Введение к работе
—. Актуальность темы. Изучение особенностей функционирования аминоацил-тРНК-синтетаз при'высоких температурах и взаимосвязь их с термостаОильностью имеет большое значение для понимания природы и механизмов взаимодействия этих ферментов с субстратами. Одним из основных подходов к исследованию природа термостабильности белков является сравнительное изучение пространственной организации аналогичных ферментов из мезофильных и термофильных источников. Однако известные к настоящему моменту данные, в большинстве своём касаются белков, имеющих небольшие молекулярные веса (^ 100 кДа) и, соответственно, простую олигомерную структуру. Одним из наиболее перспективных методов изучения пространственной структуры является используемый в данной работе метод тритиевой планиграфии, позволяющий изучать доступную поверхность молекулы белка в растворе.
Фенилаланил-тРНК-синтетаза, один из ключевых ферментов биосинтеза белка, имеет сложную олигомерную структуру Ооро-113* Ферментативные свойства и структура активного центра фенилаланил-тРНК-синтетазы из E.coli изучались в течение ряда лет, в то время как фєнилаланил-тРНК-синтетаза из экстремального термофила Thermus thermophllus, живущего при 75С, была выделена и охарактеризована лишь недавно (Ankilova et al., 1988). Для фермента из Thermus thermophllus получены кристаллы, пригодные для изучения методом рент-геноструктурного анализа, в то время как'попытки получения кристаллов фенилаланил-тРНК-синтетазы из E.coli не увенчались успехом. В этой связи данная работа имеет принципиальное значение и как один из немногих способов исследования пространственной структуры фермента из E.coli и сравнения её со структурой термофильного фермента.
Цель работы. Настоящая работа посвящена соавнительному исследованию олигомерной структуры и доступных поверхностей фенилаланил-тРНК-синтетаз из E.coli и Thermus thermophllus, а также изучению взаимосвязи термостабильности и особенностей функционирования этих ферментов.
Научная новизна. Впервые исследована взаимосвязь термо-
стабильности, структуры и функции для сложных гетероолиго-мерных ферментов а?(39-типа. На основании полученных результатов предлагается пространственная модель укладки субъеди-ниц и механизм олигомеризации фенилаланил-тРНК-синтетаз из E.coll и Thermus thermopnllus. Выявлено, что при переходе от мезофильного фермента к термофильному термостабилизация пространственной структуры достигается путбм повышения содержания гидрофобных остатков, в основном засчбт Phe и Pro, возрастания доли экспонированных на поверхности белковой глобулы заряженных остатков (Asx и Arg), упрочения межсубъединич-ных контактов. Впервые изучены особенности функционирования фенилаланил-тРНК-синтетаз из E.coll и Thermus thermophilus при повышенных температурах.
Практическая ценность. Развитые в работе подходы для изучения олигомерной структуры могут быть применены для исследования других гетероолигомерных ферментов. Разработанная методика обработки данных, полученных методом тритиевой пла-ниграфии, позволяет использовать его для сравнения доступных поверхностей различных белков. Понимание основных закономерностей взаимосвязи структуры, термостабильности и функции олигомерных ферментов1 открывает возможность решения многих задач биотехнологии.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались на 13-м Международном рабочем совещании по тРНК (Ванкувер, 1989), Международном симпозиуме "Молекулярная организация биологических структур" (Москва, 1?89), Советско-шведском семинаре "Современные методы разделения и ха-рактеризации белков и пептидов" (Новосибирск, 1989), Всесоюзной конференции "Методы получения, анализа и применения ферментов" (Юрмала, 1990).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 научных работы.
Структура и объём диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, результатов работы и их обсуждения и выводов. Работа изложена на 101 странице, включая 10 таблиц и 16 рисунков. Список цитируемой литературы включает 94 работы.