Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 25
1.1. Современные представления о гомеостазе, стрессе и воспалении 25
1.1.1. Гомеостаз - основное свойство живой системы 25
1.1.2. Провоспалительные и стрессовые ответы как регуляторы гомеостаза. 27
1.1.2.1. Стрессовый ответ 28
1.1.2.1.1. Иммунные ответы при стрессе 31
1.1.2.1.2. Влияние кратковременного и хронического стрессов на иммунную функцию и их потенциальные последствия для состояния здоровья 33
1.1.2.2. Воспаление 36
1.2. Иммунная система как основной инструмент неспецифической защиты организма 44
1.2.1. Современное представление о неспецифическом иммунитете 46
1.2.1.1. Различия между врожденным и адаптивным иммунитетом 47
1.2.1.2. Клетки, участвующие в ответах врожденного иммунного ответа 49
1.2.2. Молекулярные механизмы рецепции неспецифического иммунитета. 53
1.2.2.1. TLR s как центральные рецепторы в запуске ответов врожденного иммунитета 54
1.2.2.1.1. Сигнальные пути рецептора TLR4 57
1.2.2.1.2. Регуляция ТЬК4-сигнализации 62
1.2.3. Сигнальные пути врожденного иммунитета 67
1.2.3.1. Сигнальные пути NF-KB 67
1.2.3.1.1. Семейство NF-KB 68
1.2.3.1.2. Сигнальные пути NF-KB И ИХ биологическая роль 68
1.2.3.1.3. Взаимодействие NF-кВ-сигнализации с другими сигнальными путями 75
1.2.3.1.4. Регуляция NF-кВ-сигнализации 76
1.2.3.2. Митоген-активированные протеинкиназы
1.2.3.2.1. Сигнальные пути МАРК 86
1.2.3.2.2. Роль МАРК в иммунных ответах 88
1.2.3.2.3. Регуляция сигнальных путей МАРК 91
1.2.4. Цитокиновая система как основной медиатор неспецифической защиты 95
1.2.4.1. Классификация цитокинов. Их функции в организме 95
1.2.4.2. Роль цитокинов в стрессе и воспалении 107
1.2.4.3. Иммунологические стратегии регуляции цитокинового дисбаланса109
1.3. Белки теплового шока и их роль в ответах врожденного иммунитета 111
1.3.1. Малые белки теплового шока 113
1.3.2. Семейство HSP 70 119
1.3.3. Белки теплового niOKaHSP90 124
1.4. Электромагнитное излучение сантиметрового диапазона как фактор, воздействующий на биологические объекты 129
1.4.1. Основные параметры электромагнитных волн 129
1.4.2. О механизмах биотропного действия слабых электромагнитных волн 135
1.4.3. Первичные мишени радиоволн в клетке
1 1.4.3.1. Мембрана, ионные каналы и мембранные белки 141
1.4.3.2. Цитоскелет 143
1.4.3.3. Мелатонин 143
1.4.3.4. Влияние ЭМИ СВЧ на сигнальные белки
1 1.4.3.4.1. Сигнальные каскады МАРК 144
1.4.3.4.2. NF-кВ-сигнализация 145
1.4.3.4.3. Сигнальные путир53 1 1.4.3.5. Стрессовые белки 147
1.4.3.6. Молекула ДНК 148
1.4.3.7. Протеосомная система 150
1.4.4. Иммуномодулирующие эффекты радиоволн 152
1.4.4.1. Иммунотропные эффекты радиоволн в исследованиях in vitro 153
1.4.4.2. In vivo эффекты 157
1.4.5. Подходы к оценке биоэффектов слабых ЭМИ 162
Глава 2. Материалы и методы 164
2.1. Лабораторные животные и клеточные линии 164
2.1.1. Лабораторные животные 164
2.1.2. Культивирование клеток макрофагальной линии RAW 264.7 в присутствии индуктора воспаления и ингибиторов 164
2.1.3. Выделение лимфоцитов селезенки 166
2.1.4. Выделение перитонеальных фагоцитов 166
2.2. Модели острого и хронического воспаления 167
2.1.1. Применение ингибиторов внутриклеточной сигнализации при воспалении у мышей 167
2.2.1. Выделение сыворотки крови 168
