Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 12
1.1. Структура и функции церулоплазмина 12
1.2. Участие белковых факторов нейтрофилов и эозинофилов в воспалительных реакциях 27
1.2.1. Участники респираторного взрыва нейтрофилов и эозинофилов: оксидазы и пероксидазы 29
1.2.2. Протеолитические ферменты лейкоцитов 40
1.2.3. Железо-связывающие белки лейкоцитов 44
1.2.4. Белки лейкоцитов, влияющие на стабильность мембраны микроорганизмов 48
1.2.5. Окислительная модификация липопротеинов, сопровождающая воспаление 49
1.3. Заключение по обзору литературы 55
2. Материалы и методы исследования 57
2.1. Реактивы, использованные в работе 57
2.1.1. Получение опсонизированного зимозана 58
2.1.2. Получение бромциана 58
2.2. Клеточные методы 59
2.2.1. Выделение нейтрофилов 59
2.2.2. Измерение индекса фагоцитоза нейтрофилов 59
2.2.3. Измерение продукции супероксидных анион-радикалов нейтрофилами 59
2.2.4. Измерение продукции пероксида водорода нейтрофилами 60
2.2.5. Анализ проатерогенности липопротеинов низкой плотности при культивировании с моноцитами 60
2.3. Хроматографические методы 61
2.3.1. Синтез сорбентов 61
2.3.1.1 Иммобилизация соединений, содержащих №Ї2-группу, на BrCN-активированной Сефарозе и агарозе 61
2.3.1.2. Получение аминоэтил-(АЕ)-агарозы 62
2.3.2. Гель-фильтрация 62
2.3.3. Аффинная хроматография 62
2.3.3.1. Аффинная хроматография экстракта лейкоцитов на иммобилизованном церулоплазмине 62
2.3.3.2. Аффинная хроматография пероксидазы эозинофилов на иммобилизованном церулоплазмине 62
2.3.3.3. Измерение константы диссоциации комплекса церулоплазмин-азуроцидин 63
2.3.3.4. Аффинная хроматография липопротеинов низкой плотности на иммобилизованной миелопероксидазе 63
2.4. Спектральные методы исследования 63
2.4.1. Спектрофотометрия 63
2.4.2. Фотонная корреляционная спектроскопия 64
2.4.3. Электронный парамагнитный резонанс 65
2.4.4. Хемилюминесценция 65
2.5. Измерение активности ферментов 66
2.5.1. Измерение активности миелопероксидазы и пероксидазы эозинофилов 66
2.5.1.1. Измерение пероксидазной активности 66
2.5.1.2. Кинетика пероксидазной активности миелопероксидазы 67
2.5.1.3. Кинетика пероксидазной активности пероксидазы эозинофилов 67
2.5.1.4. (Псевдо)галогенирующая активность миелопероксидазы и пероксидазы эозинофилов 67
2.5.1.5. Измерение утилизации пероксида водорода миелопероксидазой с помощью сенсора на основе пленок берлинской лазури 68
2.5.2. Измерение оксидазной активности церулоплазмина 68
2.5.2.1. Пара-фенилендиамин-оксидазная активность церулоплазмина 68
2.5.2.2. Кинетика пара-фенилендиамин-оксидазной активности церулоплазмина 69
2.5.2.3. Кинетика ферроксидазной активности церулоплазмина 69
2.5.2.4. Измерение супероксиддисмутазной активности церулоплазмина 69
2.5.3. Измерение активности эластазы и протеиназы 3 70
2.5.3.1. Кинетика активности эластазы и протеиназы 3 70
2.5.4. Измерение активности катепсина G 70
2.5.4.1. Кинетика активности катепсина G 70
2.5.5. Измерение активности тромбина 70
2.5.6. Измерение активности 5-липоксигеназы 71
2.6. Электрофоретические методы 71
2.6.1. Диск-электрофорез в щелочной системе 71
2.6.1.1. Выявление о-дианизидин-оксидазной активности после электрофореза 72
2.6.2. Диск-электрофорез в кислой системе 72
2.6.2.1. Выявление пероксидазной активности после электрофореза 72
2.6.3. Электрофорез в кислой системе в присутствии мочевины 73
2.6.4. Диск-электрофорез в нейтральной системе 73
2.6.5. Электрофорез в щелочной системе в присутствии SDS 73
2.6.5.1. Выявление желатиназной активности in situ 74
2.6.5.2. Выявление пероксидазной активности in situ 74
2.6.6. Электрофорез в присутствии SDS в высокомолярной Tris-буферной системе 74
2.6.7. Электрофорез в четырехслойном полиакриламидном геле 75
2.6.8. Масс-спектрометрия фрагментов трипсинолиза после электрофореза 75
2.6.9. Анализ N-концевой аминокислотной последовательности 76
2.7. Получение белковых препаратов 76
2.7.1. Выделение церулоплазмина плазмы крови 76
2.7.1.1. Выделение церулоплазмина с помощью протамин-Сефарозы 76
2.7.1.2. Выделение церулоплазмина с помощью неомицин-агарозы 77
2.7.1.3. Выделение церулоплазмина на АЕ-агарозе 78
2.7.2. Выделение лактоферрина грудного молока 79
2.7.3. Выделение белков нейтрофильных лейкоцитов 79
2.7.3.1. Выделение миелопероксидазы 80
2.7.3.2. Выделение серпроцидинов 80
2.7.3.3. Выделение СТАВ-миелопероксидазы и СТАВ-пероксидазы эозинофилов 81
2.7.4. Выделение липопротеинов плазмы крови 81
2.8. Иммунохимические методы 82
