Введение к работе
Актуальность проблемы. Центральним белком системы свертывания крови является сложный мультидоменпый белок - фибриноген. Под действием тромбина фибриноген превращается в фибрин, который спонтанно полимеризуется, образуя фнбриновую сеть - основу кровяного сгустка. Самосборка фибрина, а также выполнение фибриногеном и фибрином других физиологически важных функции обеспечивается наличием специфических центров взаимодействия, которые расположены в различных донеиах молекулы. Домены имеют компактную структуру и являются относительно резистентными к ограниченному протеолизу. Поэтому протеолнтические ферменты расщепляют в первую очередь доступные междоменные пептидные связи, в результате чего образуются дискретные фрагменты. Такие фрагменты, как правило, состоят из одного или нескольких доменов, сохраняющих структурную организацию, присущую им в целой молекуле, и специфические центры взаимодействия. Так, Е и Рн-фрагменты образуются при расщеплении фибриногена и непрошигого фибрина плазмином (in vivo) и другими протеазами (in vitro) и сохраняют активные центры полимеризации, а также центры взаимодействия с другими белками. Так как эти фрагменты имеют более простую организацию',' чем родительская молекула, они представляют собой простые модели для изучения структурно-функциональных особенностей фибриногена.
За последнее десятилетие были достигнуты существенные успехи в изучении структурной организации молекулы фибриногена. Так, было показано, что фибриноген является мультидомеїшьгм белком и состоит не менее, чем из 12 доменов (Privalov & Medved', 1982). Однако, ряд вопросов оставался невыясненным. В частности, вопрос о детальной доменной организации терминальных областей Молекулы фибриногена, из которых происходит Dn-фрагиент, и границах между отдельными доменами. Этот вопрос имеет принципиальное значение, т.к. именно в этих областях сосредоточен ряд функционально важных специфических центров взаимодействия. R последнее время предпринимаются попытки экспрессиропать отдельные цепи или участки полипептидных цепей фибриногена, содержащие активные иеигры взаимодействия (Bolyard and Lord, 1988, 1989). Однако, при этом возникает закономерный вопрос: способны ли эти полипешнды формнропаті, апгономпые структуры - домены, аналогичные тпкопым r п-шшкой молекуле? Для такою рода работ необходимо знание
детальной доменной организации фибриногена. Учитывая вышеизложенное, были поставлены цели и задачи данного исследования.
Целью исследований было выяснение детальной доменной организации DH-фрагмента, моделирующего терминальные области фибриногена, и
структурно-функциональная характеристика его отдельных доменов. При этом необходимо было решить следующие задачи:
1. Исследовать процесс ограниченного протеолиза DH-фрагмента
молекулы фибриногена и выделить дискретные фрагменты его протеолиза.
2. Проанализировать N- и С-концевую аминокислотную
последовательность полипептидпых цепей Оц-фрагмента н фрагментов его
протеолиза и локализовать их по первичной структуре.
-
Проанализировать процесс денатурации различных форм D-фрагментов, определить точное количество кооперативно плавящихся доменов, входящих в состав этих'тррагмептов, и оценить границы между доменами,
-
Изучить функциональные свойства отдельных доменов молекулы фибриногена, используя в модельных исследованиях различные формы D -фрагментов.
Научная новизна'
-Обнаружено, что независимо от вида протеаз при расщеплении DH-фрагмента фибриногена образуются характерные дискретные фрагменты: Dla, Dl. DX, Dy, DZ. TSD.
-Выделен рад новых протеолитических фрагментов: Dla, Dx. Dy и Dz, образующихся при протеолизе DH-фрагмента.
-Проанализирован полипептидный состав и аминокислотные последовательности отдельных полипептидных цепей всех выделенных фрагментов. Предложена схема расщепления DH-фрагмента различными протеазами.
-Выяснена доменная структура полученных фрагментов. Показано, что образование более низкомолекулярных дискретных фрагментов происходит путе».' последовательного отщепления С-коицевых доменов от DH-фрагмента.
-На основании полученных результатов предложена детальная модель доменной организации терминальных областей молекулы фибриногена. - Экспериментально доказано, что сЬ-центр полимеризации фибрина находится в рс и/или Р-доменах, образованных С-коицевым участком р-цепи.
-Установлено, что расщепление междоменпой связи PLys393-Thr394 у различных форм D-фрагментов приводит к резкому увеличению
функциональной активности этих фрагментов за счет повышения доступности oVueinpa самосборки фибрина.
Теоретическое и практическое значение работы. Полученные результаты углубляют представления о структурной организации и о механизмах функционирования терминальных областей молекулы фибриногена. Они могут быть использованы для целенаправленной экспрессии отдельных доменов молекулы фибриногена, содержащих функционально важные центры.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на IV Симпозиуме СССР-Италия "Макромолекулы в функционирующей клетке" (Киев, 1984г.); V Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 1985г.); V Украинском биохимическом съезде (Ивано-Франковск, 1987г.); Всесоюзной конференции по спектроскопии растворов биополимеров (Харьков, 1988г.); Международных симпозиумах по фибриногену (Милуокки, 1988г., Киото, 1989г.); II Симпозиуме Американского общества белковиков (Сан-Диего, 1988г.); па конкурсах молодых исследователей в Институте биохимии АН Украины (Киев, 1988,1989гг.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 114 страницах машинописного тексті и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, изложенных в 4 главах, заключения, выводов, списка основной использованной литературы (197 источников). Работа иллюстрирована 23 рисунками и 3 таблицами.