2.3. Условия облучения ЭМИ СВЧ 168
2.4.Получение антител к TLR4 мыши 169
2.4.1. Получение сывороток крови, содержащих антитела к TLR4 169
2.4.2. Получение растворов IgG 170
2.4.3. Тестирование антисывороток и растворов IgG к TLR4 171
2.5. Оценка биологических ответов иммунных клеток 171
2.5.1. Измерение концентрации оксида азота 171
2.5.2. Измерение продукции цитокинов 172
2.5.3. Определение концентрации стрессовых и сигнальных белков в иммунных клетках. (Ds-Na-ПААГ электрофорез и иммуноблотинг) 172
2.6. Статистический анализ 174
Глава 3. Результаты 175
3.1. Стрессовые и провоспалительные ответы иммунных клеток 176
3.1.1. Сравнительный анализ ответов иммунных клеток на стресс и эндотоксин 176
3.1.2. Зависимость ответов иммунных клеток на воздействие ЭМИ СВЧ от типа и функционального состояния клетки 182
3.2. Ингибиторный анализ: роль стрессовых и сигнальных белков в реализации защитных ответов иммунных клеток при стрессе и воспалении 188
3.2.1. Участие TLR2 и TLR4 в ответах иммунных клеток на стресс и воспаление 188
3.2.2. Роль сигнального пути NF-кВ В формировании стрессовых и воспалительных ответов иммунных клеток 194
3.2.3. Роль стресс-индуцибельных протеинкиназ JNK и р38 в защитных ответах клетки при стрессе и действии эндотоксина 198
3.2.4. Роль белка теплового шока 90 в поддержании гомеостаза иммунных клеток при стрессе 202
3.3. Состояние защитных систем организма млекопитающих при стрессе или воспалении. Способы регуляции их активности 210
3.3.1. Провоспалительные ответы при остром и хроническом воспалении у мышей 211
3.4. Исследование регуляции провоспалительных ответов у мышей при остром воспалении, индуцированном эндотоксином 222
3.4.1. Антитела к TLR4 снижают чувствительность мышей к ЛПС при остром и хроническом воспалении 222
3.4.2. Исследование противовоспалительных свойств ингибитора HSP90 -гелданамицина 2 3.4.2.1. Ингибирование Hsp90 предотвращает активацию экспрессии рецептора TLR4 в условиях токсического стресса 230
3.4.2.2. Гелданамицин снижает активацию сигнального пути NF-KB, вызванную эндотоксином 231
3.4.2.3. Блокирование активности Hsp90 снижает активацию сигнального пути SAPK/JNK в спленоцитах мышей при токсическом стрессе 232
3.4.2.4. Ингибирование активности Hsp90 снижает общую интоксикацию организма при токсическом стрессе, вызванном ЛПС 2 3.4.3. Регуляция провоспалительных ответов у мышей с использованием ингибитора сигнального nyTnNF-кВ 236
3.4.4. ЭМИ СВЧ модифицирует провоспалительные ответы в клетках мышей 239
Заключение 246
Выводы 249
Список литературы
- Влияние кратковременного и хронического стрессов на иммунную функцию и их потенциальные последствия для состояния здоровья
- Электромагнитное излучение сантиметрового диапазона как фактор, воздействующий на биологические объекты
- Применение ингибиторов внутриклеточной сигнализации при воспалении у мышей
- Исследование противовоспалительных свойств ингибитора HSP90 -гелданамицина
Влияние кратковременного и хронического стрессов на иммунную функцию и их потенциальные последствия для состояния здоровья
Этой схемой могут быть описаны и уникальные иммунные ответы организма, активирующиеся при нарушении гомеостаза, будь то изолированная клетка или целый организм, например, при стрессовых и воспалительных реакциях.