2.8.1. Подготовка антигенов для иммунизации 82
2.8.2. Иммунизация кроликов и крыс 82
2.8.3. Выделение иммуноглобулинов G сыворотки 82
2.8.4. Двойная радиальная иммунодиффузия 83
2.8.5. Ракетный иммуноэлектрофорез 83
2.8.6. Вестерн-блоттинг 84
2.8.7. Твердофазный иммуноферментный анализ 85
2.8.7.1. Сэндвич иммуноферментный анализ миелопероксидазы 85
2.8.7.2. Конкурентный иммуноферментный анализ церулоплазмина 86
2.8.7.3. Иммуноферментный анализ азуроцидина 86
2.8.8. Иммунопреципитация церулоплазмина из плазмы крови 87
2.9. Антимикробная активность лактоферрина и миелопероксидазы 87
2.10. Модификация белков и липопротеинов низкой плотности 87
2.10.1. Получение апо-формы церулоплазмина 87
2.10.2. Получение протеолизованного церулоплазмина 88
2.10.3. Получение лактоферрина, насыщенного железом и медью 88
2.10.4. Модификация церулоплазмина окислителями 88
2.10.5. Модификация липопротеинов низкой плотности окислителями 89
2.11. Анализ трехмерной структуры белков и их комплексов 89
2.12. Статистическая обработка результатов 89
2.13. Получение образцов от здоровых доноров, пациентов с воспалительными заболеваниями и лабораторных животных 90
3. Результаты 91
3.1. Структура комплексов, формируемых при взаимодействии церулоплазмина с лактоферрином и миелопероксидазой 91
3.1.1. Исследование методом гель-фильтрации 91
3.1.2. Исследование методом фотонной корреляционной спектроскопии 93
3.2. Идентификация белков лейкоцитов, взаимодействующих с церулоплазмином 95
3.2.1. Анализ белков экстракта лейкоцитов, сорбирующихся на иммобилизованном церулоплазмине 96
3.2.2. Анализ комплексов церулоплазмина, выделяемых при очистке его препаратов 97
3.2.3. Идентификация компонентов комплексов, обнаруживаемых у пациентов при воспалительных процессах 100
3.2.3.1. Идентификация компонентов комплексов ЦП, содержащих МПО и апоВ-100- содержащие липопротеины 101
3.3. Изучение взаимодействия церулоплазмина с серпроцидинами и пероксидазой эозинофилов 102
3.3.1. Изучение взаимодействия церулоплазмина с серпроцидинами 102
3.3.2. Изучение взаимодействия церулоплазмина и пероксидазы эозинофилов 105
3.4. Изучение взаимного влияния церулоплазмина и белков лейкоцитов на их ферментативные свойства 108
3.4.1. Влияние серпроцидинов и пероксидазы эозинофилов на ферментативные свойства церулоплазмина 109
3.4.2. Изучение механизма ингибирования церулоплазмином миелопероксидазы, пероксидазы эозинофилов и 5 -липоксигеназы 110
3.4.3. Влияние церулоплазмина на активность серпроцидинов 127
3.4.4. Влияние апо-лактоферрина на деструкцию церулоплазмина индуцированную пероксидом водорода 130
3.5. Изучение протеолитической деградации церулоплазмина in vivo и in vitro 140
3.5.1. Протеолитическая деградация церулоплазмина в биологических жидкостях при воспалении 142
3.5.2. Идентификация протеиназ, деградирующих препараты церулоплазмина 144
3.6. Многокомпонентные комплексы церулоплазмина 152
3.6.1. Свойства комплексов церулоплазмина, миелопероксидазы и апоВ-100-содержащих липопротеинов 153
3.6.2. Проатерогенное действие миелопероксидазы при связывании с липопротеинами 165
3.6.2.1. Сродство миелопероксидазы к модифицированным липопротеинам 165
3.6.2.2. Проатерогенные свойства модифицированных липопротеинов 166
3.7. Антиоксидантные свойства ЦП, модифицированного окислителями 172
4. Обсуждение результатов 177
5. Выводы 203
6. Список сокращений 204
7. Список литературы
- Белки лейкоцитов, влияющие на стабильность мембраны микроорганизмов
- Измерение продукции супероксидных анион-радикалов нейтрофилами
- Измерение активности миелопероксидазы и пероксидазы эозинофилов
- Анализ белков экстракта лейкоцитов, сорбирующихся на иммобилизованном церулоплазмине
Белки лейкоцитов, влияющие на стабильность мембраны микроорганизмов
Интересно, что у-интерферон после активации транскрипции гена ЦП снижает активность трансляции его иРНК с помощью неканонической функции глутамил-пролил-тРНК-синтетазы (рис. 1.4) [Sampath et al., 2003, Sampath et al., 2004]. При действии y-интерферона за первые 4 часа глутамил-пролил-тРНК-синтетаза фосфорилируется, выходит из мультикомпонентного комплекса аминоацил-тРНК-синтетаз и соединяется с рибонуклеарным белком Q1. Через 12 часов происходит связывание с фосфор илированным рибосомальным белком ЫЗа и с глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназой. Такой комплекс, называемый у-интерферон активируемым ингибитором трансляции, угнетает трансляцию ЦП, связываясь с 3" -концом иРНК ЦП.
