Введение к работе
Актуальность темы. Одной из первых отраслей сельского хозяйства, перешедших на промышленную основу, является птицеводство. Промышленная технология все более отдаляет птицу от естественных условий обитания, что способствует снижению резистентности и возникновению заболеваний инфекционного и неинфекционного .характера. В последние годы проводятся исследования по изысканию биологически активных препаратов, стимулирущих естественную резистентность сельскохозяйственно* птицы. Важная роль в этом отводится аминокислотам и биологически активним'веществам пептидной природы.
В связи с этим разработаны различные амивокиелотно-пептидные препараты, получаемый гидролизом'крови человека и животных (И.Р.Петров, І.Г. Богомолова, З.А. Чашшгина, 1954; П.Е. Калмыков, Т.Й.Го-лубев, 1956; НЛ. Сйвакова, 1981).
Эти препараты предназначены в первуй очередь для использования в медицинской практике,'а объем их изготовления для ветеринарии незначителен.
До настоящего времена не бшга разработана прошдагенная технология получения аминокислотно-пептЕДного препарата в сухой форме, пригодная для использования в птицеводстве.
Первые испытания действия алотнокйслотно-пептиддах препаратов на птицу, проведенные в эксперименте, показали положительное их влияние на прирост живой массы, яйценоскость и другие показатели продуктивности (Л.С. Колабская, 1987; К.К. Мовсум-Заде, В.А. Берестов, 1989).
В последние годы накоплен значительный материал, отражающий действие отдельных аминокислот на иммунитет. Показано, что при ферментативном гидролизе.белков образуются пептида, обладающие иммунобиологическим действием (Г.А. Белокрылов с соавг., 1985, 1989;
- Z -
2.Я. Стан и др., 1988; P. JoXles et al. ,1984).
Действие аминокислотно-пептидных препаратов на иммунитет изучено слабо, что является серьезным препятствием для более дифференцированного и целенаправленного их применения.
Цель.к задачи исследований. Целью наших исследований было создание аккнокисдстно-пептидного препарата для птицеводства в сухой форме и изучение его иммунобиологического действия.
Для этого необходимо было решить следующие задачи:
изучить биологическую полноценность сырья и определить оптимальные условия его гидролиза, обеспечивающие максимальный выход активных компонентов;
разработать технологи» получения препарата б сухой форме;
определить его биохимические свойства и предложить методы контроля;
изучить действие препарата на показатели естественной резистентности и иммунологической реактивности;
провести испытания влияния препарата на жизнеспособность и продуктивность птицы и разработать нормативно-техническую документацию.
Научная новизна. Разработаны оптимальные параметры гидролиза: теаиература, рН, гидромодуль суспензии, концентрация ферментного материала и экспозиция, позволяющие использовать поджелудочную железу кур,с двенадцатиперстной кишкой и химусом, кутикулу мышечных желудков, железистые желудки птиц в качестве ферментного материала для получения препарата с высоким содержанием свободных аминокислот и низкомолекулярных пептидов.
Определены способы высушивания: распыление, контактная сушка, обезвоживание в кипящем слое с напылением на комбикорм, приемлемые для получения аминокислотно-пелтидного препарата в сухой форме и впервые проведена их сравнительная оценка.
Показано, что в сухом препарате содержится 18 аминокислот, в том числе все незаметшае для птицы, преимущественно низкомолекудлр-ные пептиды с молекулярной массой от 500 до 1000 Д, причем э их составе обнаружено Еысокое содержание яммуноаятивных аминокислот, таких как глуташновая, аспарагиновая, аланин и валин.
Предложен способ применения препарата, обеспечивавший повышение неспецифической резистентности цыплят з течение первого месяца яизни, когда резистентность птицы находится на низком уровне.
Впервые показано, что акинокислотно-пептидныи препарат, полученный путем гидролиза белкоз крови птицы, обладает стимулирующим действием на гуморальний и клеточнкй иммунитет.
Практическоеjзначение работы. Разработана промышленная технология получения из отходов убойных цехов птицефабрик аминокислотно-пептидного препарата в сухой форме, повкшакщэго сохранность и продуктивность сельскохозяйственной птицы.
Модифицирован метод определения суммарного содержания пептидов ' з биопрепаратах, который может использоваться как метод их контроля.
На основании результатов исследований разработана и утверждена. Главным управлением ветеринарии и БПН0 "Союзятицепром" нормативно-техническая документация на препарат "Азиамин сухой", включавшая:
технические условия (на опытную партия) - 10.07.116-91;
временную инструкцию по изготовлению и контролю;
временное наставление по применения.
По предложенной технологии пол^^ена СЕИдетельства на рационализаторские предложения № 179 от 29 ноября 1990" г. и 3 2 от 27 декабря 1990 г.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работа доложены на X, 21 и Ш научных конференциях молодых учених ВП-ІКй ?етпрепаратоз (І9Є8-І990); на Всесоюзном симпозиуме "Биохимия сель* саохозяйственных низотных и Продовольственная программа" (Киев,1959);
.-4-
на республиканской научно-производственной конференции "Профилактика и мера борьбы с болезнями молодняка сельскохозяйственных животных (Витебск, 1950); на научно~пронзводственной_конференции молодых ученых и специалистов "Взтвранарше проблемы итицэводстза" (Ленинград-Ломоносов, 1990}; на Всесоюзной научной конференции "Совершенствование методов государственного контроля ветеринарных препаратов" (Москва, 1991).
Публикации. По теме диссертации опудаковано 9 печатных работ.