Если под действием стрессоров, повреждений или инфекционных агентов происходит нарушение клеточного гомеостаза, система вовлекается в стрессовый ответ для возвращения организма в состояние гомеостаза (Goldstein and Kopin, 2007). Величину отклонений от нормы определяют специализированные сенсоры. На уровне организма сенсорами являются иммунные клетки, эндокринные клетки и сенсорные нейроны, на тканевом уровне - макрофаги, в клеточном гомеостазе сенсорами являются сигнальные белки, которые детектируют нарушения ключевых процессов, таких как фолдинг белков, уровень АФК и доступность питательных веществ. Первой и наиболее мощной линией защиты является врожденный иммунитет, распознающий внешние или внутренние нарушения при помощи инвариантных и плейотропных паттерн-распознающих рецепторов (РАМР) (Kawai & Akira, 2009), принимающих участие в защите организма при огромном разнообразии внешних сигналов (Bern, 2012). Важнейшим среди РАМР является семейство толл-подобных рецепторов (TLR s), которые играют центральную роль в индукции ответов врожденного иммунитета и развития адаптивных иммунных ответов (Blasius & Beutler, 2010; Kawai & Akira, 2010). Сенсоры, распознав источник стресса или воспаления, запускают сложные механизмы адаптации, связанные с активацией ключевых сигнальных путей неспецифической защиты с участием ядерного фактора кВ (NF-кВ), митоген-активируемых протеинкиназ (МАРК), в частности, стресс-активируемых протеинкиназ/киназ N-конца c-Jun (SAPK/JNK) и р38; а также белков теплового шока (HSPs). Это приводит к усиленному синтезу и секреции медиаторов (цитокины, монокины, биоактивные пептиды, простагландины, компоненты системы комплемента, микросомальные ферменты и др). Медиаторы, в свою очередь, воздействуют на эффекторы - клетки или ткани, чувствительные к их действию. В результате эффекторных ответов может произойти восстановление нормального состояния пораженной клетки или ткани и подавление воспалительных реакций либо гибель клетки. При этом не исключена возможность гибели клеток или клеточных систем при истощении защитного потенциала.
За последнее десятилетие появилось множество работ, посвященных исследованию воспалительных процессов. Анализ результатов этих исследований показывает, что большинство патологий в той или иной степени связаны с развитием воспалительного процесса. Воспаление рассматривается как неспецифическая реакция организма на экстремальные стимулы, будь то инфекционное заражение, повреждение тканей или стресс, оно традиционно ассоциируется с развитием защитных ответов. Однако иммунным клеткам и тканям приходится расплачиваться тем, что какая-то другая свойственная им функция ослабляется или выключается, что приводит к иммунодепрессии вплоть до иммунного паралича (Chovatiya R., Medzhitov R., 2014). Поэтому проблема исследования молекулярных механизмов регуляции гомеостаза при воспалении и стрессах чрезвычайно актуальна. На сегодняшний день известно, что сенсором грамотрицательных бактерий является рецептор TLR4, который избирательно реагирует на грамотрицательные бактериальные липополисахариды (ЛПС) или липоолигосахариды (Poltorak и др., 1998; Beutler и др., 2001). Кроме того, TLR4 в составе рецепторного комплекса распознают широкий спектр веществ, входящих в состав вирусов и микоплазм, а также активируется при эндогенных сигналах опасности, появляющихся в результате стресса, повреждения или инфицирования организма (Calabrese и др., 2015). В последующий ответ клетки вовлечен целый спектр различных адапторных молекул, способных активировать множество нисходящих киназ и транскрипционных факторов, запускающих эффекторные ответы как в виде воспалительных, так и противовоспалительных реакций. В настоящее время детально описаны сигнальные пути TLR4, вызывающие активацию транскрипционных факторов NF-кВ, FoxOl, АР-1, CREB и IRF (Morris и др., 2015), а также естественные ингибиторы, способные блокировать эти сигнальные пути на межклеточном, мембранном и цитоплазматическом уровнях. Тем не менее, если хронические воспаления, индуцированные компонентами грамположительных бактерий, успешно лечатся антибиотиками, то самая тяжелая и плохо поддающаяся лечению форма сепсиса вызывается токсинами грамотрицательных бактерий.
