Введение к работе
Актуальность темы. Ряд пептидных гормонов и нейропептидоз гипофиза, таких как АКТГ, альфа-, бета- и гамма МСГ, бета-липотропин (ЛПГ) и р-эндорфин происходят из общего белка-предшественника, называемого проопиомеланокортином (ПОМК). Под контролем пептидных гормонов-производных ПОМК, находятся процессы нормального развития, поведения, памяти, эмоционального и физиологического ответа на стресс (Smith A.I. and Funder J.W. 1988, Мертвецов Н.П. 1990). Известно, что огогоидные пептиды, и в особенности продукт процессинга ПОМК - р-эндорфин, входят в число факторов, стимулирующих синтез препролактина - предшественника другого, не менее важного полифункционального гормона гипофиза - пролактина (Tong Y. and Pelletier G 1992). Большинство биологических эффектов пролактина связано с репродуктивной функцией (M.Wallis и соавт. 1985). Знание первичной структуры и особенностей организации мРНК, кодирующих ПОМК и пролактин, является принципиальным шагом, открывающим путь к выяснению регуляторних механизмов их экспрессии, механизмов их действия, возможности их микробиологического синтеза для нужд медицины. Сравнительный анализ выведенных из мРНК последовательностей белков дает представление о функциональной значимости отдельных районов гормонов.
Пели н задачи. Целью настоящей работы являлось исследование структурно - функциональной организации гипофизарных матричных РНК, кодирующих проопиомеланокортин и пролактин, на примере мРНК ПОМК человека, быка, норки и мРНК пролактина человека и норки и их сравнительный анализ с другими видами млекопитающих. Для выполнения этой цели было необходимо решить следующие задачи: 1) клонировать кДНК ПОМК из гипофиза человека, быка и норки и кДНК пролактина из гипофиза человека и норки; 2) определить нуклеотидную последовательность клонированных кДНК ПОМК и пролактина; 3) провести сравнительный анализ полученных последовательностей кДНК и кодируемых ими прегормонов с известными для других млекопитающих и выявить закономерности и особенности их структурно - функциональной организации.
Научная новизна работы: Впервые определена нуклсотидная последовательность кДНК ПОМК из гипофиза человека. Впервые определена нуклеотидная последовательность кДНК ПОМК из гипофиза норки. На основании сравнительного анализа первичных и вторичных структур ДНК, кодирующих ПОМК человека и других млекопитающих, предложен механизм возникновения мутаций и вариабельных районов в ДНК генов ПОМК. Впервые ген проопиоме-ланокортина локализован на 11 хромосоме норки и показана его уникальность. Впервые определена нуклеотидная последовательность кДНК пролактина норки.
Научно - практическая значимость работы: На основе ДНК полученной в настоящей работе рекомбинантиой плазмиды pHPRL24, несущей вставку кДНК пролактина человека с определенной нами нуклеотидной последовательностью, с добавлением химически синтезированного
участка нуклеотидной последовательности, кодирующего 16 недостающих N-концевых аминокислотных остатков, сотрудниками НИБХ СО РАН Морозовой Т.В. и Муравлевым А.И. был сконструирован генно - инженерный продуцент пролактина человека , необходимого в медицинской практике (Морозова Т.В. и сотр., 1993). На основе ДНК полученной в настоящей работе рекомбинантной плаэмиды pBPOMCS, несущей вставку кДНК ПОМК быка с определенной нами нуклеотидной последовательностью, Беклемишевым А.Б., Головиным С.Я. и сотрудниками (НИКТИ БАВ "НПО" ВЕКТОР) сконструирован генно инженерный продуцент бета-липотропного гормона быка и разработана схема трипсинового высвобождения из генно-инженерного белка биологически активного опиоидного пептида - р- эндорфина, необходимого в медицинской практике (Беклемишев А.Б. и сотр., 1988). Рекомбинантные плазмиды, полученные в настоящей работе, представляют существенный интерес как специфические молекулярные зонды для определения содержания мРНК ПОМК или пролактина в различных тканях организма человека, быка, норки при исследованиях механизмов гормональной регуляции экспрессии соответствующих генов и как материал для конструирования генно-инженерных продуцентов важнейших пептидных гормонов человека, быка и норки для биомедицинских исследований или нужд практической медицины. Проведенный сравнительный анализ всех известных аминокислотных последовательностей как биоактивных доменов ПОМК, так и пролактина разных видов млекопитающих, дает представление о функциональной значимости тех или иных групп аминокислотных остатков белков и открывает возможность легально исследовать влияние конкретных участков этих важных гормонов гипофиза на их функциональную активность.
Публикации и апробапия работы. По материалам диссертации опубликовано 10 статей, из них З в зарубежных изданиях. Результаты работы были представлены: в виде стендового доклада на 10-м двустороннем Советско-французском симпозиуме "Физико-химические основы жизни" (Киев, 4-8 июня 1990 г.); в виде доклада на 7-м международном конгрессе по изоферментам (Новосибирск, 7-12 сентября 1992 г.).
Структура н объем работы. Диссертация изложена на 170 страницах, включающих 33 рисунка, 9 таблиц и 143 ссылки списка литературы. Диссертационная работа состоит из введения, трех частей и выводов. Часть I - обзор литературы по теме: "Структурно- функциональная организация генов и мРНК, кодирующих важнейшие гормоны гипофиза - ПОМК и пролактин, у человека и других млекопитающих". Часть II - экспериментальная, содержит описание материалов и методов, использованных в работе. Часть III - результаты и обсуждение, содержит изложение основных результатов работы, их обсуждение и анализ.