Продемонстрировано также наличие в промоторной зоне гена ЦП двух сайтов (с -248 по -240, с -3684 по -3677) для активирующего белка-1 (АР-1). Первый сайт конститутивно функционирует в клетках яичника, но неактивен в гепатоцитах [Lee et al., 2004], а второй активируется в гепатоцитах в присутствии редокс-активной меди, например в комплексе с пирролидин дитиокарбаматом [Das et al., 2007]. В случае умеренного дефицита глутатиона экспрессия ЦП гепатоцитами увеличивается за счет активации второго АР-1 сайта, однако при существенном снижении уровня глутатиона (более чем на 40 %) синтез ЦП снижается за счет влияния активных форм кислорода на иРНК ЦП [Tapryal et al., 2010]. Рядом с АР-1 сайтом расположен гипоксия-респонсивный элемент (с -3639 по -3429), который отвечает за экспрессию гена ЦП под действием HIF-1 [Martin еґ al, 2005].
На мембране клеток центральной нервной системы (астроцитов, лептоменингеальных клеток) и клеток Сертоли находится ЦП с глицеролфосфоинозидным-(ОР1)-якорем на С-конце, образовавшийся в результате альтернативного сплайсинга между 19-м и 20-м экзонами (рис. 1.5). Наличие альтернативной формы ЦП традиционно связывали с необходимостью осуществления функций, присущих ЦП, в районах, куда поступлению ЦП крови препятствуют гематоэнцефалический и гематотестикулярный барьеры [Patel and David, 1997; Mittal et al., 2003; Fornta et al., 1999]. Однако позже GPI-форма ЦП была обнаружена на лимфоцитах периферической крови и гепатоцитах [Marques et al., 2012]. Экспрессия гена ЦП в центральной нервной системе продемонстрирована в основных структурах мозга, в т.ч. и в сетчатке глаза [Klomp et al., 1996; Klomp and Gitlin, 1996]. GPI-форма ЦП сетчатки, вероятно, противостоит вызванному квантами света окислительному стрессу: в экспериментах на мышах уровень ЦП-иРНК возрастал в 8 раз после освещения сетчатки животных. ЦП был выявлен во всех типах клеток сетчатки, где его концентрация выше, чем в остальных структурах мозга [Chen et al., 2003]. При травмах мозга у мышей уровень GPI-ЦП на астроцитах увеличивается под действием интерлейкина 1(3 (IL-1[3), причем даже у животных с дефицитом рецепторов IL-1 [Kuhlov et al., 2003]. Синтез ЦП увеличивается после кровоизлияния в головной мозг посредством активации рецептора тромбина [Yang et al., 2006]. В эндоплазматическом ретикулуме происходит N-гликозилирование ЦП. Встраивание в ЦП ионов меди, вероятно, происходит в транс-сети аппарата Гольджи.
Уже 80 лет назад впервые было отмечено, что при недостаточном поступлении меди в организм животные страдали анемией [Hart et al., 1928]. У животных, содержавшихся на медьдефицитной диете, через некоторое время наступало уменьшение концентрации сывороточного железа и меди эритроцитов, а затем резко снижалось количество эритроцитов в крови [Lahey et al., 1952]. С момента открытия ЦП было установлено, что он является оксидазой, способной окислять синтетические ароматические амины и фенолы [Holmberg and Laurell, 1951]. 9+ + Позже была изучена способность ЦП окислять Fe до Fe и доказано физиологическое значение этой реакции [Osaki, 1966; Osaki et al., 1969]. ЦП получил систематическое название согласно Международной Классификации Ферментов - «ферро:Ог-оксидоредуктаза, КФ 1.16.3.1». Часто используется более короткое название -ферроксидаза I. Обнаружение ферроксидазной активности ЦП позволило предположить, что этот фермент является связующим звеном между обменом железа и меди. однако без участия ЦП за сутки в ТФ встраивается 3-5 мг Fe против 60 мг в присутствии ЦП [Frieden and Hsieh, 1976]. Учитывая суточную потребность в железе для человека (35-40 мг), можно сделать вывод, что ЦП необходим для поддержания нормального уровня окисленного железа в плазме крови (рис. 1.6, а). формах, для поглощения мембраной энтероцита должно восстановиться до Fe [Зайчик и Чурилов, 2001]. В щеточной каемке энтероцита присутствуют апикальная мембранная редуктаза (FeR) и связанный с ней транспортер двухвалентных металлов DMT1 (Nramp2, DCT1, SLC11A2), которые осуществляют абсорбцию железа в тонком кишечнике. На базолатеральной мембране энтероцита присутствует другой транспортер железа - IREG1 9+ (МТР1, ферропортин 1, SLC11A3), способствующий переносу Fe , которое затем окисляется гомологом ЦП - гефестином, встроенным в мембрану. Мутация в гене IREG1 (локализация - 2q32) ведет к гемохроматозу [Roy and Andrews, 2001].