Электромагнитное излучение сантиметрового диапазона как фактор, воздействующий на биологические объекты
Живые организмы обладают различными механизмами защиты от неблагоприятных и патогенных условий окружающей среды, и это свойство организма называется иммунитетом. Согласно краткой медицинской энциклопедии, иммунитет (лат. immunitas — освобождение, избавление от чего-либо) — это невосприимчивость, сопротивляемость организма к инфекциям и инвазиям чужеродных организмов (в том числе — патогенных микроорганизмов), а также воздействию чужеродных веществ, обладающих антигенными свойствами. Иммунные реакции возникают и на собственные клетки организма, измененные в антигенном отношении (Краткая медицинская энциклопедия, 1989). «Под невосприимчивостью к заразным болезням, — писал один из основателей учения об иммунитете Илья Мечников, - нужно понимать общую систему явления, благодаря которым организм сможет выдержать нападения болезнетворных микробов» (Мечников, 2012). Исторически сложилось так, что иммунитет разделяют на приобретенный (специфический, адаптивный) и врождённый (неспецифический). Традиционно считается, что врожденный иммунитет присущ всем многоклеточным, а адаптивный - только позвоночным.
Под неспецифическим, или врожденным, иммунитетом подразумевают систему защитных факторов организма, присущих данному виду как наследственно обусловленное свойство. Этот иммунитет создается анатомическими, физиологическими, клеточными и молекулярными факторами, которые являются естественными составляющими элементами организма. Такие факторы защищают организм от разных экзогенных и эндогенных агрессий, они передаются генетически, их защитные функции лишены избирательности и они не способны сохранять память от первичного контакта с чужеродностью (Галактионов, 2005, Хаитов и др., 2000). Приобретённый, или адаптивный, иммунитет — способность организма обезвреживать чужеродные и потенциально опасные микроорганизмы (или молекулы токсинов), которые уже попадали в организм ранее. Это - результат работы системы высокоспециализированных клеток (лимфоцитов), расположенных по всему организму (Ройт и соавт., 2000). Адаптивный иммунитет отличается высокой степенью специфичности и формированием иммунологической памяти - способности более эффективно противостоять повторной инфекции. Приобретённый иммунитет разделяют на клеточный (Т-лимфоциты) и гуморальный (антитела, продуцируемые В-лимфоцитами; комплемент является компонентом как врождённого, так и приобретённого иммунитета).
В течение последнего века произошла существенная трансформация понятий и представлений о роли адаптивного и врожденного иммунитета в защите организма. Развитие биологической и медицинской науки в XX в. пошло по такому пути, что в центре внимания постепенно оказались механизмы именно адаптивного (приобретённого) иммунитета. Большое число исследований было посвящено изучению В-лимфоцитов, продуцирующих антитела, а открытие Т-лимфоцитов и их роли в механизмах иммунной защиты окончательно склонило чашу весов в сторону преимущественного значения, а значит, и изучения адаптивного иммунитета. В действительности, приобретённый иммунитет имеется только у очень небольшой доли всех живых организмов (1.5-2%), но поскольку к этой группе принадлежит человек, то адаптивные защитные механизмы стали главным предметом исследований как иммунологов, так и биологов (Недоспасов, 2013)
Революционное переосмысление места врождённого иммунитета в системе защиты живых организмов произошло в конце XX века главным образом благодаря работам американского иммунолога Чарльза Джейнуэя и его последователей, среди которых самую яркую роль сыграл и играет наш соотечественник Руслан Меджитов (Недоспасов, 2013; Smith JA, 2014). Несмотря на то, что этих имен мы никогда не увидим в числе лауреатов Нобелевской премии 2011 года, именно этими учеными наряду со Стейнманом, Хоффманом и Бойтлером фактически было доказано, что в защите от инфекций или биологической агрессии ведущую роль играет иммунитет врождённый, который руководит запуском адаптивного и его последующей работой.
В настоящее время известно, что система врожденного иммунитета обладает очень мощными защитными механизмами и способна ограничивать повреждения пораженных тканей. Тем не менее, факторы неспецифического иммунитета не могут быть объеденены в физиологическую систему в ее классическом представлении (Литвицкий и Синельникова, 2009). Неспецифическая иммунная защита начинает работать уже при первых контактах организма с потенциальным агрессором. В этом случае защита осуществляется с участием механических (кожа), физиологических (повышенная температура тела) и химических (рН) барьеров. В реализации защитной функции участвуют также системы антагонизма микроорганизмов (нормальная микрофлора слизистых) и киннинговая система, способствующая привлечению фагоцитирующих клеток в очаг воспаления (Фрейдлин, 1997; Абелев, 1998). Активация и действие факторов врожденного иммунитета в большинстве случаев достаточна для предотвращения воздействия или его инактивации. Врожденный иммунитет создает мощную защиту организма хозяина от угрожающих чужеродных агентов, к которым относят паразитарные, грибковые, вирусные и бактериальные инфекции. Именно врожденный иммунитет приводит к активации адаптивного, специфического иммунитета.
