Сравнительные исследования панкреатических сериновых протеиназ гидробионтов тихого океана Пивненко, Татьяна Николаевна

Введение к работе

Актуальность проблемы. Исследование ферментов как биологических катализаторов представляет собой одно из наиболее перспективных направлений современной биохимии. Теоретические аспекты взаимосвязи структуры и механизма действия ферментов, а также направления их практического применения исследуются и разрабатываются на протяжении многих лет. Однако, эта проблема не теряет своей актуальности, так как для развития современных технологических процессов необходимо упростить и удешевить многоступенчатую и высокозатратную процедуру выделения ферментных препаратов, а для совершенствования способов применения определить тонкие механизмы действия биокатализаторов, находить пути регулирования процессов in vivo я in vitro, масштабировать их.

В этом смысле протеолитические ферменты представляют собой весьма обширный и благодатный материал, область применения которого распространяется от кожевенной н текстильной до пищевой промышленности, а в медицине - от микробиологии до онкологии. Протеиназы включены в реализацию многих клеточных функций: биогенез структур, фагоцитоз, деление, движение, гуморальная, нейро- и имму-норегуляция. В таких процессах как свертывание крови, активация системы комплимента, переваривание пищи протеолиз служит не только для запуска, но и для реализации всего процесса. Это определяет неограниченные возможности применения протеіиаз п качестве лекарственных средств.

Одним из богатейших источников для выделения протеолитических ферментов являются внутренние органы морских организмов. Перспективы их изучения и использования определяются обширной сырьевой базой за счет утилизации отходов рыбного промысла и неординарными свойствами биокатализаторов из морских организмов. Поиск и идентификация новых ферментов, обладающих необычными свойствами, весьма актуальны для биохимии, так как позволяют выявить новые принципы и механизмы каталитического действия. Одним из таких необычных свойств ферментов гидробионтов, ранее неизвестным для сериновых протеиназ, оказалась их способность гидролизовать нативный коллаген.

Сокращения: АКК - Е-аминокапроновая кислота, АТЭЭ - этиловый эфир ацетил-1-тирозина, БТМЭ -метиловый эфир Noi-бензоил-І-тирозина, БЗ - бегооил, БАМЭ - метиловый эфир Na-бснзоил-І-арпшина, БАпНА - пара-нитроанилид Na-беюоил-І-зргинина, БЛейМЭ - метиловый эфир Na-бегооил-]-лейцина, ГАУ- rereposyxcHH,, ГФпНА - гарэ-гоггроанипид гауіврил-1-фенилаланина, ГКЩА - 1,6-гексаметилендиамин, ДМСФ - диметилсульфонилфторид, ДСІІ- додецилсульфат натрия, ДФФ -диизопропилфторфосфат, ДЦКД - двдихдогексилкарбодиимид, ПААГ - полиакриламидный геяь, ТАМЭ - метиловый эфир N-тозил-І-зргиюша, ТЛМЭ - метиловый эфир N-тозия-І-лизина, СТИ -соевый трипсиновый ингибитор (ІСунитца), ТЛХМК - хяорметилхетон N-токи-І-иямпн, ТФХМК -хлормгтилкетон N-тозил-І-фенилшіашїка, ЭДТА - этияекдкгишнгетраацетет

Первоначально тяжке ферменты были обнаружены у ракообразных, паразитических насекомых и гельминтов, что связывалось с приспособлением к условиям обитания и пищевым потребностям (Grant, Risen, 1980, Bowles at el., 1988). В дальнейшем эти коллагеиолктичеекмг ферменты были идентифицированы как трипсины и химо-трипсикы (Сахаров, 1992, Руденсквя и др., 1996). Однако оставались не выясненными дьа основных момента. Во-первых, факторы, определяющие проявление указанных свойств (эволюционные или адаптационные) и, во-вторых, механизм коллагенолиза в присутствии сериновых Гфотсиназ. Ферментативная деструкция коллагена, как известно, является весьма сложным процессом, осуществляется узкоспецифичными металлозавіїсимьши протеиназами и имеет многофакторную систему регуляции (Соловьева, 1994). Нарушения этих процессов вызывают ряд патологических изменений всего организма. Изучение коллагенолиза в различных условиях, в том числе под действием сериновых протеиназ, поможет уточнить детали его протекания и экзогенной регуляции, а также значительно расширить сферу применения вновь предлагаемых ферментных препаратов.

Сравнительное изучение свойств протеиназ различного происхождения позволит установить взаимосвязи мевду различиями в строении молекул и осуществлении ими каталитических функций, а также дать рекомендации по их практическому применению.

Цып» и эадэчм кделсдованяя. Цалыо настоящей работы явилось сравнительное исследованиг сериновых протеиназ гидробяоытоа Тихого океана, включая, во-первых, установление закономерностей распределения ферментов в панкреатической ткани животных различных таксономических групп согласно тканевой активности и физн-ко-химичесюш свойствам, во-вторых, определение основных каталитических свойств и субстратно-ингябнгорной специфичности, в-тргтьих, разработка эффективных методов выделения и стабилизации ферментов, и, в-четвертых, использование полученных результатов для создания наиболее рациональных способов применения ферментов.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

исследовать состав панкреатических сериновых протеиназ гидробионтов, включая активности по различным субстратам, состав и заряд изоформ, молекулярную массу,

определить перспективные объекты для получения ферментных препаратов,

определить оптимальные условия выделения ферментов, разработать методы получения выеожсочнщенных комплексных препаратов,

изучить взаимодействие ферментов с растворимыми и иммобилизованными лиган-дами, синтезировать эффективные аффинные сорбенты, получить гомогенные препараты трипсина и химотрипсина,

- сравнить субстратно-ингибиторную специфичность ферментов различного проис
хождения и установить роль отдельных ферментов в процессе гидролиза коллагена,

определить эффективные способы стабилизации ферментов и разработать методы получения препаратов пролонгированного действия,

- разработать способы применения ферментных препаратов с учетом их субстратной
специфичности и физико-химических свойств.