Гефестин (локализация - Xqll-ql2) принадлежит вместе с ЦП к купредоксиновому суперсемейству. Структура гефестина (1158 а. о.), смоделированная по третичной структуре ЦП и данным о последовательности кДНК, содержит гомологичный ЦП активный центр и участки связывания меди [Syed et al., 2002]. В отличие от ЦП, в молекуле гефестина один из доменов является трансмембранным [Anderson et al., 2002]. У мышей сцепленная с полом мутация в гене гефестина (sla) приводит к дефициту железа и анемии. Эксперименты на мышах с мутациями белков абсорбции железа и мышах, содержавшихся на железодефицитной диете, показали, что DMT1 модулирует ответ энтероцитов на местные сигналы содержания железа, тогда как экспрессия генов IREG1 и гефестина увеличивается в ответ на системные изменения уровня железа [Chen et al., 2003]. Таким образом, потребность организма в железе в первую очередь отражается на апикальных белках энтероцита, а затем детерминирует экспрессию белков базолатеральной мембраны. Содержание железа в цитоплазме энтероцита контролирует активность DMT1 и экспрессию его гена [Anderson et al., 2002]. Эксперименты по передаче микроэлементов плоду от матери, находившейся на железо- и медьдефицитной диете, показали, что материнский организм минимизирует дефицит за счет усиления экспрессии таких белков, как рецептор трансферрина и гефестин, а также повышая содержание меди в печени, сыворотке и плаценте матери [Gambling et al., 2003]. У крыс, содержавшихся на железодефицитной диете, показано увеличение синтеза иРНК гефестина [Sakakibara and Aoyama, 2002].
Измерение продукции супероксидных анион-радикалов нейтрофилами
Хотя нет сомнения в том, что МПО катализирует окислительную модификацию апоА-1 и ослабляет его функцию, точные модификации, которые приводят к ухудшению различных функций ЛВП, требуют дальнейших исследований. Структурные исследования позволили представить соотношение функции и структуры ЛВП, чтобы определить участки, вовлеченные в окислительную модификацию апоА-I. Обновленная структурная модель ЛВП была недавно получена при исследовании водородно-дейтериевого обмена с помощью масс-спектрометрии, позволяющей определить количество амидов в полипептидной цепи апоА-I в ЛВП, доступных для обмена с растворителем [Wu et al., 2007]. В данной модели две молекулы апоА-I организованы в антипараллельную двойную петлю, доступную для растворителя, соответствующую а. о. 159-170, которая вовлечена в присоединение и активацию LCAT. Эта петля содержит одну из предпочтительных мишеней для окисления МПО - Y166, модифицированный в апоА-I, выделенном из атеросклеротических бляшек [Wu et al., 2007]. Недавние исследования предполагают, что модификация тирозина не требуется для МПО-зависимого нарушения пути оттока холестерина с помощью АВСА1, так как мутанты апоА-I с мутациями по всем остаткам тирозина были восприимчивы к окислительной инактивации с помощью МПО [Peng et al., 2008]. Однако мутация Y166F привела к потере большинства активностей LCAT [Wu et al., 2007]. Недавно были исследованы а. о., вовлеченные в окислительную инактивацию апоА-I, необходимые для оттока холестерина по АВСА1 пути. В апоА-I было обнаружено четыре остатка триптофана, доступных для окисления. Во-первых, сайт-направленный мутагенез с заменой данных триптофанов на лейцины привел к тому, что полученные ЛВП были неспособны осуществить отток холестерина, во-вторых, замена каждого из четырех остатков триптофана на фенилаланин привела к тому, что полученные ЛВП были не только функциональны в отношении оттока холестерина, но и заметно более устойчивы для окислительной модификации. Эти данные предполагают, что модификация триптофанов -существенный фактор, вовлеченный в утрату функции ЛВП для оттока холестерина с помощью АВСА1 [Peng et al., 2005]. Как это ни парадоксально, другие исследователи не сообщают ни о каком влиянии мутации триптофанов на функцию оттока холестерина и вместо этого настаивают на ключевой роли тирозина и метионина в окислительной инактивации ЛВП, несмотря на сообщения о том, что апоА-I с полной заменой тирозинов и метионинов сохраняет способность к оттоку холестерина, активации LCAT и чувствительность к окислительной инактивации [Nicolls and Hazen, 2009].