Иммунитет в целом и каждая из его систем в отдельности решают две задачи: распознавание чужеродных клеток или веществ, попавших в организм, и их обезвреживание или удаление из организма. Эти задачи по-разному решаются врожденным и приобретенным иммунитетом, но особенно эффективно действует иммунная защита при взаимодействии этих двух составляющих (Абелев, 1998). В настоящее время имеются четкие представления о различиях между врожденным и приобретенным иммунитетом (табл. 2). Согласно теории Джейнуэя (Janeway, 1989), между врождённым и приобретённым иммунитетом имеется ряд фундаментальных различий:
Разные стратегии распознавания. Врождённое иммунное распознавание, которым обладают как животные, так и растения, полностью основано на неклональных рецепторах (сенсорах). Количество таких рецепторов и генов - от 10 до 100. Рецепторы, участвующие во врождённом иммунном распознавании, отбирались в эволюции так, чтобы оказаться специфичными к микробным мишеням ("паттернам", по определению Джейнуэя), являющимся инвариантными и консервативными для целого класса микробов. Наиболее естественными мишенями для распознавания являются компоненты клеточных стенок патогенов - именно они сходны или даже идентичны у целых классов микроорганизмов. Например, инвариантный компонент клеточной стенки грамотрицательных бактерий -это инвариантная часть липополисахарида (ЛПС) Lipid А. Соответственно, продукт одного гена, один рецептор, действующий вместе с дополнительным адаптерным белком, способен распознать химическое "микробное чужое", характерное для всех грамотрицательных бактерий.
Применение ингибиторов внутриклеточной сигнализации при воспалении у мышей
Влияние липополисахарида (панель А) и ЭМИ СВЧ (панель Б) на продукцию и активацию стрессовых и сигнальных белков в клетках макрофагальной линии RAW 264.7. Результаты Вестерн-блота с использованием специфических антител к TLR4, HSP72, HSP90 и фосфорилированным формам участников сигнальных путей NF-кВ (IKK, NF-кВ) и МАРК (ЖК и р38). Числовые значения - результат денситометрического измерения количества белка (в % от контроля). Условные обозначения: К - контроль, интактные клетки; ЛПС - клетки, культивированные в присутствии ЛПС, ЭМИ СВЧ - облученные клетки. -достоверные отличия от контроля (р 0.05), - достоверные отличия от контроля (р 0. 1), п =6.
Результаты настоящей работы показали, что белок-рецептор TLR4, участвующий в специфическом связывании эндотоксина из грамотрицательных бактерий, показывает усиленную экспрессию в ответ на внешние сигналы другой природы, в частности на действие неионизирующего низкоинтенсивного ЭМИ СВЧ (Рис. 24.Б). Более того, воздействие на клетки ЭМИ СВЧ приводило к активации классических сигнальных путей неспецифического защитного ответа клетки -митогенактивированных протеинкиназ JNK и р38, а также ключевого каскада NF-кВ. Интересно, что запуск сигнального пути NF-кВ происходил не по классическому сценарию - при облучении ЭМИ СВЧ в иммунных клетках происходило накопление фосфорилированной (активированной) формы этого транскрипционного фактора, но при этом не наблюдали активации участника главного киназного комплекса канонического пути NF-кВ-сигнализации - IKK. СВЧ по-разному влияли на экспрессию индуцибельных белков теплового шока разных семейств HSP: увеличивалась экспрессия HSP70, снижался уровень синтеза HSP25 и отсутствовало влияние на продукцию HSP90 (Рис. 24. Б).
Более того, на нативных клетках животных было показано изменение внутриклеточной локализации этих белков: в Табл. 3.1. показаны результаты оценки количества стресс-индуцибельных форм двух белков (HSP72 и HSP25) во внутриклеточных органеллах лимфоцитов селезенки.
В результате изменения внутриклеточной локализации этих белков после облучения клеток стресс-индуцибельный белок HSP72 преимущественно локализовался в мембране, а его содержание в цитоскелете и, особенно, в цитозоле резко снижалось. Количество малого белка HSP25 также достоверно возрастало в мембранах, хотя и в меньшей степени, чем HSP72, а в цитоскелете малый белок теплового шока оставался лишь в следовой концентрации.
