Введение к работе
Актуальность темы. Основные представления с принципах функционирования Na-насоса в плазматических мембранах сложились в основном в результате изучения характеристик активного транспорта натрия в безъядерных эритроцитах человека. Эритроциты млекопитающих до сих пор являются одним из главных объектов исследования механизмов функционирования и регуляции Ка-насоса, молекулярным субстратом которого является На.К-АТФаза.
Давно известно, что активность и свойства транспортных АТФаз плазматических мембран в'(8начительной степени определяются свойствами ее липидного матрикса, в который погружены молекулы ферментов (Болдырез, Мельгунов, 1985). Исследования последних лет показали, что работа Na-насоса тесно связана и с анион-транспортирующей системой (Fossel, Solomon, 1985; Janoshazl, Solomon, 1989), а такте с белковыми компонентами мембраны, принимающими участие в образовании мембранного скелета (Казен-нов, Маслова, 1990; Bennett, 1990). Кроме того, интенсивно развиваются представления о регуляции работы Ма.К-АТФазы эндогенными модуляторами , как внеклеточными (Goto et al., 1992), так и внутриклеточными (Yin?st, 1988).
В последнее время показаны количественные и качественные отличия в системах активного транспорта одно- и двухвалентных катионов в эритроцитах разных видов млекопитающих (Willis et al., 1992; Mllanlck, 1992).Однако причины этих различий и их связь с особенностями функционирования эритроцитов как высо-коспеци&чизированных клеток остаются не вполне Понятными.
Е связи с вышесказанным представляет несомненный интерес изучение активности и свойств транспортных АТФав. а также механизмов регуляции их активности в сравнительном плане в эритроцитах разных представителей млекопитающих, отличающихся по активности транспортных АТФаз и внутриклеточному соотношению одновалентных катионов.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы явилось изучение особенностей регуляции активности транспортных АТФаэ эритроцитов ряда млекопитающих. Для достижения этой цели были пос-
- 4 -тавлены следующие задачи:
изучить фосфолипидный. жирнокислотный и полипептидный состав мембран эритроцитов некоторых видов млекопитающих;
определить активность транспортных АТФаз в целых эритроцитах этих видов животных и сопоставить полученные данные с данными по активности этих ферментов в мембранных препаратах (тенях) эритроцитов этих животных;
провести сравнительное определение активности транспортных АТФаз;в мембранных препаратах эритроцитов этих видов млекопитающих с различным полипептидным составом;
исследовать влияние внутриклеточных модуляторов на активность транспортных АТФаз различных мембранных препаратов эритроцитов ряда млекопитающих в отсутствие и присутствии Са++.
Научная новизна. Впервые в сравнительном плане у нескольких видов грызунов и кролика проведено одновременное изучение активности Na.K-АТФазы и Са-АТФазы, а также фосфолипидного, жир-нокислотного и полипепткдного состава мембран эритроцитов.
Обнаружены существенные различия в активности транспортных АТФаз в целых эритроцитах исследованных кивотных и разная степень ее снижения после удаления внутриклеточного содержимого при получении теней эритроцитов.
Выявленные различия связаны, очевидно, не с особенностями фосфолипидного, жирнокислотного и полипептидного состава эрит-роцитарных мембран,' который мало отличался у исследованных животных, а с наличием внутриэритроцитарной системы внутриклеточных модуляторов активности транспортных АТФаз (Са++-зависимые и Са++-независимые активаторы и ингибиторы), обладающей видоспецифическими особенностями.
Показана необходимость интактности мембранного скелета эритроцитов для оптимального функционирования транспортных АТФаз и передачи модулирующего действия внутриклеточного Са++ на Na.K-АТФазу; действие внутриклеточных активаторов Na.K-АТФазы проявлялось как на фермент теней эритроцитов, так и на фермент мембранных препаратов, лишенных белков мембранного скелета.
Научно-практическая значимость работы. Полученные данные свидетельствуют о том, что уровень активности транспортных АТФаз
-.5-
у разных видов млекопитающих определяется системой внутриклеточных модуляторов ферментов, имеющей характерные для каждого вида свойства.
Результаты проведенного исследования свидетельствуют также о важной роли белков; мембранного скелета эритроцитов в функционировании интегральных мембранных ферментов.
Полученные данные расширяют современные представления о путях регуляции активности транспортных АТФаз млекопитающих в целом, а также поддержания активности этих ферментов в эритроцитах на.уровне, характерном для данного вида, что ваяно в плане понимания механизмов контроля ионного гомеостаза как в отдельных клетках, так и на^уровне целого организма.
Основные положения, выносимые на защиту:
1.Показано, что удельная активность Na.K-АТФазы и Са-АТФ-азы в тенях эритроцитов по сравнению с целыми клетками в несколько раз ниже у мыши, морской свинки и кролика и не отличается у хомячка, что свидетельствует о присутствии в эритроцитах изученных животных (кроме хомячка) активаторов фермента, вымывающихся в процессе получения теней.
2. Наличие внутриэритроцитарного активатора Na.K-АТФазы у мыши и морской свинки подтверждено в прямых опытах, где продемонстрировано Са++-независимое активирование фермента под действием гемолизата в мембранных препаратах.
3.Показано, что последовательное удаление белков мембранного скелета иэ теней эритроцитов приводит к прогрессивному падению удельной активности (в расчете на мл клеток) транспортных АТФаз у всех исследованных животных.
4. Продемонстрировано зависимое от концентрации ингибиро-вание Na.K-АТФазы ионами кальция в целых эритроцитах морской свинки и его отсутствие в мембранных препаратах, свидетельствующее о наличии Са++-зависимого внутриклеточного ингибитора фермента.
Апробация диссертации. Результаты работы докладывались на: заседании Ленинградского отделения Всесоюзного биохимического общества (Ленинград, 1886), II Всесоюзном совещании по эволюционной физиологии (Ленинград, 1987), I Всероссийском съезде общества физиологов (Пущино, 1993), конференции "Современные
- 6 -проблемы энергетики организма" (Ст.-Петербург, 1993).
Публикации. Результаты исследований опубликованы в 2 статьях и 1 тезисах.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, об-8ора литературы, описания методов и результатов исследований, обсуждения полученных данных, заключения и выводов. Библиография включает -і наименований, в том числе на иностранных языках. Работа изложена на страницах машинописного текста, иллюстрирована рисунками и таблицами.