Недавние исследования показали, что катализируемое МПО карбамилирование может также играть важную роль в атеросклерозе посредством модификации ЛВП. Низкие уровни катализируемого МПО карбамилирования ЛВП препятствуют апоптозу эндотелиальных клеток и пролиферации гладко-мышечных клеток [Wang et al., 2007]. Учитывая, что МПО влияет на проатерогенность ЛНП и функциональные возможности ЛВП по оттоку холестерина, можно предположить, что уменьшение активности МПО способно обеспечить терапевтический подход к управлению про- и антиатерогенными свойствами ЛНП и ЛВП. Тот факт, что статины частично снижают экспрессию гена МПО [Kumar and Reynolds, 2005] и уменьшают системные уровни модификации белка катализируемыми МПО путями [Shishehbor et al., 2003], предполагает, что как минимум часть так называемого плейотропного эффекта статинов обеспечена их влиянием на уровень и активность МПО.
Исследования влияния МПО на формирование атеросклеротических повреждений в животных моделях атеросклероза привели к различным результатам. Модели на мышах продемонстрировали роль МПО и продуктов ее катализа в остром воспалении, пероксидации липидов, эндотелиальной дисфункции и неудачном ремоделировании желудочков после инфаркта [Zhang et al., 2002; Brennan et al., 2002; Eiserich et al., 2002; Askari et al., 2003]. Однако ранние исследования показали, что одновременное нокаутирование по генам МПО и апо-Е у мышей не вызывало увеличения атеросклеротических повреждений, а пересадка костного мозга от мышей, нокаутированных по гену МПО, облученным мышам, нокаутированным по гену рецептора ЛНП, привело к неожиданно низкому уровню повреждений [Brennan et al., 2001]. Последующие наблюдения указывают на непригодность мышиной модели для исследования атерогенеза у человека: атеросклеротические повреждения аорты мышей практически не содержали МПО и ее продуктов, в отличие от наблюдений на атероме человека. Кроме того, мышиные лейкоциты содержат в 10-20 раз меньше МПО на клетку, чем у человека [Brennan et al., 2001; Nauseef, 2001]. Несколько групп исследователей предприняли попытки к созданию «гуманизированной» по МПО модели атеросклероза у мышей. Оказалось, что мыши, трансгенные по МПО человека, страдают от атеросклероза и развивающихся бляшек [Wang, et al., 2007; Castellani et al., 2006; McMillen et al., 2005]. Использование таких мышей, в организме которых обнаруживаются высокие уровни каталитически активной МПО, является перспективным для исследования потенциальных ингибиторов МПО как эффекторов, препятствующих развитию атеросклероза.
В литературе существует достаточно большой массив данных, которые явились предпосылкой для проведения исследования взаимодействия ЦП с белковыми компонентами лейкоцитов. Известно, что нокаутированные по гену ЦП животные чувствительны к развитию воспаления [Glezer et al, 2007; Bakhautdin et al., 2013], среди белков лейкоцитов и участников воспаления был обнаружен ряд партнеров ЦП [Соколов и соавт., 2007; Vasilyev, 2010]. ЦП относят к физиологическим регуляторам активности МПО [Segelmark et al., 1997; Sokolov et al., 2008; Champan et al., 2013], которая является основным ферментом лейкоцитов, катализирующим синтез хлорноватистой кислоты -важнейшего предшественника свободных радикалов при воспалении [Панасенко и соавт., 2013]. Нами было показано, что протеолизованный ЦП не способен ингибировать активность МПО [Соколов, 2007]. При этом ферментативные системы, вызывающие протеолиз ЦП in vivo и при очистке его препаратов, до сих пор не были детально охарактеризованы, хотя протеолизованный ЦП выявлен в сыворотке крови у пациентов с болезнью Альцгеймера [Squitti et al., 2008] и гемофилией А и В [Алексанян, 2007]. Протеолиз препаратов ЦП при хранении независимо описан несколькими группами исследователей [Ryden, 1971; Kingston et al., 1977; Kingston et al., 1979; Moshkov et al., 1979; Prozorovski et al., 1982; Соколов и соавт., 2005]. Среди белков лейкоцитов, взаимодействующих с ЦП, нами были выявлены три протеиназы, представители семейства серпроцидинов: эластаза, катепсин G и протеиназа 3 [Соколов и соавт., 2007]. Тот факт, что при ряде патологий, связанных с избыточным воспалением, выявляются признаки повреждения собственных тканей организма, например биомаркеры галогенирующего стресса и модифицированные проатерогенные липопротеины [Панасенко и соавт., 2013], свидетельствует о том, что «буферная противовоспалительная емкость» существующих в организме эндогенных регуляторов воспаления, в том числе ЦП, конечна и молекулярная основа этих ограничений требует расшифровки.