Интересно, что при одновременном воздействии на клетки RAW 264.7 сверхслабых электромагнитных излучений и эндотоксина наблюдались аддитивные эффекты, что выражалось в усилении синтеза провоспалительных цитокинов IFN-y, TNF-a и IL-6 (Рис. 25). Полученные результаты указывают на возможность совпадения, хотя бы частичного, механизмов активации иммунной клетки после воздействия сигналов разной природы.
Влияние облучения ЭМИ СВЧ и последующего добавления липополисахарида на продукцию цитокинов в клетках макрофагальной линии RAW 264.7. Результаты ИФА с использованием специфических антител к TNF-oc, IFN-y, IL-1, IL-6. Условные обозначения: К - контроль, интактные клетки; ЭМИ - клетки, облученные ЭМИ СВЧ(8.15-18 ГГц, 1 мкВт/см2, 1 час), ЛИС - клетки, культивированные в присутствии ЛИС; ЭМИ+ЛПС - клетки, облученные ЭМИ СВЧ за 1 час до добавления ЛИС. -достоверные отличия от контроля (р 0.05). - достоверные отличия от контроля (р 0.01), + - достоверные отличия от группы «ЛИС» (р 0.05); ++ -достоверные отличия от группы «ЛИС» (р 0.01), п=6.
Таким образом, и при стрессе, вызванном воздействием низкоинтенсивного ЭМИ СВЧ, и при воспалении, индуцированным ЛИС, в макрофагах происходит активация неспецифической защиты с участием сигнальных путей врожденного иммунитета - TLR4, NF-кВ И митоген-активированных протеинкиназ. Общее состояние внутриклеточной сигнализации и цитокинового профиля иммунных клеток после воздействия ЛПС указывает на стимуляцию классических противовоспалительных реакций. Учитывая активацию стресс-индуцибельных сигнальных белков и увеличение концентрации классических медиаторов стресса в облученных иммунных клетках, можно с уверенностью говорить о стрессовом механизме действия свехслабых электромагнитных излучениях сантиметрового диапазона.
Зависимость ответов иммунных клеток на воздействие ЭМИ СВЧ от типа и функционального состояния клетки.
В работе были использованы как изолированные перитонеальные макрофаги и лимфоциты селезенки (спленоциты), так и клетки макрофагальной линии RAW 264.7. Эти клетки изначально обладали разным физиологическим статусом: изолированные иммунные клетки, в отличие от макрофагов линии RAW 264.7, были стрессированы в результате манипуляций по их выделению из перитонеального экссудата. Данные о состоянии внутриклеточной сигнализации и продукции цитокинов и оксида азота в макрофагах клеточной линии RAW 264.8 или изолированных иммунных клетках после воздействия ЭМИ СВЧ представлены на рисунках 26 и 27, соответственно. Как видно из рисунков, облучение клеток оказывало стимулирующее действие на макрофаги. Так, ЭМИ СВЧ вызывало увеличение продукции TLR4, активности каскадов NF-кВ И SAPK/JNK, продукции HSP70, но не HSP90a (рис. 26), а обнаруженная активация внутриклеточной сигнализации приводила к усилению продукции TNF-a и IL-1 и в изолированных макрофагах животных, и в клетках макрофагальной линии RAW 264.7 (рис. 27).
Исследование противовоспалительных свойств ингибитора HSP90 -гелданамицина
Напротив, использование ЭМИ СВЧ в качестве профилактического средства повышало резистентность организма при развитии острого эндотоксического воспаления, способствуя нормализации содержания иммунных клеток (рис 47А), снижению синтеза провоспалительных цитокинов иммунными клетками и уменьшению их содержания в сыворотке крови (Рис. 47В). На этом фоне благоприятным фактором представляется существенное усиление в макрофагах облученных мышей синтеза оксида азота, который, как известно, способен предотвращать ЛПС-индуцированный апоптоз и обладает прямой антибактериальной активностью (данные не показаны). Вероятно, эти эффекты связаны со способностью ЭМИ СВЧ стимулировать экспрессию индуцибельных белков теплового шока, обладающих противовоспалительным действием (Рис. 47Б).