Научная новизна работы.

1. Впервые проведен сравнительный анализ широкого спектра свойств панкреатических сериновых протеиназ гндробионтов различных таксономических групп.

2. Выявлены общие закономерности, связывающие свойства ферментов, строение пищеварительной системы и таксономическое распределение видов.

3. Установлены основные различіїя в осуществлении каталитических функций ферментами анионного и катионного зарядов. Уточнены особенности субстратной и ингибиторной специфичностей.

4. Предложен двухстадийгшй механизм гидролиза фибриллярного коллагена в присутствии экзогенных сериновых протеиназ.

5. Исследовано взаимодействие панкреатических сериновых протеиназ с растворимыми и иммобилизованными лигандами и выдвинуты предположения о структурных различиях в составе активных центров, синтезированы аффинные сорбенты, соответствующие специфичности протеиназ.

6. Разработаны и обоснованы методы очистки, стабилизации, регуляции активности и использования протеолнтических ферментов гидробионтов.

ЇІряіспгческяя значимость.

1. Выполненные исследования послужили основанием для выбора наиболее пер
спективных объектов для выделения ферментов.

2. Разработан универсальный метод получения высокоочищенных комплексных препаратов сериновых протеиназ с использованием ступенчатой ультрафильтрации, применимый ко всем источникам сырья, включая беспозвоночных, рыб, морских л наземных млекопитающих.

3. Предложены высокоспецифичные аффинные сорбенты на основе доступных компонентов для выделения анионных форм трипсина и химотрипсина. Оптимизированы условия проведения хроматографии.

4. Разработаны методы иммобилизации ферментов и получения термостабнльных и кислоторезистентных препаратов.

5. Разработаны способы применения сериновых протенназ гидробионтов в микробиологической, пищевой и рыбной промышленности, сельском хозяйстве, медицине.

Основные положении, вьшосиавые на защиту

1. Данные о распределении панкреатических сериновых протенназ гидробионтов согласно их активности и физико-химическим свойствам - основа направленного поиска перспективных объектов исследования и выделения ферментных препаратов.

2. Способность к глубокой деструкции коллагена сериновыми протеиназами рыб и ракообразных принципиальный отличительный признак субстратной специфич-иости этих ферментов.

3. Гидролиз коллагена в присутствии экзогенных сериновых протенназ включает по крайней мере двз стадии: а) инициация и распад трехцепочечной молекулы коллагена, б) гидролиз до низкомолсхуляриых компонентов. Гидролиз коллагена может быть осуществлен с низкой скоростью при введении реагентов - доноров дисульфид-ных связей при отсутствии экзогенных ферментов.

4. На регуляцию процесса коллагенолнза оказывают влияние ингибиторы металло-зависимых протенназ, ингибиторы сериновых протенназ, реагенты - доноры днсуль-фидных связей, в число которых входят те же сериноаые протенназы и бЪлкогые ингибиторы. В присутствии последних процесс принимает обратимый характер, зависящий от концентрации ингибитора.

5. Анионные трипсины (гидробионтов) характеризуются высокой эффективностью гидролиза эфирных и нитроанилидных субстратов, увеличением ігуклеофильности активного центра в щелочной зоне рН, повышенной гидрофобностью субстрат-связывающих участков и снижением селективности взаимодействия с растворимыми и иммобилизованными лигандами, специфичными для химотрипсигіа.

6. Аффинные сорбенты, содержащие ГМДА в качестве лиганда или пространственной группы, обеспечивают селективное связывание и высокую степень очистки анионных трипсинов к химотрипсииов. Ионнс-адсорбционная и ориентированная иммобилизация ферментов эффективны для получения препаратов с повышенной терме- и кислоторезистентностью.

7. Панкреатические серииовые протеиназы гидробионтов - перспективные лекарственные и технические препараты для использования в медицине, сельском хозяйстве, пищевой промышленности и других отраслях.

Публикации и апробация работы. Основное содержание работы изложено в 51 публикации, из которых 5 представляют собой авторские свидетельства на изобретения, 6 - патенты Российской Федерации.

Результаты работы были представлены на 5-ом Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 1986); 1-ом Всесоюзном симпозиуме «Препаративная хроматография физиологически активных веществ на полимерных сорбентах» (Ленинград, октябрь 1988); Всесоюзном совещании «БАВ при комплексной утилизации гидробионтов» (Владивосток, ТИНРО, май 1988); Всесоюзной конференции «Методы получения, анализа и применения ферментов» (Рига, НПО «БИОЛАР» декабрь 1990); Всесоюзном совещании «БАВ гидробионтов - новые лекарственные, лечебно-профилактические и технические препараты» (Владивосток, сентябрь 1991); Международной конференции «Технология переработки гидробионтов» (Москва, ВНИРО, 1994); научной конференции «Рыбохозяйственное исследование океана» (Владивосток, Далърыбвтуз, 1996); Конгрессе «Поиск н создание лекарственных средств» (Москва, 1996); Втором биохимическом съезде (Москва, 1997), 2-ой дальневосточной региональной конференции с Всероссийским участием «Новые медицинские технологии на Дальнем Востоке», Владивосток, 1998 г. Структура и объем диссертации. Диссертация включает следующие разделы: введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты работы и их обсуждение, изложенные в б-ти главах, заключение и выводы. Список использованной литературы включает 422 наименования. Работа изложена на 307 страницах печатного текста, иллюстрированного 36 рисунками и 67 таблицами.