Измерение активности миелопероксидазы и пероксидазы эозинофилов
Для оценки сродства САР37 к ЦП нами была предпринята попытка определить К& комплекса, формируемого САР37 с иммобилизованным ЦП. Измерение концентрации свободного САР37 после инкубации с ЦП-Сефарозой и контрольной Сефарозой позволило оценить специфическое связывание САР37 с иммобилизованным ЦП. С помощью графиков в координатах Скэтчарда по результатам добавления САР37 к аликвотам ЦП-Сефарозы 0,5 и 1 мкМ получены одинаковые значения К& (рис. 3.7). Участки аппроксимирующих прямых пересекли ось абсцисс в точках 53 и 111 нМ. Таким образом, отношение концентраций центров связывания весьма близко к отношению аликвот ЦП-Сефарозы (0,5/1 53/111), использованных в опытах. [В]
Это говорит об электростатической природе взаимодействия, учитывая, что ЦП является кислым белком (pi 4,7), а ЭПО - катионным (pi 10,8) [Weiler et ah, 1992]. Для катионной МПО нами ранее наблюдалась элюция с ЦП-Сефарозы при ионной силе выше 300 мМ NaCl либо при рН ниже 3,9 [Соколов и соавт., 2007]. При гель-фильтрации смеси ЦП и ЭПО (1:1, моль/моль) они элю провались совместно в виде единичного пика, в котором соотношение Абк/А28о и А413/А280 составило 0,032 и 0,30 соответственно, тогда как для чистого ЦП соотношение Абіс/А28о составило 0,050, а для ЭПО соотношение А413/А280 составило 1,09. Объем элюции (Ve) комплекса ЦП-ЭПО был больше, чем свободный объем колонки, хотя расчетная молекулярная масса такого комплекса 210 кДа предполагала его элюцию в свободном объеме при использовании колонки с Сефакрилом S-200 HR в качестве сорбента.
Завышение Ve было характерно и при гель-фильтрации образца ЭПО. Завышение Ve для ЭПО и ее комплекса с ЦП, по всей видимости, связано с взаимодействием катионной ЭПО с сорбентом, поскольку этого эффекта удавалось избежать при проведении гель-фильтрации с 0,5 М NaCl в качестве элюента (рис. 3.9). Однако в таких условиях комплекс ЦП с ЭПО диссоциировал и белки элюировались с колонки по отдельности. Такое влияние ионной силы на взаимодействие ЦП с ЭПО согласуется с данными об элюции ЭПО 0,45 М NaCl с ЦП-Сефарозы при аффинной хроматографии и свидетельствует об электростатической природе данного взаимодействия. Взаимодействие катионных белков НФ, МПО и представителей семейства серпроцидинов, с сорбентами, применяемыми для гель-фильтрации, мы наблюдали при исследовании их комплексов с ЦП с помощью этого метода.
Калибровочный график, построенный по результатам элюции белков на колонке с Сефакрил S-200 HR в 0,15 М NaCl (пунктирная линия, кружки) и 0,5 М NaCl (сплошная линия, крестики) в 10 мМ Na-фосфатном буфере, рН 7,4: 1 - каталаза; 2 - альдолаза; 3 -ЦП; 4 - трансферрин; 5 - альбумин; 6 - овальбумин; 7 - миоглобин; 8 - комплекс ЦП с ЭПО, 9 - ЭПО.
Взаимодействие ЦП и ЭПО также подтверждалось данными диск-электрофореза в ПААГ без SDS (рис. 3.10). Электрофоретическая зона ЦП, окрашиваемая хромогенным субстратом o-DA, смещалась при добавлении ЭПО и окрашивалась на пероксидазную активность, в отличие от контрольного ЦП. Контрольная ЭПО в условиях диск-электрофореза практически не мигрировала в ПААГ. Таким образом, комплексообразование между ЦП и ЭПО было подтверждено с помощью трех независимых методов.
Полученные результаты свидетельствуют в пользу образования специфических комплексов ЦП с серпроцидинами и ЭПО, в основе взаимодействия лежат электостатические взаимодействия анионного ЦП с катионными белками лейкоцитов.
Состояние проблемы на момент исследования. Ранее нами было подробно изучено влияние ЛФ на активность ЦП [Соколов, 2007]. В частности, было показано наличие двух различных сайтов для ЛФ на молекуле ЦП: высокоаффинного (активация ферроксидазной активности ЦП за счет увеличения сродства к субстрату и скорости его окисления) и низкоаффинного (ингибирование окисления /?-PD за счет конкуренции ЛФ с субстратом за связывание с ЦП). В случае связывания ЦП с МПО мы выявили исключительно активацию -PD-оксидазной активности ЦП, связанную с увеличением аффинности ЦП к субстрату в присутствии МПО [Соколов, 2007]. Следует также отметить, что при исследовании кинетики ингибирования пероксидазной активности МПО в присутствии ЦП мы, во-первых, показали конкуренцию ЦП с субстратами пероксидазного цикла МПО - в частности, с увеличением размера субстрата эффективность ЦП как ингибитора возрастала. Во-вторых, мы показали, что эффект ЦП как ингибитора строго регулируется его протеолитической деградацией. В частности, белок, протеолизованный по связи, соединяющей 5-й и 6-й домены, практически не ингибировал ни пероксидазную, ни хлорирующую активность МПО [Соколов, 2007]. Следует отметить, что при комплексообразовании ЦП с МПО происходило изменение положения полосы Соре (максимум спектра пероксидаз в области 400-500 нм), отражающей конформационное состояние связанного с пероксидазой гема. Этот факт нашел подтверждение при исследовании структуры комплекса ЦП-МПО, в котором вход в гемовый карман МПО контактирует с петлей ЦП, соединяющей 5-й и 6-й домены белка.