Исходя из вышеизложенного, можно заключить, что HSP90 обеспечивает адекватную защиту иммунокомпетентных клеток от влияния ЭМИ СВЧ и тем самым обеспечивает проявление иммуностимулирующего, а не повреждающего действия этого вида излучения. Несмотря на кажущуюся безопасность сверхслабых ЭМИ сантиметрового диапазона, их воздействие на изолированные иммунокомпетентные клетки со сниженной активностью защитных белков из семейства HSP90 может спровоцировать патологические нарушения функционирования клетки.
Таким образом, несмотря на отсутствие лечебного эффекта ЭМИ СВЧ при остром воспалении, вызванном грамотрицательными бактериями, применение сантиметровых волн в качестве профилактического средства при риске бактериального заражения может явиться перспективным направлением современной медицины.
В работе были изучены и описаны механизмы развития неспецифических защитных ответов на стресс, вызванный низкоинтенсивными электромагнитными излучениями, и на воспаление, индуцированное бактериальным эндотоксином - как на уровне иммунных клеток, так и на уровне организма мышей. Настоящим исследованием было доказано, что ответы иммунных клеток на низкоинтенсивное электромагнитное излучение сантиметрового диапазона можно отнести к стрессовым реакциям клетки, что подтверждалось активацией стресс-индуцибельных сигнальных путей внутриклеточной сигнализации и накоплением классических маркеров стресса в облученных клетках. В работе получены новые сведения об участии стрессовых и сигнальных белков в регуляции стрессовых и провоспалительных ответов в иммунных клетках мышей.
Было доказано, что и воспалительные, и стрессовые ответы, независимо от природы вызывающего их сигнала, развиваются как адаптивная реакция, направленная на восстановление гомеостаза. Там не менее, были выявлены особенности неспецифических защитных ответов на низкоинтенсивное излучение и ЛПС грам отрицательных бактерий (Рис. 48). Во-первых, были обнаружены отличия на уровне сенсоров стресса и воспаления. Во-вторых, показаны различия на уровне активации неспецифических сигнальных путей при стрессе и воспалении и обнаружена альтернативная стимуляция сигнального каскада NF-кВ при ответах иммунных клеток на ЭМИ СВЧ. В-третьих, эффекторным ответом иммунной клетки и организма в целом на слабое излучение являлась адаптация, усиление иммуногенности и противовирусной устойчивости, в то время как иммунный дисбаланс, соответствующий иммунодепрессии, наблюдался в течение длительного времени после контакта иммунных клеток или организма мышей с бактериальным токсином. Использование ингибиторного анализа выявило наличие компенсаторной активации альтернативной неспецифической сигнализации в условиях блокирования каждого из ключевых сигнальных путей защитного ответа иммунных клеток на ЭМИ СВЧ.
Полученные экспериментальные доказательства роли ключевых рецепторных, сигнальных и стрессовых белков (TLR4 и TLR2, IKK;s, р38, СКП, SAPK/JNK, HSP90) в патогенезе воспалительных ответов иммунных клеток позволили разработать новые стратегии коррекции иммунопатологии при системном воспалении у мышей. В ходе дальнейших исследований было показано, во-первых, что применение антителотерапии с использованием поликлональных антител к рецептору TLR4 способствует снижению развития провоспалительных реакций у мышей как при остром, так и при хроническом воспалении. Во-вторых, было установлено, что фармакологическое ингибирование сигнального пути NF-кВ также является перспективным направлением коррекции иммунного дисбаланса при остром воспалении у мышей. В-третьих, были получены доказательства, позволившие рассматривать белок теплового шока HSP90a как возможную терапевтическую мишень при острых токсических стрессах, индуцированных эндотоксином. Кроме того, в настоящей работе продемонстрированы молекулярные механизмы защитного действия ЭМИ СВЧ при развитии острого воспаления у мышей, что позволяет рекомендовать применение сантиметровых волн в качестве профилактического средства при риске бактериального заражения.
Резюмируя все вышеизложенное, можно утверждать, что настоящая работа вносит существенный вклад в современное понимание механизмов протекания стрессовых и воспалительных ответов в иммунных клетках и функционирования системы врожденного иммунного ответа в целом.