Объем я структура, диссертации. Диссертация изложена на ПО страницах машинописного, текста, вкдочаат введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, выводы и практические предложения. Работа шншетрзрована 20 таблицами а К рисунками. Список литературы содержит 218 источников, в там числе 85 - иностранных. Приложение на 23 страницах.
совстбеше иссздшщка
Материалу и матовн. Исходна? саръвы для получения ашизокислот-но-пептидного препарата елунизга- кровь комически здоровой птица или сгустки крови - эратроцитарная масса (SI), остающаяся после использования сиворотки для производства прапзрата. "Апиглабулин неспеци-фическяй".
В качестве ферментного материала использовали поджелудочную келэзу кур с 12-перстаой кхішкой и химусом, кутикулу мышечных желудков и ткани яадэаистызс кэлудаоэ yjp.
Перед гидролизов сырье подвергали измельчению на электрической мясорубке JQM-500 н гомогенизации в деструкторе-измельчителе тканей АЛГ-0,1.
Васузшааняе препарата осуществляли на распылительных сушилках гп,1анор" .фирмы "Нзгро-Атомайзер" (Дания), СРФ-2,5 и ПВ2-0,2-РДб,5-2ССЖ-23 (СССР); дзухвадыювой атмосферной сушилке СДА.-250; сушиль-
,-5-
ном аппарате кипящего слоя с напылением на комбикорм, разработанном в НВЦ "Аналаб".
Физино-химические свойства r-идролизатов и сухого препарата оценивали следующими иеговами: рН, общий, остаточный'и аминный азот-по ГОСТ 13805-76; остаточную влажность - по ГОСТ 240-61-89 (в сухом препарате); углеводы - методом с тимол-серным реактивом по Schmor (1955); нуклеотиды - епектрофогомегрически по А.С. Спирину (1958);' общие липиды - по методу Zollaer (1962);.триптофан - методом Horn (1945);. суммарные пептиды - методом с биуретовкм реактивом согласно ГОСТ 13805-76 в нашей модификации.
Отделение свободных аминокислот от пептидов проводили лигандо-обменной хроматографией на Cu-сефадекее G-Z5 (Т.А. Телегина, Т.Е. Павловская, 1975).
Анализ фракционного состава.пептидов в. гидрояиз&тах и сухом препарате осуществляли мэтодом гель-фильтрации га- сефадексе G-I5.
Содержание свободных аминокислот и аминокислотный состав пептидов препарата определяли ионообменной хроматографией на автоматическом анализаторе аминокислот KlA-5 фирмы "HitacMtgEpmra). При этом пептиды предварительно гидролизовади по методу Eendes end Lai (1975).
Определение наличия патбгенных микроорганизмов в сухом препарате проводили согласно ГОСТ 25311-82.
Испытание препарата на безвредность осуществляла по общепринятой методике.
Исследования по выбору оптимальных доз и схем применения пре- парата, а также изучения его влияния на естественную резистентность птицы проводили на цыплятах яичного направления, (моїоднах) кроссв-"Беларусь-9" и цыплятах-бройлерах кросса "Бройлер-б" при клеточном содержании в условиях вивария и на Константиновской птицефабрике Томилинского ИБО Московской области.
- б -
Для контроля влияния препарата на состояние естественной резистентности птицы, в сыворогкё крови цыплят изучали возрастную динамику следующих показателей: бактерицидной активности - по методу О .Б. Смирновой к Т.А. Кузькиной (1966); литической активности лизоцима - по В.Г. Дорофейчук в модификации ВНИЗЙП (1980); активности в -лизина - по методу 0-Е. Бухарина, Б.А. Фролова, АЛ. Луда . (1972); активности комплемента - колориметрическим методом no А.В. ГУставу е модификации ВНИВИСІ (1980); активности АсАТ и АлАТ - спек-трофзтомегрическим методом на анализаторе акїивности ферментов системы Та фирмы "Bectaian" (США); общего белка - методом Lowry (1953); содержания гамма-глобулинов — методом электрофореза на пленках ацетата целлюлозы; содержания igG- по. методу Манчини в модификации ВНИВИП (1980). Гемоглобин определяли в крови цыплят г-евдглобин-ци-анидннм методом.
Влияние препарата на гуморальное звено иммунитета оценяваки на модели иммунного ответа мышей на гетерологичные эритроциты. Иммунный ответ оценивали по количеству антителообразующих клеток (AQK) в селезенке мыши на 5-не Сутки после иммунизации методом локального гемолиза в модификации CaaaiHgham . (1965) и титру антител к эритроцитам барана в сыворотке крови мыши на 7-ые сутки после иммунизации в микротесге гемагтлюгинаций.
Влияние препарата на гуморальный иммунитет цыплят оценивали на примере напряженности иммунитета птицы к вирусу болезни Ньюкасла в реакции задержки темагглютинации (КЗГА).
Для изучения действия-препарата на клеточное звено иммунитета, использовали модельные системы, дающие представление о функциональной активности лимфоцитов Т-ряда - реакцию гиперчувствительтосги замедленного типа (ГЗГ) ( У..Thong, А.РеггапіеД980) и реакцию "трансплантат против хозяина." . (НИХ) ( E.E.Emerson, D.P.Trureh,i973). f
Оценку влияния препарата на жизнеспособность и продуктивность сельскохозяйственной птицы проводила на Томилинском и Щелковском ППО.ШПЗ "Большевик", Няндомской и Банкирской птицефабриках Птицепрома РСФСР.
Статистическую обработку полученных результатов проводили по методу Стыодента с учетом рекомендаций И.П. Ашмарина с соавт.{1971}, Г.Ф. Лакина $990) и XI издания Государственной Фармакопеи СССР.