Введение к работе
Актуальность проблемы. Ни одна из ферментных систем -не ілекает в настоящее время большего внимания исследователей,
оксигеназные комплексы, содержащие цитохром Р-450 (Archakov
,, Bachraanova G.I. 1990, Coon et al., 1992). Цитохром P-450
і объектом интенсивных исследований по двум причинам. Этот
лент, с одной стороны, представляет интерес для
^ментальных исследований в области биологического катализа, а
эугсй - изучение катализируемых цитохрсмоа Р-450 реакций
Зхсдимо для исследований в различных областях Оиологии и
шиш. Около 250000 синтетических соединений являются
знцкальвккя субстрзтс.сі, ингибиторами vua. индукторами
эхроча Р-450 (Guengerioh, 1992). В эту грушу входят
эрственные средства, проканцерогены, антиоксиданти,
зничесісие растворители, красители, пестэглды, спирты, знающие, и ароматизируйте средства. Токсичность этих пилений монет Сыть увеличена или уменьшена в результате слительных реакций, катализируемых цитохромом Р-450. акозлена также -ванная роль цятохрома Р-450 в метаболизме кологически ванных эидогенных соединений: стероидов, жирных лот, простансидов, жирорастворимых витаминов я алкалоидов.
.В настоящее время больное внимание удз*гется изучению екулярной организации и ' принципов еіункнионироваЕия соксигеназных систем печени, содержащих различные изоформы охрома Р-450. Все многообразие изоформ цнтохрома Р-450 делено на семейства (Nebei-t et al., 1989), два из которых дсгзвляют особый интерес. Это семейства цггогромов Р-450, уцируег.т полициклическими ароматическими углеводородами - IA вноб&рбиталом - 2В. семейство цитохромэв P450IA ответственно
за активацта химических соединений и превращает их в токсические продукты, а семейство цитохрошв' Р4502В, наоборот, направляет метаболизм химических веществ в CTOpoziy образования неактивных продуктов и детоксЕкацяи (Ioanniues, їатке, 1990). їїитохромн Р-450, принадлекащю к этим семействам, различаются по механизму индукции, субстратаой специфичности, по иммунологическим и физико-химическим свойствам. Наиболее известными представителями этих семейств являются цитохромы Р450ІА2 и 2В4 кроликов, индуцируемые соответственно 3-метилхолантреном и фенобарбиталом. Сравнительный анапкз первичных последовательностей этих изофэрм цитохрома Р-450 выявил очень низкую степень гомологии мзаду ними, отличия в профиля гидрофобности, структуре и организации мембранных доменов.
Для изучения принципов функционирования мякросоыгльных монооксигеназннх систем, роли и свойств отдельных компонентов эффективно используется метод реконструкции. {.{икросомальше монооксигеназныо системы печени могут быть реконструированы в растворе из изолированных цитохрома Р-450 и iJADPH-флавопротеина в присутствии фосфохазидов или детергентов (bu, West, 1978, Bosterling, Trudell, 1982). Функционирование цитохрома Р4502В4 хорошо изучено как в цротеолипосомальных системах, тек и в реконструированных системах с детергентом (Bean, Gray, 1982, Wagner, Gray, 18). Более того,- удалось реконструировать монооксигеяазную систему, состоящую из мономеров цитохрома Р4502В4 и навш-ФП в присутствии исконного детергента эмульгена 913 (Bachmanova et al.,1986). Представитель другого семейства -цитохром P450IA2 - в реконструированных системах с детергентом использовался гораздо реже. Поэтому представляло интерес изучение поведения данной изоформы цитохрома Р-450 в реконструированной системе с эмульгевш 913 и сравнение свойств этой системы с
[алогичной, содержащей цитохром Р4502В4.
Цель и. задачи исследования. Целью настояиего исследования илась реконструкция микросомальной моноокснгеназной системы чени в растворе из очищенных изолированных NABPH-ФП и цитохрома 50IA2 в присутствии эмульгена 913 и сравнительное исследование конструированных шнооксигеназных систем, содержащих цитохромы 50IA2 и 2В4.
Были поставлены следующие задачи исследования: Изучить влияние эмульгена 913 на 0-деэтилазную активность :тохрома P450IA2 в гидроперекись кумила- и NADPH-зависимых :стемах.
Определить молекулярные массы цитохрома P450IA2 в присутствии, зличных концентраций эмульгена 913.
Исследовать связывание цитохрома . P450IA2 с
этоксирезоруфином, цитохрсшм Ъ5 И UiDPH-ФЇІ. Определить кинетические параметры дитионит- и NADPH-зависимого ссгановления цитохрома Р450ІД2.
Провести сравнительный анализ исследсвалных параметров двух конструированных в присутствии эмульгена 913 монооксигеназных стем, содержащих цитохрош P450IA2 и 2В4.
Научная повизня и практическая значимость работы.
В результате проведенных исследований впервые конструированы в присутствии эмульгена 913 монооксигеназные стемы, содержащие цитохром P45QIA2 и kadph-ФП. Изучено влияние ульгена 913 на гидроксилазкуы активность цитохрома P450IA2 и о агрегатное состояние; Измерены константы, диссоциации гяшекссв этого гемспротеина с субстратом 7-эгоксирезоруфином, пгя-ФП и цитохроком Ь5. Исследованы процессы дитионит- и ОРН-завксимого восстановления цитохрома Р450В2.
Впервые предпринято попытка провг-сти сравнительный: знализ
реконструированных монооксигеназных систем, содераащиг цитохро P450LA2 и 2В4. Показало/ что' максимальной активностью КіііРН-зависиьшх'гидроксилазвш: и рсдуктазЕЫх реакциях облада. пента- и гексакеры этих гемопротеинов. Мономеры цитохрої Р450ІЛ2, образующиеся яри концентрации эмульгена 913 в ' большей, тем мономеры 2В4, были неактивны в NADPH-зависюж гидроксилазной реакции. Две изоформы цитохрома Р-450 отличали» но сродству к субстратам и редокс-партнерам. Выявлен такав pi отличий кинетических параметров реакций: дитионит-ttADFH-зависимого восстановления цитохромов P45QIA2 и 2В4.
Апробация диссертации состоялась на совместной научнс
конференции лабораторий физико-химических методов анализа
микросомального окисления, использования вычислительной техники
биохимии Института биологической и" медицинской. химии РДЫЬ
кафедры биохимии НБФ и ПНШГ экологии, токсикологии и метаболизм
лекарственных препаратов РГМУ им. Н.И.Пирогова. Результат
исследований докладывались на Всесоюзной конференции "Цитохрс
Р-450 и модификация макромолекул" (Ялта, 1989), на 7-о
Международной конференции'"Цитохром Р-450: Биохимия и Биофизика
(Москва, 1991) и на 9-ом Международном "симпозиуме по микросомам
окислению лекарств (Иерусалим, 1992). .-
Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатны работ.
Объем и структура работы. Диссертация излолена на 12' страницах, включая 18 рисунков и 10 таблиц, и состоит и: введения, обзора литературы, описания использованных материалов і методов, результатов и обсуждения собственных исследований заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающей 169 ссылок.