Анализ белков экстракта лейкоцитов, сорбирующихся на иммобилизованном церулоплазмине
Моноциты, выделенные из периферической крови, инкубировали с ЛНП, модифицированными в различных условиях, и измеряли накопление холестерина и его эфиров в клетках. Для оценки влияния взаимодействия МПО с ЛНП на накопление внутриклеточного холестерина использовали параллельные пробы, содержащие пептид Р445-456 (EQIQDDCTGDED), разобщающий взаимодействие МПО с ЛНП. Несмотря на то, что модифицированные и интактные ЛНП не отличались по сродству к МПО (таблица 3.20), можно было предположить, что влияние Р445-456 на проатерогенные свойства ЛНП, модифицированных окислителями, будет обусловлено перехватом НОСІ с помощью остатка С, являющегося наиболее предпочтительной мишенью среди аминокислотных остатков в этом пептиде. Для проверки этой гипотезы мы выбрали другой анионный цистеин-содержащии пептид из апоВ-100: EEMLENVSLVCPKD15 (Р1-15). В условиях электрофореза Р445-456, как интактный, так и окисленный НОСІ (1:2, моль/моль), вытеснял МПО из комплекса с ЛНП. Напротив, Р1-15 не обладал способностью вытеснять МПО из комплекса с ЛНП (данные не приведены). В условиях гель-фильтрации при элюции смеси пептидов и МПО вне зависимости от окисления НОСІ Р445-456 взаимодействовал с МПО, а Р1-15 элюировался с колонки с Сефакрилом S-200 HR позже МПО (данные не приведены).
Мы сравнили зависимость поглощения холестерина и его эфиров моноцитами/макрофагами от концентрации интактных Р1-15 и Р445-456 (и предварительно модифицированных под действием НОСІ), присутствующих в среде при инкубировании ЛНП с системой МПО/Н2О2/СГ (рис. 3.51). Из графиков видно, что поглощение холестерина и его эфиров не зависит от добавления Р1-15, а пептид Р445-456 препятствует захвату холестерина дозозависимо. Окисление Р445-456 с помощью НОСІ не повлияло на его способность препятствовать МПО-зависимой проатерогенной модификации ЛНП. В дальнейшем для анализа влияния МПО, ЦП, ЦПпр и других модуляторов активности МПО на проатерогенность ЛНП в качестве контрольного образца, разобщающего взаимодействие с МПО, использовали 80 нМ пептида Р445-456.
Немодифицированные ЛНП сами по себе, а также в присутствии МПО, ЦП или ЦПпр (данные не приведены) не вызвали накопления холестерина и его эфиров. В то же время ЛНП, модифицированные НОСІ либо НОВг, приводили к достоверному накоплению холестерина и его эфиров в клетках (рис. 3.52 и 3.53).
Влияние нативных и HOCl-модифицированных пептидов Р1-15 и Р445-456 (0-80 нМ) на накопление холестерина (а) и его эфиров (б) моноцитами/макрофагами, инкубированными 12 и 72 часа с ЛНП, предварительно модифицированными системой МПО/Н2О2/СГ. Данные представлены как среднее и доверительный интервал (а = 0,05).
Однако ЛНП, модифицированные системами МПО/Н2О2/СГ или МПО/НгОг/Вг", вызывали в 4 и 7 раз большее накопление холестерина и его эфиров клетками соответственно. Разобщение взаимодействия МПО с ЛНП (модификация в присутствии Р445-456) снимало эффект накопления холестерина клетками, так что, по сравнению с ЛНП, модифицированными НОСІ и НОВг, ЛНП, модифицированные функционирующей
Влияние Р445-456 (80 нМ) на накопление холестерина моноцитами/макрофагами, инкубированными 12 и 72 часа с нативными или модифицированными ЛНП (40 нМ). ЛНП предварительно модифицировали, инкубируя их в течение 30 мин в присутствии НОСІ, НОВг, МПО/Н202/СГ, МПО/БЬОг/ВГ или MnO/H202/SCN , добавляя в ряд проб ингибиторы или модуляторы активности МПО: АВАН (5 мкМ), ЦП (6 мкМ), ЦПпр (6 мкМ), SCN" (200 мкМ). Контроль - инкубация клеток без ЛНП. Данные представлены как среднее и доверительный интервал (а = 0,05).
