных и атипичных (в том числе бесфраихионных) штаммов Y. pestis, часто появляющихся в природе на спаде эпизоотии (Кудинова, 1968). Материалы исследований легли в основу "Методических рекомендаций по выявлению "мышиного" токсина с помощью полимеразной цепной реакции" (утверждены Ученым Советом РПЧИ, 19.06.97, протокол №3).
Положення, выносимые на защиту:
1. Компьютерный анализ нуоеотидной и соответствующей
аминокислотной последовательностей белка МТ позволяет прогнозировать его
биологические свойства
2. МТ является полифункциональным белком, обладающим несколькими
ферментативными активностями.
-
МТ относится к группе суперантигенов и оказывает мощное воздействие на иммунную систему, дезорганизуя ее работу в организме чувствительных экспериментальных животных.
-
В патогенезе обусловленных МТ иммунопатологических реакций существенная роль принадлежит цитокинам.
5. Высокочувствительный и специфичный метод тестирования гена МТ
при помощи ПЦР.
Апробация работы.
Изложенные в диссертации материалы доложены и обсуждены на конкурсе и конференции молодых ученых (1995, 1996) РНИПЧИ, а также представлены на объединенном конгрессе научных обществ (Кейптаун, ЮАР, 1997); 8-ом Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным болезням (Лозанна, Швейцария, 1997); 13-ом Европейском иммунологическом съезде (Амстердам, Нидерланды, 1997).
Структура диссертации.