Тиоцианат (SGNT) является субстратом галогенирующего цикла МПО. Фермент катализирует его превращение в относительно слабый окислитель HOSCN [van Dalen et ah, 1997]. Видно, что ЛНП, модифицированные в присутствии системы МПО/НгОг/ЗОМ", не приводили к накоплению клетками ни холестерина, ни его эфиров. Конкурируя с СГ/Вг", SCN" способен изменять галогенирующую активность МПО, снижая или предотвращая выход НОО/НОВг. Действительно, ЛНП, модифицированные системами МПО/Н202/СГ(Вг ) в присутствии SCN", не вызывали накопления холестерина и его эфиров моноцитами/макрофагами. Пептид Р445-456, разобщающий взаимодействие МПО и ЛНП, практически не влиял на антиатерогенные эффекты SCN" (рис. 3.52, 3.53). Синтетический ингибитор активности МПО, АВАН, действовал аналогично SCN", а именно: ЛНП, обработанные системами МПО/Н2О2/СІ (Вг ) в присутствии АВАН, не вызывали накопления холестерина и его эфиров клетками (рис. 3.52, 3.53).
Влияние Р445-456 (80 нМ) на накопление эфиров холестерина моноцитами/макрофагами, инкубированными 12 и 72 часа с нативными или модифицированными ЛНП (40 нМ). ЛНП предварительно модифицировали, инкубируя их в течение 30 мин в присутствии НОСІ, НОВг, МПО/Н202/СГ, МПО/Н202/ВГ или MnO/H202/SCN , добавляя в ряд проб ингибиторы или модуляторы активности МПО: АВАН (5 мкМ), ЦП (6 мкМ), ЦПпр (6 мкМ), SCN" (200 мкМ). Контроль - инкубация клеток без ЛНП. Данные представлены как среднее и доверительный интервал (а = 0,05).
Добавление ЦП в концентрации 6 мкМ к ЛНП при модификации системой МПО/Н202/СГ снижало накопление внутриклеточного холестерина и его эфиров на 62 %, но не снижало уровня накопления холестерина, если ЛНП были модифицированы бромид-содержащей системой (МПО/Н202/Вг ) (рис. 3.52, 3.53). Добавление ЦПпр не повлияло на проатерогенные свойства МПО, свидетельствуя в пользу того, что снижение накопления холестерина и его эфиров в присутствии ЦП обусловлено ингибированием активности МПО.
Известно, что ЛНП, модифицированные НОСІ, стимулируют респираторный взрыв моноцитоподобных линий клеток ТНР-1 и U937, дифференцируемых в макрофаги [Nguyen-Khoa et ah, 1999]. Мы предположили возможность секреции МПО моноцитами крови человека, дифференцирующимися в макрофаги, в ответ на присутствие модифицированных ЛНП с последующим ее эндоцитозом из среды моноцитами/макрофагами в комплексе ЛНП-МПО. Для проверки этого предположения мы методом твердофазного иммуноферментного анализа измерили концентрацию МПО в среде после инкубации ЛНП с клетками. Как видно из рис. 3.54, при инкубации модифицированных ЛНП с моноцитами/макрофагами в течение первых 12 часов происходит секреция МПО во внеклеточное пространство.
Однако через 72 часа концентрация МПО вне клетки снижается практически до уровня контроля (рис. 3.54), что сопровождается накоплением холестерина и его эфиров в клетках (рис. 3.52, 3.53). Учитывая этот факт, можно предположить, что исчезновение МПО происходит вместе с захватом частиц ЛНП моноцитами/макрофагами. Более того, тот факт, что Р445-456 через 72 часа существенно препятствовал понижению уровня МПО во внеклеточной среде, позволяет заключить, что хотя бы частично исчезновение МПО из среды было связано с совместным захватом клетками ЛНП и МПО в составе комплекса ЛНП-МПО.
Следует отметить, что добавление Р445-456 к ЛНП, инкубированным с функционирующей МПО, приводило к тому, что такие ЛНП мало отличались от ЛНП, модифицированных НОСІ или НОВг, по способности стимулировать аккумуляцию холестерина или секрецию МПО моноцитами/макрофагами. Таким образом, с одной стороны, взаимодействие ЛНП с функционирующей МПО (образование комплекса ЛНП-МПО) служило дополнительным стимулом к экзоцитозу МПО из клеток. С другой стороны, через 72 часа уровень секретируемой МПО существенно снижался в случае присутствия модифицированных ЛНП, в отличие от проб с Р445-456. Таким образом, разобщение взаимодействия МПО с ЛНП препятствовало эндоцитозу МПО.
Исследование влияния SCN" и АВАН на секрецию МПО и захват модифицированных ЛНП моноцитами/макрофагами показало, что само присутствие АВАН и SCN" практически не влияло на секрецию МПО (данные не приведены). Однако добавление SCN" в среду в качестве субстрата в период модификации ЛНП системой MnO/H202/SCN или же присутствие SCN" при модификации ЛНП системами МПО/НгОг/СГ/Вг" практически не приводило к дополнительному выходу МПО (рис. 3.54) и захвату клетками холестерина и его эфиров (рис. 3.52, 3.53).